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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOMÉSTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
MICROBIOLÓGICA DE KEFIR DE LEITE LIOFILIZADO
ELIZANDRA DOS SANTOS SILVA
Recife
2017
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOMÉSTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
ELIZANDRA DOS SANTOS SILVA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
MICROBIOLÓGICA DE KEFIR DE LEITE LIOFILIZADO
ORIENTADORA: CELIANE GOMES MAIA DA SILVA
CO-ORIENTADORAS: ERILANE DE CASTRO LIMA MACHADO
AMANDA RAFAELA CARNEIRO DE MESQUITA
Recife
2017
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como requisito para obtenção do Grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE Nome da Biblioteca, Recife-PE, Brasil
S586d Silva, Elizandra dos Santos Desenvolvimento e caracterização físico-química e microbiológica de kefir de leite liofilizado / Elizandra dos Santos Silva. – 2017. 120 f. : il. Orientadora: Celiane Gomes Maia da Silva. Coorientadores: Erilane de Castro Lima Machado e Amanda Rafaela Carneiro de Mesquita. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Recife, BR-PE, 2017. Inclui referências, anexo(S) e apêndice(s). 1. Alimentos Funcionais 2. Desidratação 3. Maltodextrina 4. Probióticos 5. Sacarose I. Silva, Celiane Gomes Maia da, orient. II. Machado, Erilane de Castro Lima, coorient. III. Mesquita, Amanda Rafaela Carneiro de, coorient. IV. Título CDD 664
II
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DOMÉSTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
MICROBIOLÓGICA DE KEFIR DE LEITE LIOFILIZADO
Elizandra dos Santos Silva
Esta dissertação foi julgada para obtenção do título de Mestre em Ciência e
Tecnologia de Alimentos e aprovada em 29/08/2017 pelo Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimento em sua forma final.
Banca Examinadora:
_______________________________________________________
Profª Drª Thayza Christina Montenegro Stamford
Universidade Federal de Pernambuco
_______________________________________________________
Profª Drª Silvana Magalhães Salgado
Universidade Federal de Pernambuco
Prof Dr Paulo Roberto Campagnoli de Oliveira Filho
Universidade Federal Rural de Pernambuco
III
À Deus que com amor eterno me amou
e com benignidade me atraiu e, tem me
sustentado dia após dia com Sua Graça,
Bondade e Fidelidade sem fim.
IV
AGRADECIMENTOS
Ao meu amor maior, Jesus, que nunca desiste de mim, nunca me abandona
e me envolve em Seus braços de amor quando forças não tenho para continuar a
árdua jornada da vida. Senhor, sou tão pequena diante da Tua grandeza. Sem ti eu
não sei o que seria de mim e certamente não teria chegado até aqui. Obrigada por
todos os dias manifestar o Teu poder na fraqueza do meu ser. Tu és o meu tudo e
para Ti, por Ti e por meio de Ti são todas as coisas, te amo!
À minha mãe Elza Marcolino por todo amor, apoio (em todos os sentidos),
incentivo, palavras de encorajamento, por acreditar em mim e se fazer presente
sempre que possível, sendo um verdadeiro abrigo e porto seguro, tão essencial
para que eu não me deixasse levar pelas dificuldades encontradas pelo caminho
que tanto insistiram para que eu parasse. Mãe, obrigada por me suportar, mesmo
nos meus dias de maior estresse, simplesmente não tenho palavras para agradecer
e expressar sua importância não só na conclusão deste trabalho, mas, na minha
vida como um todo, te amo muito!
Ao meu pai Edesio (in memoriam) que embora não tenha acompanhado
minha trajetória acadêmica, sempre fez questão que a minha educação, os meus
estudos fossem uma prioridade. Pai, os anos, determinados por Deus, para que
desfrutássemos da companhia um do outro foram essenciais para a formação do
meu caráter e da mulher que hoje sou. O senhor, mesmo com seu jeito tímido e de
poucas palavras, demonstrava a cada dia, de forma prática, o seu amor. Obrigada
por todo amor, carinho, apoio e incentivo. E como sempre falo: Os dias passam, os
meses passam, os anos passam, mas a saudade e o meu amor pelo senhor nunca
irão passar...
À minha querida família, em especial aos meus avós (Maria Júlia e Antônio
Marcolino), sou muito abençoada e privilegiada por poder conviver com vocês,
poder desfrutar do carinho, do amor, do apoio e do incentivo de vocês até hoje.
Obrigada por tudo, amo demais vocês. Aos meus tios, tias, primos e primas por
nunca deixarem de me apoiar, sempre demonstrando um amor prático, incentivo
mais do que especial e das mais diversas formas para continuar e chegar até aqui,
amo vocês!
Aos amigos por sempre acreditarem em mim até quando eu mesma não
acreditava, vocês foram e são muito importantes para mim. O amor, o carinho,
V
apoio e incentivo de vocês me impulsionaram a prosseguir e a acreditar que eu
conseguiria chegar até aqui. Amo vocês!
