Diagnóstico Parasitológico

Taís Rondello Bonatti

1

• Protozoários intestinais

CDC, 2016

Introdução

Giardia duodenalis

- Prevalência: 8 a 30% em países emdesenvolvimento; 0,4 a 7,5% em paísesdesenvolvidos

Cryptosporidium spp.

- 30 a 50% das mortes por diarreia emcrianças abaixo de 5 anos

Entamoeba histolytica

- 50 milhões de casos e 100 mil mortes porano

2

Introdução

• Helmintos transmitidos pelo solo

CDC, 2016

Ascaris lumbricoides

• 807 milhões – 1,1 bilhão

Trichuris trichiura

• 609 – 795 milhões

Ancilostomatídeos (Necator americanus eAncylostoma duodenale)

• 576 – 740 milhões

3

Introdução

• Parasitos do sangue e tecidos

CDC, 2016

Leishmania spp.

• Cutânea: 700 mil a 1,2 milhões novos casos por ano

• Visceral: 200 mil a 400 mil novos casos por ano

Plasmodium spp.

• 2015: 214 milhões de novos casos de malária e 438.00mortes

4

Introdução

• Brasil: decréscimo da prevalência (?) - muitas doenças não são denotificação obrigatória

• Aumento da consciência sobre a importância das doenças parasitárias

• Médicos: não vão realizar os exames mas precisam entender ascapacidades e limitações de cada método

Garcia, 2007; CDC, 2016 5

Abordagem ao paciente:

• Necessidade do histórico completo: particularmente viagens

• Sintomas podem ser sutis e mudar ao longo do tempo

• Histórico geral também é importante: ocupação, hobbies, atividades de lazer, dieta, medicamentos

• Dificuldade no diagnóstico clínico

• Não permite diferenciação específica do agente infeccioso

Introdução

6

Introdução

• Necessidade do diagnóstico laboratorial

• Diagnóstico incorreto: procedimento e interpretação

• Tratamento do paciente: demonstração definitiva do agenteetiológico

Garcia, 2007. 7

PARASITOS INTESTINAIS

8

Exame parasitológico de fezes

EPF ou exame coproparasitológico:Análise laboratorial a partir de amostra(s) de fezes

Não faz parte dos exames complementaressolicitados

Parasitoses intestinais não consideradas nahipótese diagnóstica

- Médico desconhece o EPF

Exames baratos, não invasivos, de fácil execução

- Evita a realização de exames mais invasivos, onerosos e complexos9

Exame parasitológico de fezes

Reforçar as instruções de

seguir as recomendações da coleta do material

MédicoParticipação ativa: quem vai realizar a

coleta

Paciente

10

Colheita e preservação das amostras

• Maioria parasitos intestinais: detecção por exame de fezes• Outras amostras: urina, escarro, secreções urogenitais, aspirados, tecidos,

conteúdo duodenal, amostras obtidas por biópsia

• Fezes eliminadas no vaso sanitário ou no solo: inadequadas

Urina: destruição de trofozoítos

Presença de organismos de vida livre

11

Colheita e preservação das amostras

• Estágios usuais de diagnóstico:

• Ovos e larvas de helmintos

• Cistos, oocistos e trofozoítos de protozoários

12

Colheita e preservação das amostras

• Identificação segura e correta:

• Critérios morfológicos

• Colheita adequada

• Boa preservação da amostra

Fragmentos de alimentos, células vegetais, grãos de pólen, outros artefatos. 13

Colheita das amostras: Cuidados

• Fezes emitidas espontaneamente

• Detecção e identificação qualidade da amostra entregue nolaboratório

• Quantidade mínima: 20 a 30g de fezes

• Fezes pastosas ou mucosas: esfregaços corados

• Fezes formadas: técnicas de concentração

• Nunca devem ser incubadas a 37oC ou congeladas

14

Colheita das amostras: Cuidados

• Fezes emitidas espontaneamente

• Uso de antidiarreicos, antibióticos, antiácidos, vaselina e óleosminerais: amostra insatisfatória para análise• Antibióticos: afetam flora intestinal - diminuição ou ausência temporária dos

organismos nas fezes

• Exames com aplicação de contraste:• Bário e bismuto: excesso de substâncias cristalinas – podem destruir

trofozoítos devido à ação abrasiva

• Colheita deve ser adiada por período de 7 a 10 dias ou feita antes do exame

15

Colheita das amostras

• Frasco: boca larga, capacidade de 50mL, limpos, vedados, acondicionadosem plástico transparente

