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_________________________________________ISSN 1983-4209 – Volume 09 – Número 03 – 2013
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EFEITO DE EXTRATOS FOLIARES DE TRÊS ESPÉCIES DE Pouteria (SAPOTACEAE)
SOBRE A GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO DE Lactuca sativa L. E Lycopersicum
esculentum Mill.
Mirta Bicca Condessa1, Ísis Andrade Franco de Carvalho
2, Beatriz Taynara Araújo dos Santos
3,
José Elias de Paula4, Sueli Maria Gomes
5, Dâmaris Silveira
6, Luiz Alberto Simeoni
7.
RESUMO: Os aleloquímicos têm importante papel ecológico e sua identificação é uma etapa na
obtenção de novos herbicidas. Neste sentido, oito extratos brutos de folhas de Pouteria caimito
(Ruiz & Pav.) Radlk., P. ramiflora (Mart.) Radlk., e P. torta (Mart.) Radlk. (Sapotaceae) foram
avaliados por bioensaio de germinação e crescimento, para verificar o potencial alelopático sobre
sementes de alface (Lactuca sativa L.) e tomate (Lycopersicum esculentum Mill.), nas
concentrações de 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg/mL. Foram avaliados os seguintes parâmetros:
germinabilidade (G), tempo médio de germinação (tm) e comprimento da radícula (CR). Foram
propostos pela primeira vez os conceitos de taxa de inibição da germinabilidade (TIG) e de taxa de
inibição do crescimento radicular (TICR). Destacam-se como bastante promissores os extratos
etanólicos de P. caimito e P. ramiflora, por terem tido maiores valores de TIG: respectivamente
76% e 46%, a 4,0 mg/mL e, com exceção da G de L. esculentum frente a P. ramiflora, estes extratos
apresentaram inibição alelopática em todos os parâmetros testados. Todos os demais apresentaram
algum efeito alelopático sobre L. sativa e L. esculentum por meio da inibição da germinação, do
crescimento da radícula, ou de ambos. Os conceitos de TIG e TICR constituem contribuições
inéditas do presente trabalho, mostrando-se úteis em estudos sobre alelopatia por possibilitarem
uma análise direta do efeito inibitório dos extratos sobre a germinabilidade e crescimento da
radícula, respectivamente, e eles comparam os resultados do tratamento e do controle.
Unitermos: alelopatia, aleloquímicos, extrato vegetal, taxa de inibição da germinabilidade, inibição
do crescimento radicular.
EFFECT OF LEAF EXTRACTS OF THREE SPECIES OF Pouteria (SAPOTACEAE) ON
THE GERMINATION AND GROWTH OF Lactuca sativa L. AND Lycopersicum esculentum
Mill.
ABSTRACT: Allelochemicals play important ecological role and their identification can be
considered one of the ways to get new herbicides. In this sense, eight extracts from leaves of
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk., P. ramiflora (Mart.) Radlk. and P. torta (Mart.) Radlk.
(Sapotaceae) were evaluated by germination and growth bioassays, to determine their allelopathic
potential over lettuce (Lactuca sativa L.) and tomato (Lycopersicum esculentum Mill.) seeds at the
concentrations of 0.5, 1.0, 2.0, and 4.0 mg/mL. The germinability (G, given in %), germination time
average (tm) and radicle length (CR) were evaluated. The concepts of germination inhibition rate
(TIG) and of root growth inhibition rate (TICR) were proposed in a first time. It is pointed out that
the ethanol extracts of P. caimito and P. ramiflora are very promising, because they had higher
values of TIG: respectively 76% and 46%, at 4.0 mg/mL and, with exception of G from L.
esculentum tested with P. ramiflora, these extracts showed allelopathic inhibition in all evaluated
parameters. All others showed some allelopathic effect on L. sativa and L. esculentum, through
germination inhibition, radicle growth inhibition, or both. The TIG and TICR concepts are novel
contributions of this work, being useful in studies of allelopathy, because they allow a direct
analysis of the inhibitory effect of extracts on germinability and radicle growth, respectively, and
they compare the treatment and the control results.
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Uniterms: allelopathy, allelochemicals, germination inhibition rate, plant extract, root growth
inhibition.
INTRODUÇÃO
As interações químicas que ocorrem nos ecossistemas têm se apresentado como uma
importante alternativa na busca de fontes de herbicidas disponíveis na própria natureza, mais
específicos e menos prejudiciais ao ambiente (Peres et al., 2004). A ampliação desse conhecimento
para a flora brasileira é de grande importância, devido à megadiversidade florística de nosso país
(Maraschin-Silva e Áquila, 2006). Esta diversidade traduz-se também do ponto de vista químico, já
que diferentes espécies variam em suas respostas aleloquímicas, liberando diversos compostos do
metabolismo secundário no ambiente (Ding et al., 2007; Magiero et al., 2009).
A alelopatia é definida como a interferência positiva ou negativa de substâncias produzidas
por uma planta e pode representar uma alternativa interessante na busca de fitotoxinas naturais com
atividade inibitória ou estimulante sobre outras espécies (Ferreira e Borghetti, 2004). Aleloquímicos
liberados por meio da decomposição de resíduos vegetais podem ter papel importante na
germinação e estabelecimento de sementes individuais, influenciando no padrão da vegetação na
medida em que geram variações químicas no solo (Silva et al., 2006). Tal característica torna-se de
extrema importância em biomas que apresentem alto endemismo como o Cerrado, onde há áreas em
que as estimativas de espécies endêmicas podem ultrapassar 40% (Méio et al., 2003).