À Amanda Souto Maior, Índina Mendes e Fátima Guimarães, amigas tão
preciosas, presentes de Deus em minha vida que tive o privilégio de encontrar ainda
na graduação e cuja amizade não acabou com o término da graduação, mas
levamos e levaremos por toda a vida. Amigas, vocês são verdadeiras pérolas
preciosas que estão sempre ao meu lado e tanto me apoiam em todas as áreas da
minha vida. É um privilégio compartilhar a minha vida com vocês. Obrigada pelo
amor, carinho, apoio e incentivo. Amo vocês!
À Elizângela Ferreira porque como você mesma diz: com você eu consigo
ser eu rsrsrsrs... Minha amiga-irmã, não poderia deixar de escrever para ti, você
que sempre acompanha meus altos e baixos, que independente das circunstâncias
está sempre ali para me apoiar, estender as mãos e não permitir que as lágrimas
me impeçam de enxergar aquilo que Deus já fez e tem feito por mim e, sobretudo,
não me deixas esquecer que as promessas de Deus para minha vida irão se
cumprir. Obrigada por não esquecer de mim e, por todos os dias, se fazer presente
em minha vida de alguma forma. O que seria de Elizandra sem Elizângela? És
muito especial para mim e tens uma grande parcela neste trabalho, você que foi a
primeira a saber que eu havia passado no processo seletivo e nunca deixou de
acreditar em mim, sempre fez questão de estar ao meu lado apoiando e
incentivando para que eu não me perdesse pelo caminho, mas que com luta,
trabalho e dedicação eu concluísse mais essa etapa em minha vida. Obrigada por
tudo! Amo você!
À Íris Luna por ter sido não só colega de turma, de laboratório e “irmã de
orientação”, mas, sobretudo, por ter se tornado uma amiga com quem pude
compartilhar alegrias, tristezas, momentos bobos e de seriedade. Obrigada por
sempre me ouvir e me incentivar quando forças já não tinha para continuar, foi um
grande presente de Deus poder te conhecer, aprender e crescer com você,
caminhar com você a árdua jornada do mestrado e, que outras jornadas, melhores
e maiores, venham. Obrigada por tudo!
Aos colegas de turma (Eron, Rodrigo, Saulo, Yasodhara, Gláucia e Marcella)
que juntos desbravamos novos caminhos e enfrentamos tantos altos e baixos.
Obrigada pela companhia, pelo apoio, por cada palavra de ânimo e incentivo, cada
VI
abraço nos momentos mais difíceis. Foi uma honra fazer parte desta turma. Nos
encontramos nos corredores da vida...
Aos companheiros de laboratório (Nathália Barbosa, Marcony Júnior e
Michele Barreto), obrigada pela companhia, pela força, pelo apoio, pelo incentivo,
pela torcida que tanto me impulsionou a prosseguir e acreditar que era possível
transformar a repetição de uma análise que não deu certo em bons resultados!
Aos técnicos dos laboratórios da UFPE-CAV: Gabriel Locatelli que desde
minha graduação tem participado da minha trajetória nos laboratórios da vida...
Gabriel, obrigada por todo suporte e dicas tão preciosas. Sílvio de Assis, obrigada
pelas dicas e ajustes na metodologia físico-química.
À Jaqueline Ferreira por todo suporte, até mesmo fora do horário. Obrigada
pelas dicas, pela ajuda, por sempre abraçar as novas ideias, métodos diferentes e
adaptações que, muitas vezes, eu levava para o laboratório e era sempre um
desafio rsrsrs (VALEU A PENA!). Jaque, você é excepcional e foi muito mais que
técnica do laboratório, você foi fundamental para me fazer acreditar que os
resultados viriam e este dia chegaria. Obrigada mesmo por tudo o que você fez por
mim, não só em relação as análises, mas por toda sensibilidade e preocupação
para comigo quanto pessoa.
Aos professores José do Egito de Paiva, Inaldo Galdino de Menezes e
Edleide Pires do laboratório de análise de alimentos da Departamento de
Tecnologia Rural (DTR) da UFRPE por terem aberto as portas do laboratório e
permitido que eu fizesse uso das instalações. As estagiárias do laboratório por toda
ajuda no preparo de materiais paras as análises.
À Amanda Mesquita que foi um verdadeiro anjo, abriu minha mente, trouxe
luz para solucionar os questionamentos que surgiram, e despertou a paixão e o
desejo pelo mundo da microbiologia que estavam adormecidos em mim. Amanda,
o que seria de mim com todas aquelas colônias sem você? Obrigada por toda ajuda,
suporte, dicas, ideias, disposição e incentivo em cada análise. Obrigada por cada
vibração com os resultados. Você foi fundamental para que eu tivesse forças para
concluir este trabalho! Muito obrigada!
À Ana Albertina que tive o prazer de conhecer nesta trajetória do mestrado
e foi tão graciosa e disposta a ajudar na identificação dos isolados.
À Erilane Machado por toda preocupação, disposição e ajuda ao longo de
todo o desenvolvimento deste estudo. Obrigada pela ideia desafiadora em trabalhar
VII
com o Kefir, foi um grande privilégio e uma caminhada de muito aprendizado para
mim. As dificuldades e adversidades foram muitas e, de diferentes formas, se
apresentaram ao longo do caminho, mas você sempre me apoiou, abriu portas de
laboratórios, correu atrás de materiais para que as análises pudessem ser
realizadas e sempre esteve acessível para sanar minhas dúvidas. O meu muito
obrigada!