• Identificação do frasco:• Nome, número de identificação, nome do médico, data e horário da

colheita

16

Colheita das amostras

17

Colheita das amostras

• Amostras múltiplas

• Intermitência da passagem de certos parasitos a partir doshospedeiros• Cistos de Giardia duodenalis: 2 a 3 até 7 a 8 dias

• Distribuição não uniforme dos ovos de helmintos• Enterobius vermicularis: liberação esporádica

• Estágios dos protozoários• E. histolytica (colite amebiana): trofozoítos mais numerosos na superfície do

que no centro do bolo fecal

• Limitações das técnicas de diagnóstico

18

Colheita das amostras

• Amostras múltiplas

• Esquemas mais utilizados (antes de iniciar o tratamento):

• Após o tratamento:

• Protozoários: três a quatro semanas

• Helmintos: uma a duas semanas; tênia – cinco a seis semanas

Três amostras em dias alternadosNão ultrapassar 10 dias

Seis amostras em dias alternadosNão ultrapassar 14 dias

19

Colheita das amostras

• Fezes emitidas com o uso de laxantes

• Apenas com solicitação médica: amebíase, giardiose, estrongiloidíase

• Indicação: série de exames negativa

• Laxantes salinos: menos danos morfológicos aos parasitos• Fosfato de sódio, sulfato de sódio tamponado

• Fezes induzidas por purgativos devem ser totalmente colhidas elevadas imediatamente ao laboratório

• Indicada para clínicas e hospitais

20

Colheita das amostras

• Estabilidade das amostras

Amostras líquidas

• Análise em 30 minutos

Amostras pastosas

• 1 hora após a evacuação

Amostras sólidas

• 24 horas após excreção

Quando não for possível: material deverá ser

preservado

21

Preservação da amostra fecal

• Amostras que não são entregues imediatamente ao laboratório

• Refrigeração: 3oC a 5oC (temporariamente)• Recipientes hermeticamente fechados

• Ovos e larvas de helmintos e cistos: viáveis por vários dias

• Larvas de Strongyloides stercoralis e ancilostomatídeos: podem sofreralterações

22

Preservação da amostra fecal

• Uso de conservantes

• Três partes de conservante para uma parte de fezes

Não precisam ser enviadas imediatamente ao laboratório

Não necessitam de manutenção em baixas temperaturas

Análise não precisa ser feita imediatamente

23

Preservação da amostra fecal

• Conservantes mais usados

• Solução de formaldeído

• Concentrações:• 5%: cistos de protozoários

• 10%: oocistos de coccídios, esporos de microsporídios, ovos e larvas dehelmintos

• Neutra: mais eficaz na manutenção das características morfológicas: soluçãode formaldeído tamponada com fosfato de sódio

• Manutenção da amostra: até 1 mês

24

Preservação da amostra fecal

• Formaldeído a 5% e 10% (tamponada e não tamponada)

- Excelente preservador deamostras fecais (cistos, oocistos,esporos, ovos e larvas de helmintos)

- Fácil preparação e longo períodode validade

- Organismos são fixados entre 2 e 4horas (Exceção: A. lumbricoides)

- Não preserva os trofozoítos deprotozoários

- Morfologia dos parasitos não épreservada adequadamente para ascolorações permanentes

Van

tage

ns

Desvan

tagens

25

Preservação da amostra fecal

• Conservantes mais usados

• Fixador de Schaudinn

• Fezes frescas ou amostras da superfície da mucosa intestinal

• Preparações de esfregaços permanentes: protozoários intestinais

• Contém cloreto de mercúrio II na sua fórmula: extremamente tóxicoao homem e ao meio ambiente