Adicionalmente, a identificação de tais espécies pode ser uma estratégia interessante para o
manejo natural e redução do uso de herbicidas, inseticidas e outros produtos artificiais na
agricultura (Mclaughlin et al., 1998; Anaya, 2006).
Diversas espécies que interferem no metabolismo de outras são relatadas na literatura.
Extratos de Rhynchostegium pallidifolium (Mitt.) A. Jaeger mostraram atividade inibitória de
crescimento em monocotiledôneas e dicotiledôneas (Kato-Noguchi et al., 2010b). O extrato
etanólico de Syzygium aromaticum (L.) Merr & Perry (cravo-da-índia), bem como eugenol puro,
diminuíram a geminação e crescimento de diversas sementes (Mazzafera, 2003). O arroz (Oriza
sativum L.) inibe o crescimento de espécies invasoras e de plantas com as quais é cultivado em
consórcio, sendo que os diterpenos momilactona A e momilactona B, isolados do exsudado da raiz,
parecem ser os responsáveis por esta atividade (Kato-Noguchi et al., 2002; Duke et al., 2007).
Testes in vitro mostraram que estes exsudados inibem o crescimento de raízes e brotos de
Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. em concentrações de 0,8-2,2% e 59-82%, respectivamente
(Kato-Noguchi et al., 2010a). Folhas e frutos de Solanum lycocarpum St. Hill. apresentaram
propriedades alelopáticas (inibitórias e estimulantes), que se manifestaram numa ampla faixa de
temperatura (Aires et al., 2005).
O estudo da influência de extratos sobre a germinação e o crescimento de determinadas
espécies-alvo, comumente Lactuca sativa L., também pode ser utilizado para avaliação preliminar
de citotoxicidade (Anderson et al., 1991). Este tipo de abordagem revelou o potencial fitotóxico de
extratos aquosos de folhas frescas e secas de Persea americana Mill., o abacateiro (Borella et al.,
2009); do extrato volátil de Pilocarpus microphyllus Stapf. ex Wardleworth, o jaborandi (Alves et
al., 2004); e de Artemisia annua L., a artemísia (Magiero et al., 2009).
A atividade aleloquímica já foi relatada também para espécies de Pouteria. Espécies desse
gênero são utilizadas para fins medicinais, embora nem todos estes usos tenham sido comprovados,
ou mesmo estudados cientificamente.
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. é usada como antimicrobiano, antimalárico (Pérez,
2002), antioxidante (Silva et al., 2009), com relatada atividade fotoprotetora contra raios UVA e
UVB (Silva et al., 2009). Pouteria torta (Mart.) Radlk. tem sido popularmente usada como
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antidiarreico (Silva et al., 2009) e os constituintes da planta têm comprovada atividade
antimicrobiana (Alves et al., 2000), antifúngica e inseticida (Boleti et al., 2007), toxicidade a larvas
de Artemia salina (Perfeito et al., 2005; Silva et al., 2009), bem como atividades inibitória da α-
amilase (Silva et al., 2009), antimicrobiana (Alves et al., 2000; Silva et al., 2009), fotoprotetora
contra raios UVA e UVB (Silva et al., 2009), atividade frente a receptores nucleares (Silva et al.,
2009) e também inibição da germinação de Lactuca sativa (Nascimento et al., 2007). Pouteria
ramiflora (Mart.) Radlk. tem sido usada no tratamento de verminoses, disenteria, dor e inflamação
(Fontes et al., 2009), com as seguintes atividades biológicas comprovadas: antinociceptiva, anti-
inflamatória (Fontes et al., 2009), antioxidante, toxicidade a larvas de Artemia salina, fotoprotetora
contra raios UVA e UVB e inibitória da α-amilase e da germinação de Lactuca sativa (Silva et al.,
2009) e antimicrobiana (Alves et al., 2000).
Além disso, várias espécies desse gênero são bastante conhecidas por possuírem frutos
comestíveis, que são comercializados in natura ou utilizados na indústria de alimentos (sorvetes,
polpas, geleias e outros).
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. (abiu), P. ramiflora (Mart.) Radlk. (curiola) e P.
torta (Mart.) Radlk. (guaipeva) podem ser encontradas no Cerrado do entorno de Brasília, Distrito
Federal, Brasil. Essas espécies são utilizadas na medicina popular e a P. torta é a mais estudada sob
o ponto de vista químico e de atividades biológicas. Frutos comestíveis grandes, com polpa
abundante, ocorrem em P. caimito e P. torta, contudo somente a primeira é explorada
comercialmente. Do extrato hexânico de folhas de P. caimito foi extraído o espinasterol (Silva et
al., 2009); do extrato benzênico do fruto foram isolados α-amirina, lupeol, eritrodiol e damarenediol
II e do extrato das cascas foram identificados taraxerol, acetato de taraxerol, taraxerona e β-
sistosterol (Pellicciari et al., 1972).