À Celiane Maia pela compreensão em todos os momentos, sobretudo
quando a saúde me faltou e as dificuldades para prosseguir aumentaram. Obrigada
pelo compartilhar de conhecimentos, pelo suporte, pelo apoio e pelos
esclarecimentos e dicas no desenvolvimento e conclusão deste estudo.
À UFRPE e a UFPE pela formação acadêmica e científica, pelos recursos
físicos, materiais e conhecimentos transmitidos por cada profissional, seja do corpo
docente, seja do corpo técnico, seja do operacional.
À CAPES pelo apoio financeiro que viabilizou este estudo.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para que eu pudesse
chegar até aqui!
MUITO OBRIGADA!
VIII
“O êxito da vida não se mede pelo
caminho que você conquistou, mas
pelas dificuldades que superou no
caminho. ”
(Abraham Lincoln)
IX
RESUMO
O Kefir, bebida fermentada exclusivamente por grãos de Kefir, é constituído por
uma colônia de micro-organismos simbióticos imersos em uma matriz de
polissacarídeo e proteínas, que apresenta potencial probiótico. No entanto, devido
ao grau de perecibilidade da bebida e instabilidade dos micro-organismos,
procedimentos de secagem vêm sendo empregados, como a liofilização, visando o
aumento da estabilidade, maior flexibilidade para consumo e manutenção da
viabilidade celular. Todavia, o congelamento que antecede a liofilização é uma
etapa crítica, o que leva a necessidade de utilizar crioprotetores para evitar a
lioinjúria. Objetivou-se neste estudo desenvolver e caracterizar físico-química e
microbiologicamente Kefir de leite liofilizado, avaliando o efeito crioprotetor de
maltodextrina e sacarose na manutenção da viabilidade celular. O processo de
fermentação sem agitação, durante 24h, com a proporção de 5% de grãos de Kefir
foi realizado em leite UHT e em leite pasteurizado, e as bebidas obtidas foram
analisadas quanto ao pH, acidez, atividade de água, sólidos solúveis totais, lactose,
umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos. O perfil microbiológico foi
traçado pela contagem total de bactérias e leveduras e isolamento e identificação
dos gêneros Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Acetobacter spp.,
Enterococcus spp. e Candida spp. A bebida fermentada em leite pasteurizado
apresentou melhor composição nutricional e maior concentração celular, sendo
este submetido a liofilização por planejamento fatorial 22 crioprotegido por
maltodextrina (0-8%) e sacarose (0-10%). Ao final da liofilização, o ensaio com 10%
de sacarose apresentou maior concentração celular, com taxa de sobrevivência
celular de bactérias de 97,71% em MRS e 96,68% em M17 e 89,63% para
leveduras em YGC. A sobrevivência das bactérias isoladas dos pós liofilizados, em
escala decrescente, foi de Enterococcus durans, Acetobacter spp., Bifidobacterium
spp. e Lactobacillus spp. As concentrações de maltodextrina testadas foram
indiferentes na proteção dos micro-organismos, com resultados semelhantes ao
ensaio sem crioprotetor. Conclui-se que, formulados liofilizados de Kefir
crioprotegido com sacarose, nas condições de desenvolvimento deste trabalho,
apresenta concentração celular adequada e potencial efeito probiótico.
Palavras-chaves: Alimentos Funcionais. Desidratação. Maltodextrina. Probióticos.
Sacarose.
X
ABSTRACT
Kefir is a drink fermented exclusive by grains of Kefir, it is constituted by a colony of
symbiotic microorganism immerses in a matrix of polysaccharides and proteins, that
presents probiotic potential. Meanwhile, due to the high degree of perishability of
the drink and instability of the microorganisms, drying procedures are being used,
as lyophilization, to intend stability improvements, better flexibility for consumption
and maintenance of cell viability. Otherwise, the freezing process before the
lyophilization is a critic phase, which leads to the necessity to use cryoprotections
to avoid the injury cell. The objective of this study was to develop a characterized
physical-chemical e microbiologically Kefir of milk lyophilized, evaluating the effect
of the cryoprotections of maltodextrin and sucrose in the maintenance of cell
viability. The process of fermentation without agitation, among 24 hours, with the
proportion of 5% grains of Kefir was realized in UHT milk and in pasteurized milk,
the drinks obtained were analyzed in pH, acidity, activity on water, total soluble
solids, lactose, moisture, ashes, proteins, lipids and carbohydrates. The
microbiological profile of the samples was made by the total counting of bacteria
and yeast, isolation and identification of the genders Lactobacillus, Bifidobacterium,
Acetobacter, Enterococcus and Candida. The drink fermented in pasteurized milk
presented better nutritional composition and higher cell concentration, being
submitted to lyophilization by factorial planning 22 Cryoprotection by maltodextrin
(0-8%) and sucrose (0-10%). At the endo of lyophilization process, the analysis with
10% of sucrose presented higher cell concentration, with survival tax of bacteria
97,71% in MRS, 96,68% in M17 and 89,63% for yeast in YGC. The survival of
isolated bacteria after lyophilization, in decreasing scale, was Enterococcus durans,
Acetobacter spp., Bifidobacterium spp. e Lactobacillus spp. The concentration of
maltodextrin tested were indifferent in the protection of microorganism, with the
same results with the analysis without cryoprotection. This leads to, formulated
lyophilized of Kefir cryoprotected with sucrose, in this work conditions of
development, presents adequate cell concentration and potential probiotic effect.
