Ecologia MicrobianaDra. Ana Paula Ramos

•Informação genética

•Replicação do DNA e elementos envolvidos

•Técnicas moleculares mais usadasIsolamento de material genético٭Técnicas de amplificação de ácidos nucléicos٭

-PCR e variações, PCR em tempo real*Técnicas de amplificação do sinal

-HibridizaçõesFase sólida Blothings (Southern, Northern, Dot Blot)Fase líquida

*Técnicas para análise de seqüências-RFLP -RAPD

•Aplicações das técnicas

Objetivos da Aula:

DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição

Composição do DNA e do RNA

- DNA: carrega a informação genética

- RNA: molécula intermediária entre a informação e a expressão gênica

Ácidos Nucleicos são formados por “blocos de construção pareados”: purinas e pirimidinas (bases nitrogenadas)

fosfato e açúcar

Ligações químicas

DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição

Replicação do DNA: várias enzimas

• DNA Polimerase • SSB (Single Strand Binding Protein)• Primase• Helicases • DNA ligase

DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição

– Adenina – Guanina– Citosina – Timina

– Adenina– Guanina– Citosina– Uracila

Purinas

Pirimidinas

DNA RNA

Açúcar

Desoxirribose Ribose

Fita dupla Fita simples

DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição

Transcrição e Tradução (expressão gênica): dogma central

• É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir

da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma

molécula de DNA de fita dupla

Por que métodos moleculares??

•Metodologia clássica x Métodos moleculares

-Dificuldade em recuperar as células de um sistema

•Microrganismos pouco concentrados em amostras ambientais (água...)

•Alto número de microrganismos viáveis, mas não cultiváveis (91 a 99%)

Estratégias gerais para estudar seqüências específicas de DNA

Pop

ula

ção a

ser

est

ud

ad

a

Amplificação específica

Detecção específica

Análise de seqüências

Amplificação in vitro

Hibridizações

RFLP, RAPD e sequenciamen

to

Isolamento e purificação do material genético

– Remover qualquer material ou componente celular que possa interferir nas técnicas moleculares

• Recuperação celular: por centrifugação• Lise celular: detergentes • Desproteinização: uso de enzimas• Extração de ácidos nucléicos• Purificação de ácidos nucléicos

Métodos diferentes para amostras diferentes

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

Desnaturação: 95°C

Anelamento: 55°C

Extensão: 72°C

Desnaturação: 95°C

Anelamento: 55°C

Extensão: 72°C

25 a 40

ciclos 25 a 40

ciclos

• Amplificação in vitro de ácidos nucléicos: aumento da possibilidade de visualizar estas moléculas

– DNA molde (alvo)– Iniciadores– Nucleotídeos (dNTP’s)– Íons Magnésio (necessários para ativar a enzima)– DNA polimerase– Tampão (manutenção do pH ótimo)

REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE -PCR

Seqüência alvo

Ciclo da PCR - etapa 1

Seqüência alvo

Seqüência alvo

DESNATURAÇÃO DO DNADESNATURAÇÃO DO DNA

Ciclo da PCR - etapa 2

Seqüência alvo

Seqüência alvo

Iniciador 1Iniciador 2

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVOHIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO

Ciclo da PCR - etapa 3

Seqüência alvo

Seqüência alvo

Iniciador 1

Iniciador 2

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

3’

Taq DNA

Polimerase

SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQTAQ DNA DNA POLIMERASE POLIMERASE

Final do primeiro ciclo da PCR

Seqüência alvo

Seqüência alvo

DUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVODUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVO

Ciclos da PCR

Desnaturação

Hibridação

ExtensãoFinal do ciclo

1 ciclo = 2 Amplicons

2 ciclos = 4 Amplicons

3 ciclos = 8 Amplicons

4 ciclos = 16 Amplicons

5 ciclos = 32 Amplicons

6 ciclos = 64 Amplicons

7 ciclos = 128 Amplicons

No. No. No. Amplicons No. Amplicons CiclosCiclos Copias do DNA alvoCopias do DNA alvo

11 2 2

22 4 4

33 8 8

44 16 16

5 5 32 32

66 64 64

2020 1.048.5761.048.576

3030 1.073.741.8241.073.741.824

Produtos de PCR

Visualização dos produtos de PCR por Eletroforese

• Separação de moléculas por peso molecular: ácidos nucléicos ou proteínas

• Diferença de potencial entre dois eletrodos (+ e -)

• Matriz polimerizada : agarose e poliacrilamida

• RT-PCR – Transcrição reversa• Nested-PCR – Iniciadores internos, dois “rounds” de

amplificação• PCR Multiplex – Vários iniciadores• ICC/PCR – PCR associada à cultura celular

Variações da PCR

RT- PCR

Não segue o dogma central da biologia molecular

Não segue o dogma central da biologia molecular

Trabalhar com DNA é mais estável !Trabalhar com DNA é mais estável !