Por meio de estudos sobre a composição química dos extratos hexânico e diclorometanólico
das flores e frutos de P. torta, foram obtidas misturas de ácidos graxos, compostos poli-
isoprenoides, mistura de hidrocarbonetos e triterpenos (David, 1993). Do extrato metanólico dos
ramos foram obtidos os triterpenos acetato de α-amirina, acetato de β-amirina, ácido betulínico e
ácido ursólico (Che et al., 1980); do extrato hexânico das folhas, hidrocarbonetos, acetato de
lupeíla e álcoois de cadeia longa; e também misturas dos triterpenos α- e β-friedelinol e α- e β-
amirina. O flavonoide miricitrina foi obtido da fração acetonitrila: clorofórmio e da fração aquosa
do extrato etanólico (Silva et al., 2009).
Os flavonoides e triterpenos são classes de substâncias muito comuns em Sapotaceae e estão
relacionados a diversas atividades biológicas, sendo anti-inflamatórios, anti-helmínticos,
antitumorais, estrogênicos e inibidores enzimáticos, por exemplo, da transcriptase reversa do HIV
(Silva et al., 2009).
Considerando a importância dos aleloquímicos nos ecossistemas, bem como sua possível
correlação com atividades citotóxicas, o objetivo deste estudo foi investigar as propriedades
alelopáticas de diversos extratos das folhas de Pouteria caimito, P. ramiflora e P. torta na
germinação e crescimento de L. sativa e L. esculentum, visando contribuir para o conhecimento
sobre a atividade biológica dessas espécies.
MATERIAL E MÉTODOS
Folhas de três espécies de Sapotaceae foram coletadas e desidratadas em temperatura
ambiente (25 ºC), tendo as seguintes exsicatas testemunhas: Pouteria caimito - S. M. Gomes
UB27284, P. ramiflora - J. Elias de Paula UB3671, P. torta - J. Elias de Paula UB3674, que estão
depositadas no Herbário da Universidade de Brasília (Herbário UB), Brasília, DF.
Obtenção dos extratos brutos
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Todos os extratos usados foram oriundos do banco de extratos do grupo de pesquisa
“Desenvolvimento e Controle da Qualidade de Fármacos e Medicamentos”, do Laboratório de
Produtos Naturais da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Brasília.
Para a obtenção do extrato bruto hexânico, o material botânico foi pulverizado e submetido à
extração por maceração a frio, por quatro vezes, durante sete dias cada, utilizando primeiramente
hexano como solvente. Após decantação, as soluções extrativas foram concentradas à secura, sob
vácuo, a uma temperatura de aproximadamente 40 °C. Com o material botânico restante, o mesmo
processo foi realizado utilizando etanol 95% como solvente.
Na obtenção do extrato aquoso bruto, a técnica de extração utilizada foi a infusão de acordo
com Silva (2007). Ao material botânico pulverizado foi adicionada água destilada submetida
previamente à ebulição e posterior arrefecimento até 70 °C. A mistura foi mantida em contato até
arrefecimento a 50 °C e filtrada a quente. A solução extrativa obtida foi mantida a -30 oC e
posteriormente submetida a liofilização, sendo os rendimento dos extratos apresentados na Tabela
1.
Tabela 1. Rendimento dos extratos brutos de espécies de Pouteria.
Espécie Nome popular Parte usada Extrato
Rendimento
(%)
Pouteria caimito (Ruiz & Pav.) Radlk. Abiu Folha
Hexânico 2,8
Etanólico 5,6
Aquoso
7,7
Pouteria ramiflora (Mart.) Radlk. Curiola Folha
Hexânico 5,2
Etanólico 18,3
Aquoso
9,2
Pouteria torta (Mart.) Radlk. Guaipeva Folha
Hexânico 5,1
Aquoso 11,2
Os extratos das espécies vegetais foram ensaiados com Lactuca sativa (Asteraceae)
variedade crespa “grand Rapids TBR”, marca Isla Pak e Lycopersicum esculentum Mill.
(Solanaceae) variedade super marmande, marca Isla Pak. As placas de Petri (Ø 9,0 cm) foram
desinfetadas com solução 0,01% de hipoclorito de sódio durante três horas, lavadas com água
destilada e revestidas internamente por discos de papel-filtro (Whatman nº 1), sendo o conjunto
submetido à esterilização em autoclave.
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As plantas-alvo foram testadas com os extratos brutos quanto a sua germinabilidade e tempo
médio de germinação (para a atividade fitotóxica na germinação) e comprimento radicular (para a
atividade fitotóxica no crescimento).
Bioensaio de germinação e crescimento
Estudos sobre efeitos fitotóxicos de extratos de plantas, comumente analisam os parâmetros
de germinabilidade, tempo médio de germinação e crescimento inicial, este último avaliado por
meio do comprimento da radícula e/ou hipocótilo (Alves et al., 2000; Alves et al., 2004; Maraschin-
Silva e Áquila, 2006). O crescimento inicial também pode ser avaliado por meio do comprimento
da parte aérea da plântula (Alves et al., 2004). A análise da entropia informacional da germinação
proposta por Labouriau (Laboriau, 1983; Aires et al., 2005) tem sido utilizada por alguns autores
(Maraschin-Silva e Áquila, 2006).
