Post on 22-Apr-2015
Enzimologia
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
A vida e a energia para a vida• Duas condições fundamentais:
1. Autorreplicação2. Metabolismo
• Catálise enzimática
• A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos
• Um saco de açúcar pode permane-cer anos na prateleira do supermercado– A prateleira não tem enzimas!
• Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos– Reações catalíticas promovem a oxidação
da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia
Participam das vias bioquímicas
• Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular
• O metabolismo energético é um dos principais temas de estudo da bioquímica
• Permitem resposta e adaptação a ummeio em mudança
O que são as enzimas?• Proteínas notáveis, altamente especializadas
– Alto grau de especificidade com substratos• Poder catalítico extraordinário
– Muito maior do que catalisadores sintéticos• Aceleram reações químicas
– Em condições suaves de temperatura e pH• São o centro e o objeto de estudo principal da
bioquímica– Atuando de forma organizada catalisam
centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias
• Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem
• Como os cientistas descobriram as enzimas?
LOUIS PASTEUR
1835: Berzelius, conceito de catálise 1885: fermentação do acúcar por lêvedos,
gerando álcool
Vitalismo: o mágico élan vital 1896: Edward Buchner consegue fermentar o açúcar num
extrato de lêvedo sem vida!
Fermentos, portanto, catalisavam reações químicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores
Enzima vem do grego εν ζυμη, cuja tradução é “no lêvedo”
Louis Pasteur1822-1895
Um pouco de história...
EMIL FISCHER
Sacarase Quebra da sacarose em glicose e frutose
Produziu diversos análogos de sacarose para testar se a enzima funcionava
Determinadas mutações tornavam os análogos resistentes à sacarase
Modelo de ação enzimática chave-e-fechadura
Hermann Emil Fischer1852 - 1919
Enzimas são proteínas?
Qual a natureza das enzimas? O químico orgânico alemão Richard
Willstätter (1872–1942) – ganhador do Nobel pela estrutura da clorofila – conseguiu separar o componente enzimático de um preparado biológico e não encontrou nenhuma proteína!
1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimas são proteínas! Willstater criticou os resultados…
James Batcheller Sumner1887-1955
SIM! Mas como funcionam?
Kunitz e Northrop Eletroforese e centrifugação: enzimas
estão na fração protéica! Mesmo em quantidades proteícas
indetectáveis pelos métodos, as enzimas continuavam tendo atividades
Como as milhares de reações catalíticas eram possíveis a uma proteína?
John Howard Northrop1891-1987
Finalmente, Sanger
1952 Publica a primeira estrutura primária
de uma proteína: a Insulina, com 51aminoácidos
O trabalho mostrava também que a estrutura das proteínas poderia serdescrita pela sua sequência de aminoácidos, do N ao C terminal
A sequência, entretanto, não ajudava a prever a função da proteína (antes da bioinformática)
Frederick Sanger13 August 1918
CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA
As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras
Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia!
As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos
A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações não-covalentes a partir de uma série de aminoácidos ligados covalentemente (ligação peptídica)
>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Toda enzima é proteína?!• Não!, há alguns RNAs que
funcionam enquanto enzimas também
• Componente químico adicional necessário para a função– Cofator: íons inorgânicos– Coenzima: moléculas orgânicas
complexas– Se liga muito firmemente: grupo
prostético
• Enzima completa: holoenzima– Parte protéica: apoenzima ou
apoproteína
Nomenclaturase das enzimases• Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do
substrato ou à atividade realizada– Urease – hidrolisa a uréia– DNA-polimerase – polimeriza DNA– Pepsina – pepsis vem do grego (digestão)
• Sistema de classificaçãoenzimático – EC number– Quatro números: 2.7.1.1
• 2: transferase• 7: fosfotransferase• 1: transfere P para grupo OH-
• 1: tem D-glicose com aceptor
Reação enzimática
• Reação se dá em fases: • Enzima aumenta a velocidade das reações• Os catalisadores aumentam a velocidade das
reações por que diminuem a energia de ativação
Equilíbrio químico• As enzimas realizam, muitas
vezes, as reações nos dois sentidos
• A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações
• Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato– Interações fracas entre ES são
otimizadas no estado de transição
Bastonase• Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato
• ET não é forma estável
• Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática
• Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes
Estabiliza o substrato
Especificidade enzimática
• Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico
• Redução da entropia pela ligação– Dessolvatação do substrato– Ajuste induzido, proteína
tbm muda de conformação
Grupos catalíticos
• Catálise geral ácido-base– Transferência de prótons
• Catálise covalente– Formação de lig. covalente
transitória entre E e S• Ativação do substrato
• Catálise por íons metálicos– Estabilizam estados de transição– 1/3 das enzimas conhecidas usam íons
metálicos nas reações catalíticas
• Enzimas muitas vezes usam as três estratégias de catálise em conjunto -- quimiotripsina
Cinética enzimática• Experimentos de mutagênese sítio-
dirigida permite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica
• A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas
• Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato
• Constante de Michaelis– kM = [S] correspondente a ½ Vmax;
Reações com 2 ou mais substratos
• Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma-depois-da-outra
• Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH– Maior velocidade está
normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua
Inibição reversível
• Inibição competitiva– Inibidor compete pela ligação ao sítio
ativo
• A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta
• Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima– Podem ser usados como drogas
Exemplos de reações enzimáticas
• Quimiotripsina• Lisozima
• Hexocinase• Enolase
• Beta-lactamases• Proteases do HIV
A quimiotripsina
• Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr)
• Forma intermediário acil-enzima covalente
A hexocinase
• Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato• Fosforila um resíduo de glicose
• Primeiro passo da via glicolítica• Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que
ela fosforile a água
A enolase• Realiza desidratação reversível
de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato– Dímero com 436aa
• Catálise geral ácido base + estabilização do estado de transição– Interações estabilizam
intermediário (enolato)– Ligações de H com outros aa’s do
sítio ativo contribuem para o mecanismo geral
A lisozima• Agente antibacteriano
natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo– Peptideoglicano da
parede de bactérias é seu substrato• Constituinte da parede
microbiana que protege da lise osmótica
– Enzima rompe ligação glicosídica
• Monômero com 129 aa’s• Mecanismo específico
de ação enzimática ainda é controverso
“mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. Albert Einstein
Medicamentos• Muitos são inibidores de enzimas são
usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS
• Penicilina (Alexander Fleming, 1928)– Peptideoglicano: polímero de açúcares
e D-aa’s da parede bacteriana– Penicilina interfere na síntese do
peptideo glicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala
– Inibem reação de transpeptidase
Os Beta-lactâmicos• Penicilina: degradada no
ambiente do estômago• Penicilina V: estável em meio
ácido pode ser administrada em via oral
• Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito
• O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível– Transpeptidase inativa!– Bloqueia síntese da parede bacteriana
• Rompe-se devido à pressão osmótica
As Beta-lactamases
• Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas
• Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva– O mau uso dos antibióticos
Guerra contra as bactérias
• Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases
• Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico
• Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico...
• Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento
Os antivirais: (1) o que é um vírus?
• Anatomia molecular viral– Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de
proteínas (capsídeo)– Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou
dupla (fita positiva ou negativa)
• Genomas compactos– Contêm apenas as proteínas
necessárias à replicação viral– Genomas da ordem de Kb
Parasitismo intra-celular
• O vírus não tem metabolismo próprio– Não é um organismo de vida-livre– Parasita intra-celular obrigatório
• Forma de cristal• Sequestra a maquinaria molecular da célula– Mecanismo moleculares de
produção preferencial dos genes virais (fator sigma próprio e específico)
Variedades virais
• Vírus de DNA– Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente
transcritos em RNA
• Vírus de RNA– Podem atuar no citoplasma
• Vírus de RNA com transcrição reversa– Acontece a transcrição reversa do RNA
em DNA e o DNA é normalmente integrado ao genoma do hospedeiro
HIV
• SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana– Pandemia– Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos
• Retrovírus (lentivirus)– 2 cópias de um RNA fita simples (fita +)– Nove genes– Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas p24
• 0,6% da população humana está infectada
AZT (azidotimidina)
• Mimetiza um nucleotídeo de timina– Azida no lugar de hidroxila
• Prejudica a ação da transcriptase reversa• Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que,
aos poucos o vírus se torne resistente
Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT
Outros tratamentos• Inibidores de protease
– Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros
• Inibidores de integrase– Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro
• Inibidores de fusão– Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam
receptores celulares de ligação ao HIV
• Coquetel anti-AIDS– dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de
ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue
Proteases do HIV• O RNA do vírus é traduzido em grandes
proteínas– Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em
proteínas individuais do capsídeo
• A protease do HIV é uma aspartil-protease– 2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à
ligação peptídica
Inibidores de proteases• Drogas que formam complexos não-covalentes
com a protease do HIV– Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis
• Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil– Grupo hidroxil mimetiza a água– Resto da estrutura encaixa nas fendas da
enzima
• Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição– Sucesso terapêutico– Aumentou longevidade e qualidade de vida dos
doentes
Enzimas regulatórias• Possui atividade catalítica aumentada
ou diminuída em resposta a certos sinais– Ajustes na velocidade da via
metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação
• Tipos mais comuns– Enzimas alostéricas (ligações
reversíveis a compostos)– Modificações covalentes– Ativadas por remoção de segmentos
peptídicos (irreversível)
• Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica
Enzimas alostéricas• Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato
(hemoglobina)• Heterotrópicas: outro ativador
• Enzimas alostéricas– Mais de um sítio regulatório
• Cada um específico para um regulador• Aspartato-transcarbamoilase– 12 cadeias polipeptídicas– Azul: catalíticas– Vermelho/Amarelo: regulatórias
Enzimas alostéricas são reguladoras
• ... de vias bioquímicas• Normalmente são o primeiro passo da
via– “economiza” a execução das outras
reações– Único passo de regulação da via
• Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo
• Inibição alostérica heterotrópica
Regulação por modificações covalentes
• 500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos
• Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo– Ubiquitinilação marca proteína para degradação– Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares
• Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima
• Fosforilação é a mudança mais comum– Podem haver vários sítios fosforiláveis
Proteínas cinases e fosfatases• Cinases: adicionam grupo fosforil
a resíduos de Ser, Thr ou Tyr– Básicas: fosforilam resíduos
de vizinhança básica– Preferências por resíduos
próximos a Pro
• Atómos de O2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína– Reestabiliza a proteína
estruturalmente
• Atuam em cascatas de sinalização celular
Cinases sítio-específicas
• Fosforilações são sítio-específicas
• Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e fosforila resíduos de S, T ou Y
• Sítio de reconhecimento
• Sítio de fosforilação
Fosforilações múltiplas• São possíveis e
permitem controle requintado da regulação
• Glicogênio sintase– Catalisa a união de
glicoses para formar glicogênio
– Fosforila em vários sítios (ver figura)
Proteólise de precursores• Proteases não podem ser
produzidas em estado ativo– Do contrário destruiriam as
proteínas celulares...• Zimogênios são precursores
das proteínases– Só funcionam depois da
ativação por proteínas – Ativação irreversível
• Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró-enzimas
Conclusões
• A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas
• O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação
• A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva
• Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos
• As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação
• Aula baseadano livro do Lehninger(Nelson e Cox)
• Capítulo 6Enzimas