Keywords: Functional Food. Dehydration. Maltodextrin. Probiotics. Sucrose.
XI
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 – Mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos.......................24
Figura 2 – Grãos de Kefir. Retângulo preto corresponde a 1cm.............................27
Figura 3 – Estrutura do Kefiran...............................................................................28
Figura 4 – Homofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise..........39
Figura 5 – Heterofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise.........40
Figura 6 – Metabolismo dos micro-organismos durante a fermentação de Kefir....41
Figura 7 - Diagrama esquemático dos efeitos fisiológicos benéficos do Kefir na
saúde humana........................................................................................................42
Figura 8 – Diagrama de fases da água mostrando a sublimação do gelo...............49
Figura 9 – Liofilizador em funcionamento com bomba de vácuo............................50
XII
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 – Micro-organismos empregados como probióticos.................................23
Tabela 2 – Composição físico-química do Kefir recomendada pela FAO/WHO
(2003) e pelo MAPA (2007)....................................................................................29
Tabela 3 – Espécies de micro-organismos encontrados no Kefir e nos grãos de
Kefir........................................................................................................................30
Tabela 4 – Composição microbiológica do Kefir recomendada pela FAO/WHO
(2003) e MAPA (2007)............................................................................................31
Tabela 5 – Características dos principais gêneros de bactérias ácido láticas......32
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
EPA – Ácido Eicosapentaenoico
DHA – Ácido Docosahexaenoico
FOS – Fruto-oligossacarídeo
AGCCs – Ácidos Graxos de Cadeia Curta
FAO – Food and Agriculture Organization
WHO – World Health Organization
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
UFC – Unidade Formadora de Colônia
BAL – Bactérias Ácido Lácticas
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
IgA – Imunoglubulina A
EPS – Exopolissacarídeos
EFSA – European Food Safety Authority
QPS – Qualified Presumption of Safety
BAA – Bactérias Ácido Acéticas
IFN-γ – Interferon γ
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
IL-10 – Isoleucina 10
DCV – Doença Cardiovascular
HDL-c – Colesterol - Lipoproteína de Alta Densidade
LDL-c – Colesterol - Lipoproteína de Baixa Densidade
TGF-α – Fator de Crescimento Transformante-α
TGF-β1 - Fator de Crescimento Transformante-β1
DMSO – Dimetilsulfóxido
Aw – Atividade de Água
TPF – Tripolifosfato de Sódio
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
MRS – Man, Rogosa & Sharpe
UHT – Ultra High Temperature
XIV
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................16
2 PROBLEMAS DE PESQUISA E HIPÓTESE.....................................................18
3 REVISÃO DA LITERATURA..............................................................................19
3.1 Alimentos funcionais........................................................................................19
3.1.1 Prebióticos....................................................................................................20
3.1.2 Probióticos....................................................................................................21
3.2 Kefir: definição e aspectos gerais....................................................................24
3.2.1 Composição dos grãos de Kefir....................................................................26
3.2.2 Composição química.....................................................................................27
3.2.3 Composição microbiológica..........................................................................29
3.2.3.1 Bactérias ácido láticas...............................................................................31
3.2.3.1.1 Gênero Lactobacillus..............................................................................33
3.2.3.1.2 Gênero Lactococcus...............................................................................34
3.2.3.1.3 Gênero Leuconostoc...............................................................................34
3.2.3.2 Leveduras..................................................................................................36
3.2.3.3 Bactérias ácido acéticas............................................................................37
3.2.4 Interação dos micro-organismos do Kefir durante a fermentação................38
3.2.5 Benefícios do Kefir na saúde humana..........................................................42
3.2.5.1 Atuação no trato gastrintestinal..................................................................42
3.2.5.2 Atuação no sistema imune.........................................................................43
3.2.5.3 Ação antibacteriana...................................................................................44
3.2.5.4 Ação hipocolesterolêmica..........................................................................45
3.2.5.5 Ação anticarcinogênica..............................................................................46
3.2.5.6 Ação do Kefir na intolerância a lactose......................................................47
3.3 Métodos de conservação de alimentos............................................................48
3.3.1 Liofilização....................................................................................................49
3.3.1.1 Liofilização na indústria de alimentos........................................................52
4 REFERÊNCIAS..................................................................................................55
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................68
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS..............................................................................111
APÊNDICE A.......................................................................................................112
APÊNDICE B.......................................................................................................113
XV
APÊNCIDE C.......................................................................................................114
APÊNCIDE D.......................................................................................................115
APÊNCIDE E.......................................................................................................116
APÊNCIDE F.......................................................................................................117
APÊNCIDE G.......................................................................................................118
APÊNDICE H.......................................................................................................119
ANEXO A.............................................................................................................120
16
1 INTRODUÇÃO
Desde a década de 70, o panorama da nutrição vem sofrendo alterações,
devido ao aumento do consumo de alimentos calóricos e de baixo valor nutricional,
através dos quais se tem uma inadequada ingestão de água, macronutrientes e
micronutrientes. Em consequência, há o surgimento das carências nutricionais e da
transição nutricional, na qual é observada um declínio da prevalência da
desnutrição em crianças e uma elevação da prevalência de sobrepeso/obesidade
em adultos (BATISTA FILHO; SOUZA; MIGLIOLI; SANTOS, 2008).
