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Evaluación de la actividad genotóxica del extracto metanólico de Gynosis
verrucosa mediante el ensayo Micronúcleos con bloqueo de Citocinesis en la línea celular Astrocitoma cerebral (D-384).
Diana J. Herrera Torres
Director:Dr. Natalia Bailón M.
Universidad Técnica Particular de Loja
DEFINICIÓN
La muerte por cáncer en 2007 fueron 7.6 millones
El cáncer se caracteriza por un crecimiento incontrolado y la propagación de células anormales
Macdonald F. et al ,2004
La carcinogénesis, requiere varios año, involucra mutaciones y varias causas
INCIDENCIApulmón, próstata, colon y recto .
En 1997 al 2002Hombres: Estómago, próstata, S. hematopoyéticoMujeres: cérvix invasor, mama, piel, estomago
Pulmón, mama, colon y recto
Mujeres: mama y cérvix (cuello uterino).Hombres: próstata y estómago.
AGENTES ANTICANCERÍGENOS Desde décadas atrás se han utilizado los principios de origen vegetal, y se viene realizando el aislamiento y caracterización de numerosos principios activos de los cuales se han desarrollado nuevos fármacos.
Estos provienen de plantas comúnmente de uso clínico.
Catharanthus roseus
Taxus brevifolia
Podophyllum peltatum
Camptotecina cuminata
4.Camptotecinas
Cuatro clases 1. Alcaloides de la Vinca
2.Epipodofilotoxinas
3. Taxanos
PRODUCTOS DE ORIGEN VEGETAL En la provincia de Loja y Zamora Chinchipe, elaboran remedios caseros con familias: Asteraceae, Lamiaceae, Solanaceae, Fabaceae, Onagraceae y Apiaceae, por sus propiedades curativas.
Gynoxis verrucosa, propiedades curativas: presión sanguínea baja, depresión psicológica, problemas visuales, respiratorios y como sedante para cólicos.
Del extracto de G. verrucosa se han aislados lactonas sesquiterpénicas: dehidroleucodina 1,10-epoxy-2-hidroxikauniolida; al igual que compuestos derivados del ácido bisabolánico.
El extracto de G. verrucosa efecto citostático a <10ug/ml.IC50 = 22,06 ± 10,7ug/ml
Micronúcleos con bloqueo de citocinesis (CBMN)
El análisis de MN es usado como una prueba de genotóxicidad y para biomonitoreo de exposición a genotóxicos y sus efectos en humanos.
Los MN se forman por ruptura directa del ADN
Posible medir la frecuencia del rotura de cromosomas (MN), la pérdida del cromosoma (MN), la reorganización del cromosoma, cromosomas dicéntricos (NPB), amplificación de genes (NBUDs), la necrosis y apoptosis.
Posibles destinos a la exposición citotóxicos o agentes genotóxicos
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad genotóxica del extracto metanólico de Gynoxis verrucosa mediante el ensayo CBMN en la línea celular Astrocitoma cerebral (D384).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Establecer el efecto citostático mediante Índice de División Nuclear en la línea celular Astrocitoma cerebral (D384).
• Establecer el efecto genotóxico mediante la evaluación de Micronúcleos en la línea celular Astrocitoma cerebral (D384).
MATERIALES Y METODOS
24 Horas
24 Horas
24 Horas
Siembra TratamientoCultivar células D-384
24 Horas
Evaluación
CosechaTinción
24 Horas
GRUPOTRATAMIENTO
VehículoConcentraciones
de prueba MMC Citocalasina B
Cont. Positivo MMC DMSO ---- 1 uM (5ul) 4.5ug/ml (33 ul)
Concentración 25 ug/ml DMSO 25ug/ml (62,5ul) ---- 4.5ug/ml (33 ul)
Concentración 20ug/ml DMSO 20ug/ml (50ul) --- 4.5ug/ml (33 ul)
Concentración 10ug/ml DMSO 10ug/ml (25ul ) ---- 4.5ug/ml (33 ul)
Cont. Negativo DMSO < 0.5% ---- ---- 4.5ug/ml (33 ul)
MATERIALES Y METODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
DMSO 10 20 25 MMC 1uM0
25
50
75
100Mo Bi Po
Concentración G.v (ug/ml)
% d
e ce
lula
s M
o, B
i, Po
li
Se utilizó la cinética de proliferación celular (CPC), para lo cual se evaluó la proporción de células mono (M), bi (B), o polinucleadas (P).
El índice mitótico se basa en el grado de proliferación celular como respuesta a la presencia de un agente externo y se define como el porcentaje de células que contiene cromosomas condensados en una etapa del ciclo celular, la mitosis
DMSO 10 20 25 MMC 1uM1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Concentración G. v (ug/ml)
IDN
Figura 3.2. Índice de división nuclear calculado para línea celular D-384 tratadas con G. verrucosa. MMC como C. positivo y DMSO como C. negativo. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. Usamos T. de DUNETT. *** P<0.00001; **P< 0.00002; *P<0.00003
INDICE DE DIVISION NUCLEAR
El extracto G. verrucosa, tiene un efecto citostático a partir 10ug/ml de células CHO-K1.
Antineoplásicos como el Carboplatino (5 ug/ml).En el tamoxifeno, utilizado en 2 líneas celulares [MCF-7, MDA-MB468]
Podemos establecer que el efecto citotóxico o cistostático puede variar dependiendo de la naturaleza del estudio.
Frecuencia de Micronucleos
control 10 20 25 MMC 1uM0
10
20
30
40
50
60
70
Concentraciones G. v (ug/ml)
CB
N m
icro
nu
cle
os
/10
00
CB
N
Figura 3.3. Efecto genotóxico, en las células D384, expuestos a diferentes concentraciones de G. verrucosa. Se empleó como control positivo MMC 1 μM. Los resultados son de tres experimentos independientes que se realizaron por duplicado. Usamos T. de DUNETT. *P> 0,00001.
FRECUENCIA DE MICRONUCLEOS
Se conoce el incremento de la frecuencia de MN se observa a partir de 1ug/ml en linfocitos humanos CBN
Puede incrementar el daño al ADN a partir de 0.01 ug/ml, medido mediante el ensayo cometa.
•Las concentraciones que se probo con el extracto metanólico de Gynoxis verrucosa no tiene un efecto citostático en la línea celular de Astrocitoma cerebral D-384 evaluadas mediante el índice de división nuclear.
CONCLUSIONES
•El extracto metanólico de Gynoxis verrucosa produce un daño significativo a las concentraciones probadas de 10, 20, 25ug/ml en la línea celular de Astrocitoma cerebral D-384 evaluadas mediante el conteo de células binucleadas.
GRACIAS
Macdonald F. et al ,2004