Para ambos os ensaios, foi utilizada a metodologia descrita por Ferreira e Borghetti (2004),
que preconiza a verificação da ocorrência de efeitos inibitórios ou estimulantes na germinação e no
crescimento das sementes, frente às amostras testadas, em diferentes concentrações. As placas de
Petri foram montadas com discos de papel-filtro (Ø 6 mm) umedecidas com 10 mL de solução do
extrato (etanólico, hexânico ou aquoso) nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg/mL (Ferreira e
Borghetti, 2004).
Para o bioensaio de germinação, após a evaporação do solvente, foram adicionados 10 mL
de água em cada placa. Em seguida, cada disco de papel recebeu 30 diásporos da espécie-alvo (L.
sativa ou L. esculentum), distribuídos aleatoriamente, com três repetições para cada extrato. Como
controle, o mesmo procedimento foi utilizado, entretanto, sem o extrato vegetal. A verificação da
ocorrência de germinação foi realizada nos intervalos de 24, 48, 72, 96 e 120 h (total de 5 dias),
procedendo a retirada das sementes germinadas. O critério de germinação foi emergência da
radícula (±2 mm) seguida de curvamento geotrópico da raiz.
Para o bioensaio de crescimento, após a evaporação do solvente, foram adicionados 10 mL
de água. Em seguida, cada disco de papel recebeu 10 diásporos das espécies-alvo (L. sativa ou L.
esculentum), distribuídos aleatoriamente, com três repetições para cada extrato. Como controle o
mesmo procedimento foi utilizado, entretanto, com a ausência do extrato vegetal. Os diásporos
estavam em período de crescimento prévio de três dias e foram escolhidos pela semelhança de
tamanho de crescimento neste período, evitando diferenças significativas que pudessem influenciar
os resultados do teste. As medidas da radícula das 10 plântulas foram feitas após sete dias de
crescimento, utilizando-se paquímetro digital.
Cálculo da taxa de inibição da germinabilidade (TIG)
A avaliação da taxa de inibição da germinabilidade teve como base a comparação entre
controle e demais tratamentos e dada em porcentagem por meio da fórmula:
TIG = (GC - GT) / GC x 100%
Onde TIG = taxa de inibição da germinabilidade; GC = germinabilidade do controle; GT =
germinabilidade do tratamento. Valores positivos de TIG revelam inibição da germinação, enquanto
valores negativos indicam estímulo à germinação.
Cálculo da taxa de inibição do crescimento radicular (TICR)
Para a avaliação da taxa de inibição do crescimento radicular, foi tomada como base a
comparação entre controle e demais tratamentos, sendo expressa em porcentagem:
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TICR = (CRC - CRT) / CRC x 100%
Onde TICR = taxa de inibição do crescimento radicular; CRC = comprimento da radícula no
controle; CRT = comprimento da radícula no tratamento. Valores positivos de TICR revelam
inibição do crescimento, enquanto valores negativos indicam estímulo ao crescimento.
Análise Estatística
Para as variáveis do teste de germinação e crescimento foram utilizadas análises estatísticas
aplicando o pacote SigmaPlot, versão 11.0 e GraphPad Prism 5. Nas análises de germinação, os
parâmetros avaliados foram germinabilidade e tempo médio de germinação (Laboriau, 1983; Araújo
et al., 2010). Nos ensaios de crescimento o parâmetro avaliado foi o crescimento radicular após 7
dias em contato com os extratos testados. Os dados de germinabilidade foram submetidos à Análise
de Variância (ANOVA) One way, seguida do método Holm-Sidak (P<0,05); para os dados não
paramétricos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido de teste Tukey (p<0,05). Enquanto que
os dados de tempo médio de germinação foram submetidos à ANOVA Two way (p<0,001) e os
dados de crescimento foram submetidos à ANOVA não paramétrica e Dunn post hoc (P<0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A resistência ou tolerância aos metabólitos secundários é uma característica espécie-
específica, existindo plantas mais sensíveis, como Lactuca sativa L. (alface), Lycopersicon
esculentum Mill. (tomate) e Cucumis sativus L. (pepino), consideradas indicadoras de atividade
alelopática (Alves et al., 2004). Outros fatores sustentaram a escolha de L. sativa como espécie-
alvo: curto período necessário para germinação (24 a 48 h), não requer foto-período, apresenta
tamanho considerado uniforme, germinação potencial a temperatura ambiente, eixo único da
plântula facilita a leitura do crescimento e seus diásporos são facilmente encontrados (Carballeira e
Reigosa, 1999; Ferreira e Aquila, 2000). Como as espécies nativas, amiúde, possuem algum tipo de
dormência, o uso de sementes de espécies cultivadas de boa qualidade é aconselhável e L.
esculentum e L. sativa são duas espécies em que as “sementes” (alface é um aquênio) são
facilmente encontradas e bastante sensíveis a vários aleloquímicos (Klink e Machado, 2005).
Germinabilidade e taxa de inibição da germinabilidade
Na Tabela 2, observa-se a germinabilidade e a taxa de inibição de sementes de L. sativa
submetidas aos extratos testados, constatando-se que alguns resultados foram dose-dependentes.
Os valores de TIG expressam diretamente o efeito inibitório da germinabilidade das
sementes, facilitando a análise dos resultados. As maiores taxas de inibição em relação ao controle
foram observadas para os extratos etanólicos de P. caimito (4 mg/mL, 76%) e P. ramiflora (4
mg/mL, 46%). Para o extrato hexânico de P. ramiflora houve inibição na concentração de 2 mg/mL
no valor de 21% e para o extrato aquoso desta mesma espécie não houve diferença estatística em
relação ao controle.