Como resposta a preocupação com a saúde, tem sido desenvolvido o hábito
de consumir alimentos que não apenas tenham qualidade sensorial e nutricional,
mas que ofereçam substâncias com funções fisiológicas e bioquímicas benéficas.
Estes são os chamados alimentos funcionais, cuja denominação foi utilizada pela
primeira vez na década de 80 pela legislação japonesa com o objetivo de
desenvolver alimentos saudáveis para uma população que envelhecia e
apresentava uma grande expectativa de vida (ANJO, 2004; CUPPARI, 2005;
GOMES, 2007; FRANÇA et al., 2010).
Dentro do grupo de alimentos funcionais, destacam-se os que possuem
micro-organismos probióticos em sua composição. Diferentes definições de
probiótios foram publicadas (PAKER, 1974; FULLER, 1989; CARNICÉ, 2006).
Entretanto, a definição aceita internacionalmente é que são micro-organismos vivos
que administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do
hospedeiro (FAO/WHO, 2001). Dentre estes destacam-se diversos gêneros:
Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp.,
Pediococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Saccharomyces spp.,
Kluyveromyces spp., Candida spp. (WITTHUHN et al., 2005; MAGALHÃES et al.,
2011; SAAD et al., 2013).
O Kefir é uma bebida fermentada probiótica composta por uma simbiose de
bactérias e leveduras envolvidas em uma matriz polissacarídica solúvel,
denominada Kefiran. O processo fermentativo do Kefir de leite ocorre,
exclusivamente, pelos grãos de Kefir em leite reconstituído a 20-25ºC durante 24h.
Após a fermentação, a bebida apresenta consistência cremosa e sabor ligeiramente
ácido (LOPITZ-OTSOA; REMENTERIA; ELGUEZBAL; GARAIZAR, 2006;
MAGALHÃES et al., 2011; KÖK-TAS; SEYDIM; ÖZER; GUZEL-SEYDIM, 2013).
Entretanto, por se tratar de micro-organismos vivos, alimentos probióticos
como o Kefir, são instáveis e para minimizar tal instabilidade e manter a viabilidade
celular, procedimentos de secagem têm sido utilizados por possibilitar o aumento
da estabilidade e da concentração, maior flexibilidade para o consumo e menor
custo de armazenamento e acondicionamento (SOUZA et al., 2011; PRISCO;
MURIELO, 2016).
A liofilização é o meio mais eficaz de se obter produtos desidratados com
alta qualidade sensorial e com boa viabilidade celular (ATALAR; DERVISOGLU,
2015). Entretanto, a etapa que antecede a liofilização consiste no congelamento da
amostra a baixas temperaturas, o que pode causar danos irreversíveis nas células
a serem desidratadas, por isso, faz-se necessário proteger a amostra com uso de
crioprotetores para minimizar os efeitos negativos do congelamento (AGUIAR et al.,
2012).
Um dos maiores desafios da criopreservação é realizar um congelamento
sem a formação de cristais de gelo no interior das células através da redução da
atividade de água (COSTA, 2010). Na criomicrobiologia, o glicerol é o principal
álcool utilizado que atua penetrando na membrana celular através da difusão
passiva. Todavia, alguns açúcares, como a sacarose, a maltose, a frutose e a
maltodextrina, têm se mostrado capazes de atuar como agentes crioprotetores ao
promoverem alterações na permeabilidade ao induzir o aumento da osmolaridade
do meio externo, gerando a passagem da água do meio interno da célula para o
externo. Além disso, os carboidratos promovem o aumento da transição vítrea que
ao tornar-se acima da temperatura de estocagem, a estabilidade e a vida de
prateleira dos produtos aumentam (KENNEDY, 2000; AGUIAR et al., 2012;).
Diante do que foi abordado, o objetivo deste estudo foi produzir e caracterizar
físico-química e microbiologicamente o Kefir de leite submetido a secagem por
liofilização e avaliar o efeito crioprotetor de maltodextrina e sacarose sobre a taxa
de sobrevivência celular dos micro-organismos naturais do Kefir.
18
2 PROBLEMAS DE PESQUISA E HIPÓTESE
É possível obter Kefir desidratado por liofilização com viabilidade celular
adequada para um produto probiótico e boa qualidade nutricional?
A incorporação de crioprotetor mantém a concentração de células viáveis em
Kefir desidrato por liofilização?
Formulados liofilizados de Kefir adicionado de crioprotetor apresentam uma
boa qualidade nutricional e uma concentração de células viáveis adequada para
serem empregados como probiótico, visando sua incorporação em alimentos.