26

Preservação da amostra fecal

• Fixador de Schaudinn

- Preservação de fezes frescas ouamostras da superfície da mucosaintestinal

- Excelente preservação detrofozoítos e cistos de protozoários

- Ótimos resultados de coloração:hematoxilina férrica ou tricrômico

- Não recomendado para técnicas deconcentração

- Cloreto de mercúrio II

- Fraca capacidade de adesão àlâmina quando usado para amostraslíquidas ou mucóides

Van

tage

ns

Desvan

tagens

27

Preservação da amostra fecal

• Conservantes mais usados

• Álcool Polivinílico (APV)

• Resina solúvel em água incorporada ao fixador de Schaudinn

• Pó que serve como um adesivo para o material fecal na lâmina demicroscopia

28

Preservação da amostra fecal

• Fixador APV

- Excelente preservador detrofozoítos e cistos para coloraçãode esfregaços permanentes

- Adesão das amostras fecais àslâminas

- Longo período de validade (6meses a 1 ano)

- Organismos fixados em uma ouduas horas

- Contém o cloreto de mercúrio II

- Difícil preparação no laboratório

- Não indicado para técnicas deconcentração

- Ovos de T. trichiura e cistos deGiardia não são facilmenteconcentrados

- Material não pode ser usado emtestes imunológicos

Van

tage

ns

Desvan

tagens

29

Preservação da amostra fecal

• Conservantes mais usados

• MIF = Mertiolato (mercuriocromo), Iodo e Formol

• Ovos ou larvas de helmintos, cistos e oocistos de protozoários

• Exame direto a fresco: imediato ou após várias semanas

30

Preservação da amostra fecal

• Fixador MIF

- Exame direto a fresco: reagentespreservam e coramsimultaneamente

- Fácil preparação

- Longo período de validade

- Estudos epidemiológicos emcampo

- Organismos fixados entre uma deduas horas

- Morfologia dos parasitos é alteradanos esfregaços permanentementecoradosV

anta

gen

sD

esvantagen

s

31

Preservação da amostra fecal

• Conservantes mais usados• SAF = Acetato de Sódio-Ácido Acético-Formaldeído

• Acetato de sódio: tampão

• Bom rendimento: cistos, oocistos e trofozoítos• Trofozoítos de Giardia e amebas (não se conservam em MIF ou formol 10%)

• Fezes formadas e diarreicas

• Substitui fixador de Schaudinn (bicloreto de mercúrio): extremamentetóxico

32

Preservação da amostra fecal

• Fixador SAF

- Concentração e preparação deesfregaços permanentementecorados

- Fácil preparação

- Longo período de validade

- Excelentes resultados de coloração(Hematoxilina férrica)

- Organismos fixados entre 1 e 2horas

- Requer uso de albumina fixadorapara a adesão da amostras à lâmina

- Resultados regulares de coloraçãoquando corados pelo tricrômico

Van

tage

ns

Desvan

tagens

33

Preservação da amostra fecal

• Coletores com preservantes

34

Preservação da amostra fecal

• Coletores com preservantes

TF-Test (Three Fecal Test)

35

Preservação da amostra fecal

• Coletores com preservantes

36

Preservação da amostra fecal

• Coletores com preservantes

37

Fase Analítica

Exame macroscópico

Exame microscópico

38

Exame Macroscópico

• Aspectos:• Consistência

• Odor

• Cor

• Presença ou ausência de:• Sangue, muco, pus, proglotes, vermes adultos, fragmentos de vermes ou

outras condições anormais

• Deve anteceder o exame microscópico

39

Formadas

Semi-formadas

Pastosas

Líquidas

Cistos

Trofozoítos

Ovos e larvas de helmintos: em todos os tipos de amostras fecais

mas dificilmente encontrados em amostras

líquidas

Exame Macroscópico

40

• Tamisação

• Vermes adultos: Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis,proglotes das tênias

• Vantagens: demonstração e colheita de pequenos helmintos,proglotes e escóleces.