Tabela 2. Germinabilidade (G) e respectiva taxa de inibição da germinabilidade (TIG) de sementes
de Lactuca sativa submetidas a diferentes extratos foliares de espécies de Pouteria (Sapotaceae)
com resposta dose-dependente ao final de 5 dias.
Espécie e tipo de extrato Concentração do extrato (mg/mL)
0 0,5 1 2 4
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Pouteria caimito (etanólico) G (%) 90 87 80 64* 22*
TIG (%) 0 3 11 29* 76*
Pouteria ramiflora (etanólico) G (%) 97 88 87 80 52*
TIG (%) 0 9 10 18 46*
Pouteria ramiflora (hexânico) G (%) 94 93 88 74* 86
TIG (%) 0 1 6 21* 9
Pouteria ramiflora (aquoso) G (%) 91 97 86 91 82
TIG (%) 0 -7 5 0 10
*P< 0,05 vs controle.
Para os extratos testados utilizando L. esculentum como planta-alvo (Tabela 3), somente o
extrato etanólico de P. caimito, embora apresentando sutil estímulo da germinabilidade nas
concentrações mais baixas (0,5 e 1 mg/mL), apresentou TIG de 32% e 94% nas concentrações de 2
e 4 mg/mL, respectivamente.
Tabela 3. Germinabilidade (G) e respectiva taxa de inibição da germinabilidade (TIG) de sementes
de Lycopersicon esculentum submetidas ao extrato etanólico de folhas de Pouteria caimito
(Sapotaceae) ao final de 5 dias.
Espécie e tipo de extrato Concentração do extrato (mg/mL)
0 0,5 1 2 4
Pouteria caimito (etanólico) G(%) 72 89 83 49* 4*
TIG(%) 0 -24 -15 32* 94*
*P< 0,05 vs controle.
Tempo Médio de Germinação
A germinabilidade informa o número de sementes germinadas, entretanto, não reflete quanto
tempo foi necessário para que as sementes atingissem tal porcentagem de germinação (Ferreira e
Borghetti, 2004). Desta forma, se dois ou mais lotes de sementes apresentarem germinabilidade
semelhante, isso não quer dizer que seu comportamento germinativo seja o mesmo, pois os tempos
e a distribuição da germinação das sementes podem ser diferentes. Considerando que a 22 ºC todo
um lote de L. sativa L. pode germinar em 48 ou, no máximo, 72 h e que poderia haver efeito dos
extratos testados na distribuição deste tempo de germinação, o cálculo do tempo médio foi
realizado, pois fornece um caráter cinético ao processo e permite a realização de inferências sobre
vias metabólicas envolvidas (Ferreira e Borghetti, 2004).
Na Figura 1, observa-se que o extrato etanólico de P. ramiflora inibiu significativamente o
tempo de germinação de L. sativa nas 24 h (2 mg/mL e 4 mg/mL) e 48 h (4 mg/mL) de análise,
alterando a curva de germinação não cumulativa no tempo inicial, assim como o extrato aquoso da
mesma espécie em sua maior concentração nas 48 h de análise. Por outro lado, o extrato etanólico
de P. caimito atrasou o tempo médio de germinação nos tempos finais de análise e alterou a curva
de crescimento em 96 h nas três maiores concentrações.
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Figura 1. Curvas de crescimento não cumulativo de Lactuca sativa sob tratamento com várias
concentrações do extrato etanólico de folhas de Pouteria caimito, em comparação com o controle
(sem extrato), (A) 0,5 mg/mL, (B) 1,0 mg/mL, (C) 2,0 mg/mL, (D) 4,0 mg/mL, (E) todas as
concentrações. Os pontos representam a média ± erro padrão. *P<0,001 vs controle, n=9. Para uma
melhor visualização os asteriscos referentes às diferenças estatísticas não estão colocados no gráfico
(E).
Para os tratamentos com as sementes de L. esculentum (Figura 2), os extratos de folhas de P.
caimito apresentaram o seguinte comportamento: o extrato hexânico deslocou a curva de
germinação nas 72 h de análise nas concentrações de 1 mg/mL e 2 mg/mL e em 48 h e 72 h na
concentração de 4 mg/mL; o extrato etanólico alterou a germinação de L. esculentum ao longo do
tempo nas 48 h na concentração de 0,5 mg/mL; em 24 h e 48 h nas concentrações de 2 mg/mL e 4
mg/mL; no extrato aquoso de folhas de P. caimito, as inibições no tempo médio de germinação nas
primeiras 24 h foram significativas em todas as concentrações testadas.