19
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Alimentos Funcionais
Os alimentos funcionais estão em evidência no mundo inteiro a medida que
vem se tornando parte da dieta diária da população, acarretando em um mercado
industrial global de alimentos e bebidas funcionais de grande potencial, estimado
em US$ 192 bilhões em 2020. Entretanto, apesar do ritmo acelerado das indústrias
em desenvolvê-los, para atender as expectativas dos consumidores, as ideias e o
desenvolvimento destes produtos ainda é bastante desafiador, necessitando de
análises dos estudos existentes para identificar as áreas que necessitam de
melhorias a fim de contribuir com uma melhor compreensão da escolha e do
comportamento do consumidor (KAUR; SINGH, 2017).
O termo alimentos funcionais foi usado pela primeira vez no Japão, na
década de 80, como uma definição para alimentos enriquecidos com componentes
especiais que possuem efeitos fisiológicos positivos e, a partir de então, o consumo
destes passou a se espalhar por todo o mundo como resultado da busca por
alimentos com propriedades promotoras de saúde que não são comumente
encontradas nos alimentos convencionais (PAPPALARDO; LUSK, 2016).
As definições legais de alimento contemplam todas as substâncias ou
misturas de substâncias destinadas à ingestão por humanos, que tenham como
objetivo fornecer nutrientes ou outras substâncias necessárias para a formação,
manutenção e desenvolvimento normais do organismo, independente do seu grau
de processamento e de sua forma de apresentação. Já a alegação de propriedade
funcional é aquela relativa ao papel metabólico ou fisiológico que o nutriente ou não
nutriente tem no crescimento, desenvolvimento, manutenção e outras funções
normais do organismo humano (BRASIL, 2013).
De um modo geral, um alimento pode ser considerado funcional se for
demonstrado que o mesmo pode afetar beneficamente uma ou mais funções alvo
no organismo, além de possuir os adequados efeitos nutricionais, de maneira que
seja tanto relevante para o bem estar e a saúde quanto para a redução do risco de
uma doença (MORAES; COLLA, 2006). Vale salientar também que os chamados
alimentos funcionais não podem provocar alergias e não podem representar
nenhum risco à saúde, e suas alegações devem ser passíveis de comprovação
científica (GOMES, 2007). Entretanto, a RDC Nº 2 de 7 de janeiro de 2002, alerta
20
que "Gestantes, nutrizes e crianças somente devem consumir estes produtos sob
orientação de nutricionista ou médico".
Os alimentos funcionais podem incluir os alimentos naturais, como frutas e
vegetais, cujos componentes próprio acarretam em beneficios para a saúde; Grãos
integrais e fibras em pães e cereais e cálcio no leite (produtos alterados pela adição
destes); Leite fortificado com vitamina D e sucos de frutas suplementados com
vitamina C; Margarina com fitoesteróis, prebióticos e probióticos (produtos
enriquecidos); Ovos com aumento de omega-3 induzido pela alteração da
alimentação de frangos (KAUR; SINGH, 2017).
A legislação brasileira vigente, lista uma gama de nutrientes e não nutrientes
com propriedade funcionais, incluindo: os ácidos graxos (EPA e DHA), carotenoides
(licopeno, luteína e zeaxantina), fibras alimentares, beta glucana em farelo de
aveia, aveia em flocos e farinha de aveia, dextrina resistente, fruto-oligosacarídeo
(FOS), goma guar parcialmente hidrolisada, inulina, lactulose, polidextrose,
psillium, quitosana, fitoesteróis, polióis (manitol, xilitol, sorbitol), proteína de soja e
probióticos (BRASIL, 2016).
3.1.1 Prebióticos
Os prebióticos foram observados pela primeira vez nos anos 80, durante um
cultivo in vitro tendo como inóculo fezes humanas, onde japoneses perceberam que
certos oligossacarídeos não digeríveis (fundamentalmente Fruto-oligossacarídeos
- FOS) eram fermentados seletivamente por bifidobactérias e que estes tinham a
capacidade de estimular seu crescimento. Esta observação foi confirmada por
Gibson e Roberfroid em 1995 que propuseram a primeira definição de prebióticos
como sendo um ingrediente alimentar não digerível que afeta beneficamente o
hospedeiro ao estimular o crescimento e/ou atividade de um ou de um limitado
número de espécies bacterianas no colón, e que, portanto, melhora a saúde
(CORZO et al., 2015).
O conceito de prebióticos foi revisto e ampliado por Roberfroid et al. em 2010,
os quais afirmaram que os prebióticos são ingredientes que produzem uma
estimulação seletiva do crescimento e/ou atividade (s) de um ou de um número
limitado de gêneros/espécies de micro-organismos, em especial Lactobacillus e
Bifidobacterium, na microbiota intestinal conferindo benefícios para a saúde do
hospedeiro.
21
Prebióticos compreendem os oligossacarídeos não digeríveis, como fruto-
oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, lactulose e inulina. Por sua
composição, os prebióticos não podem ser absorvidos até atingirem o cólon, onde
são fermentados por micro-organismos em ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs)
e lactato. Estudos evidenciam que os prebióticos são capazes de aumentar a
produção de AGCCs, o que, por sua vez, modula a produção de citoquinas dentro
da mucosa intestinal, modificando a composição do intestino. Em um estudo em
humanos, ficou evidenciado que a administração de 10g de
transgalactooligossacarídeos é capaz de aumentar o número de bifidobactérias e
modificar o metabolismo da fermentação colônica da flora intestinal (PATEL;
DUPONT, 2015).