• Identificação: ácido acético glacial ou Tinta da China (nanquim)

Exame Macroscópico

41

• Tamisação

Exame Macroscópico

PROGLOTE MADURA

- Órgãos reprodutores ♂

e ♀ bem desenvolvidos

PROGLOTE GRÁVIDA-Sem distinção dos órgãos

- Útero ramificado

Vermes Adultos(Ascaris lumbricoides,

Enterobius vermicularis)42

Exames Microscópicos

• Visualização:

• Ovos ou larvas de helmintos

• Cistos, oocistos ou trofozoítos de protozoários

• Processos de enriquecimento e coloração

• Métodos gerais: sedimentação espontânea e centrifugação

43

Exames Microscópicos

• Qualitativos: mais utilizados (presença de formas parasitárias)

• Quantitativos: contagem de ovos nas fezes – intensidade doparasitismo• Pouco utilizados: medicamentos antiparasitários levam em conta o peso

corporal e não a carga parasitária (Stoll-Hausheer e Kato-Katz*)

44

Exames Qualitativos

• Exame Direto a Fresco

• Simples e eficiente: trofozoítos vivos dos protozoários

• Solução salina a 0,85% (cloreto de sódio) e iodo

• Se uso da formalina: não precisa a solução salina

• Amostras não refrigeradas

Princípio: avaliar carga parasitária; diagnóstico rápido

• Movimentação de trofozoítos – com uso de solução salina

45

Exames Qualitativos

• Exame Direto a Fresco

Revisão de lâminas previamente negativas

46

Quantidade grande de

amostra fecal

• Exame Direto a Fresco

• Uso de colorações temporárias:• Núcleos dos trofozoítos de amebas, cistos

• Soluções indicadas: Iodo• Lugol (iodeto de potássio): diferentes concentrações

• Quensel: diferencia os núcleos de três gêneros de amebas• Entamoeba, Iodameba e Endolimax

• Sudan III, álcool etílico, azul de metileno e cloreto de cádmio

Exames Qualitativos

47

• Técnicas de concentração

• Objetivos:

Exames Qualitativos

Aumentar o número de cistos, oocistos e ovos oularvas na preparação

Eliminar a maioria dos detritos fecais

Apresentar os organismos em um estado inalterado:facilitar a identificação

48

• Técnicas de flutuação• Diferença de densidade específica: ovos de helmintos e cistos e

oocistos de protozoários e o material fecal

• Reagentes de alta densidade

• Ovos considerados pesados: Ascaris, Taenia, Schistosoma e Fasciola

Formas Densidade

Ovos e cistos 1,05 a 1,15 g/mL

Exames Qualitativos

49

• Técnicas de flutuação

- Formação na superfície dotubo de uma membrana claracom poucos detritos fecais

- Remoção seletiva de cistose ovos mesmo quandopresentes em pequenosnúmeros

- Alta densidade dosreagentes: colapso daparede dos ovos e cistos –observação deve ser feitaentre 10 e 20 minutos

Van

tage

ns:

D

esvantagen

s:

Exames Qualitativos

50

•Técnicas de flutuação• Flutuação em solução saturada de cloreto de sódio (d=1,20g/mL) =

Técnica de Willis

• Ovos com densidade específica baixa: ancilostomatídeos

• Não recomendado para ovos de trematódeos, E. vermicularis e A.

lumbricoides

• Cistos de protozoários: retração

Exames Qualitativos

51

•Técnicas de flutuação

Exames Qualitativos

• Coar / filtrar as fezes (fezes frescas)

• Homogeneização (Frasco de boca larga)

• Adição de Solução NaCl

• Homogeneização

• Adição de NaCl (Menisco positivo)

• Lamínula / 10 a 15 min

52

• Técnicas de flutuação• Outras soluções com o mesmo princípio da Técnica de Willis:

• Flutuação em solução saturada de sulfato de zinco (1,18 g/mL)

• Flutuação em sulfato de magnésio e Cloreto de sódio

Exames Qualitativos

53

• Centrífugo – flutuação em solução saturada de sulfato dezinco (d=1,18 g/mL) = Técnica de Faust

• Cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos

• Não é adequada para ovos de trematódeos, cestódeos e A.lumbricoides (inférteis)

• Pode ser usada para fezes preservadas em formaldeído (5% ou 10%),SAF e APV (densidade deve ser ajustada para 1,20 g/mL)

Exames Qualitativos

54

Exames QualitativosRemover o

sobrenadanteSolução de

sulfato de zinco

Recolher a película superficial com alça

650 x g

2 a 3 min650 x g

55

• Técnicas de sedimentação• Objetivos:

• Aumento do número de ovos, larvas, cistos• Separação das gorduras e óleos

• Gravidade (espontânea) ou centrifugação (MIFC)• Formas retidas no fundo do tubo• Detritos suspensos na superfície

• Desvantagem: grande quantidade de detritos fecais

Exames Qualitativos

56

• Técnicas de sedimentação

• Sedimentação espontânea = Método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

• Fundamento: sedimentação espontânea em água• Ovos, larvas e cistos

• Vantagens: necessidade mínima de vidraria, dispensável o uso dereagentes e da centrifugação

• Desvantagem: grande quantidade de detritos, dificulta a leitura daslâminas

Exames Qualitativos

57

• Técnicas de sedimentação

• Sedimentação espontânea = Método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)

Exames Qualitativos

58

• Técnicas de sedimentação• Centrífugo-sedimentação pela formalina-éter ou Centrífugo-Sedimentação

pela formalina-acetato de etila• Cistos de protozoários*

• ovos e larvas de helmintos

• pH da formalina pode afetar a recuperação:

• pH neutro é mais eficaz

Exames Qualitativos

pH Parasito

10 Ovos de Ascaris lumbricoides e S. japonicum

Entre 4,0 e 7,0 Ancislostomatídeos

59

Exames Qualitativos

1 a 2g de fezes em água / filtrar

Completar o tubo com água

Centrifugar650 x g / 1 min

Centrifugar500 x g / 1 min

Ressuspender com formalina (10%/pH neutro)

Repouso por 5 minAdicionar 3 mL de éter (ou acetato de

etila)

Fechar o tuboAgitar vigorosamente (30s)

Analisar o sedimento

60

• Centrífugo-sedimentação pela formalina-éter ou Centrífugo-Sedimentação pela formalina-acetato de etila

Exames Qualitativos

Restos fecais e gordura

Éter

Formalina

Sedimento

61

• Métodos específicos para coccídios

• Centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose = técnica deSheather• Oocistos de Cryptosporidium spp.

• Centrífugo-sedimentação pelo Formaldeído-Éter modificado

• Oocistos de Cryptosporidium spp. e Cyclospora cayetanensis

Exames Qualitativos

63

• Métodos específicos para coccídios

• Coloração de Ziehl-Neelsen• Coloração rosa ou vermelho / Fundo da preparação: azul

Exames Qualitativos

64

Exames Quantitativos

• Produção de ovos X carga parasitária

Ascaris lumbricoides

Trichuris trichiura

Ancilostomatídeos

• Necator americanus

• Ancylostoma duodenale

Schistosoma mansoni

65

Exames Quantitativos

• Estimativa da contagem dos ovos varia em relação direta com a acuidadedo procedimento

• Intensidade da infecção: número de ovos encontrados

• OPG = ovos por grama: índice de densidade dos ovos nas fezes

• OPD = ovos por dia: multiplicação do OPG pelo peso total (g) do materialfecal de 24 horas

OPD = OPG x g

• OPDPF = ovos por dia por fêmeaOPDPF = OPD ÷ número de vermes

66

Exames Quantitativos

• Método de Kato-Katz

• Ovos de helmintos• Não é indicado para protozoários e larvas de helmintos

• Vantagem: quantidade significativa de fezes – 50 a 60 mg

• Lamínulas de celofane: glicerina e solução de verde malaquita• Melhora a visualização da lâmina