0 24 48 72 96 1200
5
10
15 0,0 mg/mL
0,5 mg/mL
(A)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
0 24 48 72 96 1200
5
10
15 0,0 mg/mL
1,0 mg/mL
(B)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
*
0 24 48 72 96 1200
5
10
15 0,0 mg/mL
2,0 mg/mL
(C)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
*
0 24 48 72 96 1200
5
10
15 0,0 mg/mL
4,0 mg/mL
(D)
*
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
**
0 24 48 72 96 1200
5
10
15 0,0 mg/mL
0,5 mg/mL
1,0 mg/mL
2,0 mg/mL
4,0 mg/mL
(E)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
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Figura 2. Curvas de crescimento não cumulativo de Lycopersicum esculentum sob tratamento com
várias concentrações do extrato aquoso de folhas de Pouteria caimito, em comparação com o
controle (sem extrato), (A) 0,5 mg/mL, (B) 1,0 mg/mL, (C) 2,0 mg/mL, (D) 4,0 mg/mL, (E) todas
as concentrações. Os pontos representam a média ± erro padrão. *P<0,001 vs controle, n=9. Para
uma melhor visualização, os asteriscos referentes às diferenças estatísticas não estão colocados no
gráfico (E).
Para os extratos foliares de P. ramiflora testados com as sementes de L. esculentum, os
extratos aquoso e etanólico inibiram a germinação nas 48h de análise na concentração de 4 mg/mL.
O extrato hexânico, contudo, deslocou a curva de germinação nas 24 h e 72 h na concentração de 1
mg/mL e em 24 h, 48 h e 72 h nas duas maiores concentrações (2 mg/mL e 4 mg/mL).
As sementes de L. esculentum frente aos extratos foliares de P. torta também tiveram seu
crescimento não cumulativo afetado. Para o extrato hexânico, a curva foi deslocada nas 48 h e 72 h
nas concentrações de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL; em 48 h de análise na concentração de 4
mg/mL. Para o extrato aquoso da mesma planta, não houve alteração da curva de crescimento não
cumulativa.
Comprimento radicular (CR) e taxa de inibição do crescimento radicular (TICR)
Verifica-se na Figura 3 que houve algumas reduções no CR de L. sativa de forma dose-
dependente. O extrato hexânico de P. ramiflora apresentou atividade inibitória em todas as
concentrações testadas (0,5 mg/mL, 27%; 1,0 mg/mL, 31%; 2,0 mg/mL, 58% e 4,0 mg/mL, 67%).
Os dados de CR para o extrato etanólico de P. ramiflora mostram a inibição nas seguintes
0 24 48 72 96 1200
5
10
15
20
25 0,0 mg/mL
0,5 mg/mL
(A)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
*
0 24 48 72 96 1200
5
10
15
20
25 0,0 mg/mL
1,0 mg/mL
(B)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
*
*
0 24 48 72 96 1200
5
10
15
20
25 0,0 mg/mL
2,0 mg/mL
*
(C)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
*0 24 48 72 96 120
0
5
10
15
20
25 0,0 mg/mL
4,0 mg/mL
(D)
*
*
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
0 24 48 72 96 1200
5
10
15
20
25 0,0 mg/mL
0,5 mg/mL
1,0 mg/mL
2,0 mg/mL
4,0 mg/mL
(E)
tempo (h)
núm
ero
de
sem
ente
s g
erm
inadas
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concentrações: 2,0 mg/mL, 61% e 4,0 mg/mL, 75%. O extrato aquoso apresentou inibição somente
na maior concentração (4,0 mg/mL, 38%). O extrato aquoso de P. torta apresentou inibição nas
concentrações de 2,0 e 4,0 mg/mL (45 e 53%, respectivamente); e o extrato hexânico apresentou
ação inibitória nas seguintes concentrações: 1,0 mg/mL, 19%; 2,0 mg/mL, 23% e 4,0 mg/mL, 35%.
O extrato etanólico de P. caimito teve ação inibitória no crescimento da radícula em todas as
concentrações testadas (0,5 mg/mL, 62%; 1,0 mg/mL, 62%; 2,0 mg/mL, 59%; 4,0 mg/mL, 61%), o
extrato aquoso apresentou efeito inibitório nas concentrações de 2,0 e 4,0 mg/mL, 33 e 49%,
respectivamente.
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Figura 3. Efeito alelopático dos extratos de folhas de espécie do gênero Pouteria sobre o
crescimento de sementes de Lactuca sativa. (A) Extrato hexânico de Pouteria ramiflora; (B)
Extrato etanólico de P. ramiflora; (C) Extrato aquoso de P. ramiflora; (D) Extrato aquoso de P.
torta; (E) Extrato hexânico de P. torta; (F) Extrato etanólico de P. caimito; (G) Extrato aquoso de
P. caimito. As barras representam a média ± desvio padrão. *P<0,05 vs controle, n=9.
Na verificação dos efeitos alelopáticos dos extratos no CR de L. esculentum, Figura 4, o
extrato hexânico de P. ramiflora apresentou efeitos inibitórios nas 3 maiores concentrações em
relação ao controle (1,0 mg/mL, 36%; 2,0 mg/mL, 21%; 4,0 mg/mL, 46%), com discreto estímulo
na concentração de 2,0 mg/mL em relação as outras duas. Os dados de CR para o extrato etanólico
de P. ramiflora mostram inibição da planta-alvo em todas as concentrações testadas (0,5 mg/mL,
47%; 1,0 mg/mL, 49%; 2,0 mg/mL, 56% e 4,0 mg/mL, 75%). O extrato aquoso de P. ramiflora
apresentou inibições somente nas duas maiores concentrações com TICR de 64% (2,0 mg/mL) e
78% (4,0 mg/mL).
