Eletroforese

Pontifícia Universidade Católica de Goiás

Departamento de Biologia

Prof. Hugo Henrique Pádua M.Sc.

Fundamentos de Biofísica

Eletroforese migração de moléculas ionizadas, deacordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares emcampo elétrico.

Na rotina laboratorial os suportes podem ser:

Gel de agarose

Gel de poliacrilamida

A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas

Introdução a Eletroforese

Técnica de separação de partículas de DNA, RNA ou proteínas, através da aplicação de uma diferença de potencial (corrente elétrica)• as partículas são separadas de acordo com o tamanho (massa)

Introdução a Eletroforese

• Acetato de celulose

• Gel de agarose

• Gel de amido

• Gel de poliacrilamida

• Eletroforese capilar

Introdução a Eletroforese

Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho.

Gel de poliacrilamida Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas

Gel de agarose Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas

grandes

O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólopositivo

Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la

Introdução a Eletroforese

Eletroforese em gel

A amostra é inserida nos “pocinhos”

Uma corrente elétrica é aplicada

Partículas de menor tamanho ou carga mais negativa corre primeiro

Eletroforese em gel

Eletroforese em gel

CORRENTE ELÉTRICA:

A passagem da corrente elétrica através de uma

solução segue a lei de Ohm, na qual:

V = R . I

V = voltagem, R = resistência e I = amperagem

Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob

voltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes.

VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO:

* Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à carga

líquida.

* Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre os

dois eletrodos e à viscosidade.

PROTEÍNAS: corante “coomasie blue”

ENZIMAS: solução específica (substrato,

coenzimas, solução-tampão e sais)

DNA e RNA: vários sistemas de revelação, tais

como:

- Fluorescência (Brometo de Etídio);

- Radioatividade;

- Nitrato de prata;

VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS

Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho.

O ladder é formado por diferentestamanhos de DNA e serve comomarcador de peso molecular

VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS

AGAROSE POLIACRILAMIDA

COMPOSIÇÃOPó matriz AGA(Alga marinha)

Acrilamida (I) + Bisacrilamida (T)

CARACTERÍSTICAS Malha frouxa Malha complexa

OBJETIVO Longos fragmentos Deleção de bases

SOLIDIFICAÇÃO 15 – 20 minutos 24 horas

• Brometo de etídio• Agente intercalante do DNA

• Cancerígeno!

• Composto fluorescente à luz UV

• Nitrato de prata

• Gel Red

Eletroforese em gel

• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha;

• Dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria;

• Mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA

Eletroforese em gel de agarose

• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte

• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter estáveis as condições de pH do meio

Eletroforese em gel de agarose

Visualização do gel de agarose em luz UV

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Eletroforese

Marcadores de peso molecular são usados

para estimar o tamanho das moléculas das

amostras.

Eletroforese em gel

GEL DE AGAROSE

A poliacrilamida também pode ser utilizada com gelpara a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura dedois polímeros, acrilamida e bisacrilamida;

Utilizada para observação de fragmentos menores(poucos pares de bases ou proteínas);

Melhor resolução do que a eletroforese em gel deagarose;

Desvantagem: Neurotóxica

Eletroforese em gel de poliacrilamida

• É realizada em uma cuba de eletroforese vertical.

Eletroforese em gel de poliacrilamida

Eletroforese em gel de poliacrilamida

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• Gel de poliacrilamidaEletroforese em gel de poliacrilamida

GEL DE POLIACRILAMIDA

Gel acrilamida

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Eletroforese: métodos de leitura

Densitometria

Aplicações

• Identificação de pessoas: em testes de

paternidade, comparando o DNA do suposto pai,

da mãe e do filho.

• Na identificação de criminosos.

• Na Industria farmacêutica (vacinas, reagentes

de diagnóstico).

• Na agropecuária (animais e plantas

transgênicos).

• Na rotina:

• Análise do paciente

• Pesquisa genética

• Conduta terapêutica

• Prognóstico

• Aconselhamento

Aplicações

• Tamanho da molécula

• Tipo de molécula

• Concentração

• Conformação do DNA

• Voltagem

• Tampão (TAE, TPE, TBE, PBS, etc)

Fatores determinantes