3.1.2 Probióticos
O termo probiótico tem origem grega e significa “para a vida”, ou seja, “a
favor da vida”, e foi citado pela primeira vez em 1965 por Lilly e Stillwell ao
descrever qualquer substância ou organismo que contribui para manter o equilíbrio
intestinal nos animais. Anos depois, em 1974, Paker definiu probiótico como relativo
a organismos e substâncias que contribuem para o equilíbrio microbiano intestinal.
No entanto, esta definição não é adequada uma vez que a palavra “substância”
poderia incluir suplementos tais como antibióticos, cuja definição é justamente o
contrário “contra a vida” (CARNICÉ, 2006).
Atualmente, a definição mais aceita é a que são micro-organismos vivos que
administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do
hospedeiro (FAO/WHO, 2001). E, Segundo a Resolução RDC n.º 2, de 7 de janeiro
de 2002, probióticos podem ser definidos como sendo micro-organismos vivos
capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos
à saúde do indivíduo (BRASIL, 2002).
A legislação vigente determina que os probióticos, obrigatoriamente, devem
comprovar a segurança de uso, previamente à comercialização e comprovar um
efeito fisiológico ou metabólico específico, que será comunicado por meio de uma
alegação de propriedade funcional ou de saúde (BRASIL, 2013).
Além disso, os probióticos devem atender a alguns critérios, tais como: ser
de origem humana, não ser patogênico por natureza, ser resistente a destruição
22
por processamentos tecnológicos, ser resistente a destruição por secreções
gástricas e pela bile, deve aderir-se ao epitélio intestinal, ser capaz de colonizar o
trato gastrointestinal, produzir substâncias antimicrobianas, modular as respostas
imunes, exercer influência em algumas atividades metabólicas humanas, como
assimilação do colesterol, produção de vitaminas, etc. (CARNICÉ, 2006; MORAES;
COLLA, 2006).
A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) (BRASIL, 2016)
preconiza que a comprovação da eficácia para efeitos funcionais de um produto
probiótico não deve estar baseada em quantidade mínima de micro-organismos
viáveis, mas, sim, em evidências científicas, construídas por meio de estudos
clínicos, randomizados, duplo-cego e placebo controlados cujos desfechos
demonstrem a relação proposta na alegação entre o consumo do produto e o efeito
funcional.
Uma vasta gama de alimentos tem sido enriquecida com probióticos para
serem possíveis portadores destes micro-organismos benéficos a serem colocados
no mercado. Principalmente pertencentes a bactérias lácticas (BAL), a maioria das
cepas probióticas (Tabela 1) comuns adicionados aos alimentos são pertencentes
a várias espécies de lactobacilos e bifidobactérias, mas também leveduras, como
a Saccharomyces cerevisiae, são utilizadas. Contudo, outros gêneros
(Enterococcus, Bacillus e Escherichia) incluem cepas reconhecidos como
probióticos (PRISCO; MURIELLO, 2016).
Os benefícios dos probióticos para a saúde é uma área de pesquisa intensiva
que, de acordo com os sítios alvo e mecanismos de ação podem ser distinguidos
em níveis intestinais e extra-intestinais. A nível intestinal, os probióticos têm
mostrado desempenhar um papel importante, por exemplo na manutenção da
microbiota intestinal normal, na proteção contra agentes patogênicos
gastrointestinais, na intolerância a lactose e na diarreia infantil. Por outro lado, entre
os efeitos extra-intestinais destaca-se a redução do nível de colesterol sérico e da
pressão arterial, redução da incidência de doenças urogenital e respiratórias e
prevenção de alguns tipos de câncer (PRISCO; MURIELLO, 2016).
Tabela 1 – Micro-organismos empregados como probióticos.
Lactobacillus Bifidobacterium Outras Bactérias
ácido láticas Outros
L. acidophilus L. casei
L. crispatus L. curvatus
L. delbrueckii L. farciminis L. fermentum
L. gasseri L. Johnsonii L. paracasei L. plantarum
L. reuteri L. rhamnosus
B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve
B. infantis B. lactis
B. longum B. thermophilum
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis Leuconostoc
mesenteroides Pediococcus acidilacticis
Streptococcus thermophillus
Stheptococcus diacetylactis
Streptococcus intermedius
Escherichia coli strain Nissle
Saccharomyces cerevisae
Saccharomyces bourlardii
Adaptado de Saad et al., 2013
Entretanto, por se tratarem de micro-organismos vivos, o tempo de vida dos
probióticos é dependente das condições de armazenamento, de modo que, ao
serem ingeridos, possam atuar no intestino e, somando-se à microbiota intestinal,
ali possam se fixar para ajudarem na absorção dos nutrientes e desenvolverem
seus mecanismos de ação. Os mecanismos de ação (Figura 1) consistem,
principalmente, em: formação de uma barreira física às bactérias patogênicas
através de uma competição por nutrientes e por sítios de ligação, o que impede que
as bactérias patogênicas se liguem aos receptores; estímulo da resposta imune
através do aumento da produção de anticorpos; ativação de macrófagos;
proliferação das células T e produção de interferon e mudanças nas condições
ambientais (VARAVALLO; THOMÉ; TESHIMA, 2008).