Assim como foi observado para L. sativa, o extrato aquoso de folhas de P. torta apresentou
inibição nas concentrações de 2,0 e 4,0 mg/mL (50 e 74%, respectivamente), enquanto o extrato
hexânico apresentou comportamento distinto, sem efeitos fitotóxicos sobre L. esculentum (Figura
4).
Algumas reduções no comprimento radicular (CR) de L. esculentum, Figura 4, também
foram dose-dependentes. O extrato aquoso das folhas de P. caimito inibiu o CR em L. esculentum
em todas as concentrações testadas (0,5 mg/mL, 22%; 1,0 mg/mL, 29%; 2,0 mg/mL, 35%; 4,0
mg/mL, 51%) e o extrato etanólico teve esta ação inibitória nas três maiores concentrações testadas
(1,0 mg/mL, 45%; 2,0 mg/mL, 64%; 4,0 mg/mL, 74%). Assim como nos testes realizados com L.
sativa , o extrato hexânico não apresentou efeito fitotóxico sobre o CR de L. esculentum.
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Figura 4. Efeito alelopático dos extratos de folhas de espécies do gênero Pouteria sobre o
crescimento de sementes de Lycopersicum esculentum. (A) Extrato hexânico de Pouteria ramiflora;
(B) Extrato etanólico de P. ramiflora; (C) Extrato aquoso de P. ramiflora; (D) Extrato aquoso de P.
torta; (E) Extrato etanólico de P. caimito; (F) Extrato aquoso de P. caimito. As barras representam
a média ± desvio padrão. *P<0,05 vs controle, n=9.
Existe uma grande expectativa de que abordagens genômicas modernas irão identificar
novos alvos e modos de ação de metabólitos de plantas. Algumas moléculas, especialmente
triterpenoides, que promovem apoptose ou autofagia em células tumorais, são de particular interesse
nestes estudos. Embora seja aceito que estes metabólitos secundários e produtos naturais de plantas
estejam envolvidos em diversas atividades, a função de fenóis, quinonas, terpenos, flavonoides e
outros metabólitos de baixo peso molecular permanecem desconhecidos (Morrissey, 2009). Desta
forma, existe a necessidade de conhecimento das espécies vegetais brasileiras, que são utilizadas
pela população como medicinais, sem comprovação de sua atividade farmacológica.
A triagem de extratos brutos possibilita a constatação de atividade fitotóxica para posterior
fracionamento e isolamento na determinação de substâncias específicas responsáveis por esta
atividade, a exemplo do que foi feito por (Kpoviessi et al., 2008) e (Kato-Noguchi, 2003), bem
como sua correlação com atividade antioxidante (Cespedes et al., 2001). Os resultados desse ensaio
0,0
0,5
1,0
2,0
4,0
0
50
100
150
**
*
(A)
[extrato](mg/mL)
Radíc
ula
(m
m)
0,0
0,5
1,0
2,0
4,0
0
50
100
150
* * **
(B)
[extrato](mg/mL)
Radíc
ula
(m
m)
0,0
0,5
1,0
2,0
4,0
0
50
100
150
* * **
(C)
[extrato](mg/mL)
Radíc
ula
(m
m)
0,0
0,5
1,0
2,0
4,0
0
50
100
150
(D)
*
*
[extrato](mg/mL)R
adíc
ula
(m
m)
0,0
0,5
1,0
2,0
4,0
0
50
100
150
(E)
** *
[extrato](mg/mL)
Radíc
ula
(m
m)
0,0
0,5
1,0
2,0
4,0
0
50
100
150
* * **
(F)
[extrato](mg/mL)
Radíc
ula
(m
m)
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preliminar também podem servir de referência para que os extratos selecionados sejam avaliados
como modelo de citotoxicidade, por meio de sua resposta alelopática.
Com base nas respostas obtidas, foi possível constatar que os extratos apresentaram
atividade fitotóxica em, ao menos, um dos parâmetros avaliados (Tabela 4). O extrato etanólico de
P. caimito apresentou fitotoxicidade em todos os parâmetros testados frente às duas plantas-alvo.
Um estudo conduzido por Nascimento et al., (2007) já havia mostrado a ação de extratos das
folhas de P. torta sobre a germinação de L. sativa. Naquele estudo foi verificado também se
alterações de pH, efeito osmótico e iônico estariam influenciando tal inibição, que foi melhor
observada nas maiores concentrações do extrato. Os autores concluíram que não havia interferência
destes fatores e que esta inibição estaria associada a compostos presentes nas folhas de P. torta
(Nascimento et al., 2007). Ao contrário dos resultados publicados, nas condições do nosso
experimento, observamos que os extratos etanólico e hexânico das folhas de P. torta não inibiram a
germinação, mas influenciaram no crescimento radicular de maneira dose-dependente.
Em outro estudo conduzido com frações do extrato de P. ramiflora utilizando substrato solo,
foi verificada a atividade inibitória na germinação de L. sativa (Silva et al., 2006); contudo nos
ensaios in vitro tal resultado não foi observado, ou seja, P. ramiflora não apresentou atividade
inibitória significativa na germinação da planta-alvo. Naquele trabalho, os autores postularam que,
na natureza, essa espécie só influencia no desenvolvimento de outras se a quantidade de folhas em
degradação for capaz de produzir altos teores dos compostos ativos (Silva et al., 2006).