• Utilizado em estudos de expressão gênica

• Utilizado para detecção viral (vírus de RNA)

RNA Transcrição Reversa

cDNA

Nested PCR

Multiplex PCR

ICC-PCR (Integrated Cell Culture - PCR)

Amostra processada

Cultura

Crescimento / efeito citopático

Lise celular e extração dos ác. nucléicos do lisado

RT-PCR / PCR

Eletroforese: produto específico

• Para os casos nos quais há necessidade de aumentar a concentração microbiana e há muitos inibidores: amostras ambientais

• Deixa-se um tempo padronizado onde não é necessário observar crescimento / ECP, mas já é possível a detecção por PCR

• Ajuda na remoção de inibidores o que aumenta a sensibilidade da PCR

• Volume de análise muito maior

PCR em tempo real - quantitativo

Diagrama de um “sinalizador” molecular. Este sinalizador tem 33 nucleotídeos com um corante fluorescente (R) ligado ao terminal 5´ e um bloqueador de sinais (Q) no terminal 3´. As 9 bases do terminal 5´pareiam com as 9 bases do terminal 3´ e faz com que o sinal fluorescente fique muito próximo ao bloqueador. Quando o fluorescente é excitado ele é bloqueado pelo bloqueador e nenhuma fluorescência é detectada. As bases em rosa representam sequências que pareiam especificamente com o produto de PCR.

Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular”. Quando o sinalizador liga-se ao produto de PCR (T°C de 5 a 10°C mais elevada que a T°C de anelamento dos primers), ele vai fluorescer quando excitado no comprimento de onda adequado. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR amplificada.

MÉTODO TAQMAN

•Sonda TaqMan® complementar a uma região interna do produto de PCR e ligada a um composto fluorescente.

•Quando a amplificação começa, a DNA polimerase corta a sonda, e a fluorescência é liberada.

•A fluorescência é liberada a cada ciclo, gerando um sinal fluorescente específico da seqüência.

• Moléculas individuais de ácidos nucléicos (fita simples) apresentam a capacidade de formar moléculas de fita dupla (hibridização) necessidade de alta complementaridade entre as bases para que isso aconteça;

• Sensibilidade menor que os métodos de amplificação gênica

Hibridização

Utilizada para confirmação

Hibridização

• Sondas são marcadas direta ou indiretamente com enzimas, radioisótopos ou substratos quimioluminescentes / antigênicos, possibilitando a hibridização e detecção

– Fase líquida: captura híbrida

– Fase sólida: Southern e Northern blot, Dot Blot e Colony Blot

Hibridização

Fase Líquida: captura híbrida

• Enzimas de Restrição: enzimas isoladas de procariotos que reconhecem seqüências específicas no DNA dupla fita.

Fase sólida: Ácidos nucléicos digeridos com enzimas de restrição e imobilizados em um suporte sólido

Fase sólida: Ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido

Sou

thern

e N

ort

hern

B

lot

Dot Blot : ácido nucléico diretamente imobilizado em membranas, vácuo

• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição) – Tipagem

• exemplo: variações dentro do gene rRNA, que é conservado

– Comparação entre o número e o tamanho dos fragmentos;

– Variações no tamanho dos fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após clivagem enzimas de restrição;

– Padrões de bandas diferenciados indicam organismos distintos geneticamente (mesma espécie ou não);

Análise de seqüências

• RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting

– PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado)

– Não é necessário um conhecimento prévio do genoma– Uniformidade no padrão de bandas para espécies

relacionadas

Análise de seqüências

DNA

Desnaturação a 95oCDesnaturação a 95oC

DNA

Extensão a 72ºCExtensão a 72ºC

400bp400bp

310bp310bp

260bp260bp

75bp75bp

Fragmentos de RAPD

Visualização de Fragmentos de RAPD

• Diferentes técnicas : quando se conhece ou não o genoma do organismo estudado

• Processamento das amostras é de extrema importância

ácidos nucléicos de boa qualidade, pureza e, principalmente, com mínimo de inibidores

Utilização de técnicas moleculares na avaliação e detecção da diversidade microbiana

Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos

Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos:

• O LVA vem trabalhando na avaliação da contaminação em moluscos desde aproximadamente 10 anos;

• Importância devido o grande destaque de Florianópolis e região na Maricultura

• Moluscos: animais filtradores concentram patógenos

Salmonella spp.

Vírus: RNA Hepatite A, Rotavírus, Norovírus, Poliovirus DNA Adenovírus, Poliomavírus,

Necessidade de diminuição de

inibidores presentes na carne

de ostras e enriquecimento da amostra em meio

de cultivo (viabilidade e aumento do

número de células)

Análise de contaminação viral em amostras de águas:

Método de filtração e concentração(Katayama et al., 2002)

Centriprep - Millipore

• Alto custo da infra-estrutura do laboratório e reagentes;

• Diferenciação entre células viáveis e não viáveis; depende da técnica e do organismo a ser estudado

• Dificuldade em pesquisar quando o genoma do microrganismo não é conhecido.

Problemas...

2008-2011: MAPA L-2/CNPq: IMPLEMENTAÇÃO DE TÉCNICAS DE DEPURAÇÃO DE OSTRAS DE CULTIVO QUE VISEM GARANTIR A QUALIDADE E INOCUIDADE DO PRODUTO.

2007-2009: Ed. Universal/CNPq 2007 : VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS HUMANOS DE INTERESSE EM SAÚDE PÚBLICA E MEIO AMBIENTE: Rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite A como modelos de contaminação de águas ambientais

2007-2009: Ed. FINEP/SEBRAE: Produção de ostras triplóides da espécie Crassostrea gigas..

30/11/2008 a 30/10/2009 FAPESC: Produção de sementes de ostras triplóides (3n) para a maricultura catarinense.

2009-2010: AECID: “Agencia Espanola de Cooperación Internacional para el Desarollo” (INTERNATIONAL COLABORATION BETWEEN UFSC AND BARCELONA UNIVERSITY FOR HUMAN EXCHANGE) : Desenvolvimento de métodos para a detecção e quantificação de vírus em moluscos.

PROJETOS EM ANDAMENTO