• Torna os ovos mais visíveis

• Necessidade de amostras frescas ou refrigeradas

67

Exames Quantitativos

• Método de Kato-Katz

68

Exames Quantitativos

• Método de Kato-Katz

Ovo de Schistosoma mansoni visto em exame de fezes pelo Kato-Katz 69

• Não existe método capaz de diagnosticar ao mesmo tempo todas asformas parasitárias

• Mais gerais: sedimentação espontânea e centrifugação

• Rotina do EPF:• Diagnóstico de vários parasitos intestinais

• Fácil execução e baixo custo

• Importante interação entre médico e laboratório: execução dométodo mais adequado a cada situação

Escolha do Método

70

• Garantia de qualidade no EPF:

• Algumas espécies são evidenciadas apenas por técnicas especiais

• Apenas um exame isolado com resultado negativo não deve serconclusivo

• Produção de cistos, ovos e larvas não é uniforme ao longo do dia

Escolha do Método

71

PARASITOS DO SANGUE E TECIDOS

72

Principais parasitos

Trypanosoma cruzi

Fora das hemácias

Plasmodiumsp.

P. vivax

P. falciparum

P. Malariae

Hemácias

Leishmania sp.

Fora das hemácias

Filárias

Wuchereriabancrofti

Mansonellaozzardi

Fora das hemácias

73

• Estirados e Gota espessa

• Sangue total colhido com anticoagulante

• Sedimento de métodos de concentração: Trypanosoma sp. emicrofilárias

• Apenas uma amostra de sangue não é suficiente para o diagnóstico:• Colher entre 6 e 12 horas (3 a 5 dias) para que não haja suspeita de infecção

Esfregaços sanguíneos

74

• Estudo das hemácias, contagem de leucócitos

• Diagnóstico e estudo diferencial de Plasmodium sp. (alta densidade)

Esfregaço Estirado

75

Esfregaço Estirado

Lâmina corada de boa qualidade76

Esfregaço Estirado

77

• Quantidades relativamente grandes de sangue em pequena área

• Coleta:

Esfregaço Espesso (Gota Espessa)

78

Permite detectar a infecção mesmo com parasitemias leves

Esfregaço Espesso (Gota Espessa)

79

Indicada para inquéritos epidemiológicos

Combinação de esfregaços

80

Coloração de esfregaços sanguíneos

Giemsa

- Diferenciação nuclear e/ou citoplasmática (plaquetas,eritrócitos, leucócitos e parasitos)

- Esfregaços estirados (fixados com álcool metílico)

- Gota espessa

Coloração de Leishman

- Esfregaços estirados

- Eosina-azul-de-metileno

81

• Centrifugação do sangue (Creme Leucocitário)

• Leishmania donovani, Trypanosoma sp. e microfilárias• Sangue colhido com EDTA, heparina e/ou citrato de sódio (anticoagulantes)

Concentração do sangue

Esfregaço estirado – pode ser corado

82

• Centrifugação do Micro-Hematócrito

• Utilização de tubos capilares

• Diagnóstico rápido da malária e Doença de Chagas (baixa parasitemia)

Concentração do sangue

83

IMUNODIAGNÓSTICO

84

• Toxoplasmose

• Doença de Chagas (fase crônica)

• Abscesso amebiano

• Leishmaniose visceral

• Esquistossomose (fase crônica)

• Cisticercose

• Hidatidose

• Larva migrans visceral (toxocaríase)

Considerações Gerais

Grande importância da detecção

de anticorpos

85

• Colheita da amostra - depende do sítio de infecção do parasito:• Soro, líquor, urina, fezes, tecidos

• Importância de verificação dos antígenos:

• Imunodiagnóstico

• Interpretação da imunopatologia

• Quantificação de diferentes respostas imunológicas do hospedeiro

• Avaliação do potencial de vacinas

Considerações Gerais

86

• Técnicas que não usam marcadores:

• Detectam / quantificam as consequências da ligação Ag - Ac• Reações de Precipitação• Reações de Aglutinação• Reação de Fixação do Complemento

• Técnicas que usam marcadores:

• Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac• ELISA (Enzyme-liked Immunosorbent Assay)• Imunofluorescência (Direta e Indireta)

Considerações Gerais

87

• Quantificação de precipitados formados pela reação Ag-Ac

• Proporções adequadas de Ag-Ac

• Proporção ideal: zona de

Equivalência

• Atualmente:

Emprego de espectrofotômetros

Reações de Precipitação

Antígenos(solúveis)

Anticorpos

Zona de equivalência: ppt visível

88

• Exemplos:

• Imunodifusão radial dupla

• Imunodifusão radial simples

• Imunoeletroforese

• Imunofixação

Reações de Precipitação

89

• Componente conhecido (Ag ou Ac): ligado à superfície decélulas/partículas – facilita a visualização

• Exemplos:

• Reação de Aglutinação Direta

• Reação de Aglutinação Indireta ou Passiva

• Reação de Hemaglutinação

Reações de Aglutinação

90

• Detecção de anticorpos específicos

• Reconhecimento de anticorpos na superfície dos eritrócitos –aglutinação

• Direta: determinantes antigênicos fazem parte da própria hemácia

• Indireta: hemácias são suporte para antígenos que são adsorvidos àsuperfície

Reações de Hemaglutinação

91

Reações de Hemaglutinação

Hemaglutinação Direta

92

Hemaglutinação Indireta

• Doença de Chagas: Hemaglutinação Indireta

Reações de Hemaglutinação

93

• Detectar Ac fixadores do complemento

• Ac só fixam complemento após a interação com Ag específico

• Etapas:

• 1ª: Soro + extrato antigênico solúvel e complemento

• 2ª: Sistema hemolítico para detectar se complemento está livre ounão

Reação de Fixação do Complemento

94

Reação de Fixação do Complemento

95

Soro + extrato antigênico solúvel e

complemento

Adição do complemento

Adição de células indicadoras

• Enzyme-liked Immunosorbent Assay

• Elevada sensibilidade, especificidade, rapidez e baixo custo

• Marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera suacor: diferenciação entre positivo e negativo

ELISA

96

ELISA

97

• Marcação do antígeno ou do anticorpo com fluorocromos

• Direta: usa anticorpo antígeno-específico marcado com substânciafluorescente

• Indireta: detecção de anticorpos dirigidos contra alvo antigênicoespecífico fixado em uma lâmina• Referência na sorologia de muitas parasitoses: toxoplasmose, Doença de

Chagas e malária

Imunofluorescência

98

Direta

Imunofluorescência

Formas amastigotas de Leishmania em esfregaço de aspirado de linfonodo poplíteo

de cão naturalmente acometido por leishmaniose visceral, marcadas pelo anticorpo policlonal anti-Leishmania

conjugado com fluoresceína (Laurenti, 2009)

99

Imunofluorescência

IndiretaOocistos de

Cryptosporidium sp. oocistos (setas

amarelas)

Cistos de Giardiaspp. (setas vermelhas)

Kit para imunofluorescência 100

BIOLOGIA MOLECULAR

101

• Adoção de tecnologias de análise de ácidos nucléicos

• Vantagens: alta sensibilidade e especificidade

• PCR = Polymerase Chain Reaction• Amplificação exponencial in vitro de pequenas quantidades de DNA

• Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada

• A localização é feita pelos primers

Considerações Gerais

102

• Extração de DNA e RNA• Sangue, pele, músculos

• Kits comerciais ou fenol / clorofórmio (tóxico)

Reação em Cadeia da Polimerase

103

• Preparo da PCR

Reação em Cadeia da Polimerase

104

• PCR consiste de três etapas principais:

Reação em Cadeia da Polimerase

105

• Visualização dos resultados:

Reação em Cadeia da Polimerase

106

Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

IDENTIFICAÇÃO HISTOLÓGICA

107

Protocolo Geral

108

Fixação Processamento Corte

Coloração (Histoquímica e

Imuno-histoquímica)

Montagem

Lâminas histologia

109

Granuloma hepático devido a Schistosoma mansoni Amastigotas de T. cruzi em tecido cardíaco