No presente estudo, contudo, o extrato hexânico das folhas de P. ramiflora foi capaz de
inibir tanto a germinação quanto o crescimento radicular, este último, em L. sativa e L. esculentum;
o extrato aquoso de P. ramiflora inibiu o tempo médio de germinação e o CR nas duas plantas-alvo
testadas e o extrato etanólico, com exceção da germinabilidade de L. esculentum, apresentou
atividade inibitória em todos os parâmetros testados (Tabela 4).
Dessa forma, os extratos brutos testados, apresentaram efeito fitotóxico sobre germinação e
crescimento radicular de plântulas de L. sativa e L. esculentum, não sendo constatado neste estudo
qual foi o composto responsável pela ação, visto que o extrato utilizado não foi fracionado.
Contudo, a presença de determinados compostos nesses extratos pode justificar, ao menos em parte,
a atividade observada na espécie-alvo. Miricitrina, considerada marcador do gênero Pouteria, tem
atividade inibitória sobre a germinação de L. esculentum (Nicollier e Thompson, 1983) -sitosterol
inibe a germinação de L. sativa de modo dose-dependente (Macias et al., 1997; Choi et al., 1998). A
atividade alelopática foi observada em triterpenos presentes em espécies de Pouteria tais como
lupeol, ácido ursólico e α-friedelinol (atividade inibitória) e friedelina e acetato de α-amirina
(atividade estimulante) (Chou et al., 2009). Assim, tais compostos podem justificar, ao menos em
parte, a atividade observada nas amostras avaliadas.
Tabela 4. Atividade fitotóxica de extratos brutos de espécies vegetais do gênero Pouteria sobre
sementes de Lactuca sativa e Lycopersicum esculentum.
ATIVIDADE FITOTÓXICA
ESPÉCIE-ALVO
Lactuca sativa Lycopersicum esculentum
Espécie Extrato G tm CR G tm CR
Pouteria caimito etanólico I I I I I I
hexânico NS NS NS NS I NS
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aquoso
NS NS I NS I I
Pouteria
ramiflora
etanólico I I I NS I I
hexânico I NS I NS I I
aquoso
NS I I NS I I
Pouteria torta hexânico NS NS I NS I NS
aquoso NS NS I NS NS I
G: germinabilidade; tm: tempo médio de germinação; CR: comprimento radicular; I: inibição; NS:
não significativo.
Os extratos que se mostraram mais promissores foram etanólico de P. caimito e P. ramiflora
(Tabela 4), pois apresentaram atividade inibitória frente a todos os parâmetros testados para L.
sativa, com valores de TIG de 76% e 46%, respectivamente, a 4 mg/mL e com resultados
expressivos quando testado com L. esculentum, com TICR de 61% e 75%, respectivamente, a 4
mg/mL.
Os efeitos fitotóxicos de extratos de plantas têm sido analisados por diversos parâmetros,
tais como tempo médio de germinação e crescimento inicial (Alves et al., 2000; Alves et al., 2004;
Maraschin-Silva e Áquila, 2006) e entropia informacional da germinação (Laboriau, 1983; Aires et
al., 2005; Maraschin-Silva e Áquila, 2006). No presente trabalho são apresentados pela primeira vez
os conceitos de TIG e TICR, que constituem contribuições inéditas para os estudos sobre
fitotoxicidade. São conceitos claros e que possibilitam uma interpretação direta dos resultados, pois
quanto maiores forem estes valores, maior será o efeito inibitório. Além disto, os valores de TIG e
TICR possibilitam relacionar o efeito inibitório dos extratos sobre a germinabilidade e crescimento
da radícula, respectivamente, e valores obtidos no controle. A vantagem disto é a minimização do
efeito de variações nos lotes de sementes nas comparações entre os tratamentos.
CONCLUSÃO
No presente trabalho foram analisados germinabilidade, tempo médio de germinação e
crescimento radicular, parâmetros estes comumente utilizados para avaliação de efeitos fitotóxicos.
São apresentados pela primeira vez os conceitos de TIG e TICR, que constituem contribuições
inéditas para os estudos sobre fitotoxicidade. São conceitos claros e que possibilitam uma
interpretação direta dos resultados, pois quanto maiores forem estes valores, maior será o efeito
inibitório. Além disto, os valores de TIG e TICR possibilitam relacionar o efeito inibitório dos
extratos sobre a germinabilidade e crescimento da radícula, respectivamente, e valores obtidos no
controle. A vantagem disto é a minimização do efeito de variações nos lotes de sementes nas
comparações entre os tratamentos. Assim, considerando que esses conceitos propostos mostraram-
se muito úteis no presente trabalho, é recomendado o uso dos mesmos em estudos sobre alelopatia.
Todos os oito extratos brutos de folhas testados apresentaram algum efeito alelopático sobre
L. sativa e L. esculentum.
Mediante as respostas obtidas com as técnicas empregadas, ressalta-se o resultado alcançado
com o extrato etanólico da Pouteria caimito, que inibiu a atividade alelopática em todos os
parâmetros testados para ambas as sementes. Os resultados desse ensaio preliminar podem servir de
referência para que os extratos selecionados sejam avaliados como modelo de citotoxicidade, por
meio de sua resposta alelopática.
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