Figura 1 – Mecanismos de ação dos probióticos contra patógenos.
1 – Exclusão e competição com o patógeno pela adesão as células epiteliais; 2 – Estimulação do sistema imune inato; 3 – Competição por nutrientes e prebióticos; 4 – Produção de substâncias antimicrobianas e, assim, o antagonismo dos patógenos; 5 – Proteção da integridade da barreira intestinal; 6 - Regulação da citocina anti-inflamatória e inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias.
Fonte: Adaptado de SAAD et al., 2013
Tradicionalmente, os probióticos são consumidos em forma de leites
fermentados, iogurte e Kefir (SAARELA; MOGENSEN; FONDÉN; MÄTTÖ;
MATTILA-SANDHOLM, 2000; ZAJEK; GOREK, 2010; MAGALHÃES et al., 2011).
3.2 Kefir: Definição e aspectos gerais
A busca por alimentos benéficos à saúde tem feito com que alimentos
fermentados estejam cada vez mais presentes na dieta humana, uma vez que o
processo de fermentação proporciona um aumento na biodisponibilidade de
minerais e na digestibilidade das proteínas e dos hidratos de carbono, além de
melhorar as qualidades sensoriais do produto (ALTAY et al., 2013).
Kefir é uma bebida fermentada probiótica e benéfica para a saúde, cujo
interesse de consumo tem aumentado. Historicamente, os grãos de Kefir foram
considerados um dom de Deus entre o povo muçulmano das montanhas do
Cáucaso do Norte. A palavra Kefir é derivada da palavra turca "keif", que pode ser
traduzida como bom sentimento que pode ser sentido após bebê-lo. Os grãos de
Kefir foram passados de geração em geração entre as tribos de Cáucaso sendo
considerada uma fonte de riqueza da família (LOPITZ-OTSOA; REMENTERIA;
ELGUEZBAL; GARAIZAR, 2006).
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), define o Kefir
como leite fermentado, adicionado ou não de outras substâncias alimentícias,
obtidas por coagulação e diminuição do pH do leite, ou reconstituído, adicionado
ou não de outros produtos lácteos, cuja fermentação se realiza com cultivos ácidos-
lácticos elaborados com grãos de Kefir, Lactobacillus Kefir, espécies dos gêneros
Leuconostoc, Lactococcus e Acetobacter com produção de ácido láctico, etanol e
dióxido de carbono (BRASIL, 2007).
Inicialmente, havia apenas o Kefir tradicional e, em seguida, vários tipos de
Kefir, como Kefir de frutas e Kefir desnatado começaram a estar disponíveis no
mercado. Trata-se de uma bebida láctea fermentada de consistência cremosa e
sabor ligeiramente ácido, que se diferencia dos leites fermentados tradicionais
(iogurte) por ser produzida, apenas, a partir de uma mistura probiótica de leveduras
e bactérias conhecida como grãos de Kefir, fermentados em leite reconstituído de
vaca, ovelha, cabra integral ou desnatado ou ainda leites de fonte não animal, como
de coco, de soja, sucos de fruta e/ou soluções de açúcar e melaço (KABAK;
DOBSON, 2011).
Vale salientar que durante o armazenamento, a produção de CO2 por
leveduras ou BAL heterofermentativo pode causar estufamento na embalagem do
produto, um fato que deverá ser considerado na escolha desta (SARKAR, 2008).
A origem dos grãos e a tecnologia empregada para produção da bebida
podem gerar produtos com diferentes composições (OTLES E CAGINDI, 2003). De
uma maneira geral, a produção do Kefir pode ser de três formas: tradicional, método
russo ou método comercial utilizando culturas puras.
A produção artesanal tradicional envolve a inoculação de leite com uma
quantidade variável de grãos e fermentação por um período entre 18-24 horas a
20-25°C. No final do processo de fermentação, os grãos são peneirados e podem
ser usadas para uma nova fermentação ou mantidos (1-7 dias) no leite fresco,
enquanto que a bebida Kefir está pronta para o consumo (PRADO et al., 2015). O
Kefir pode ser consumido imediatamente após a separação dos grãos ou pode ser
refrigerado (fase de maturação) para consumo posterior. Durante a refrigeração, a
fermentação alcoólica leva ao acúmulo de CO2, etanol e vitaminas do complexo B.
Esta etapa reduz o teor de lactose, tornando o produto desejável para consumo por
indivíduos com intolerância à lactose e diabetes (FARNWORTH, 2005).
O "método russo" permite a produção de Kefir em maior escala, e utiliza um
processo de fermentação em série, a partir do percolado resultante da primeira
fermentação dos grãos - fermentado sem os grãos ou cultura mãe. O método
comercial com culturas puras é baseado no princípio da inoculação do leite com
culturas puras isoladas de grãos de Kefir e culturas comerciais. A fase de
maturação pode ser realizada ou não e consiste em manter o Kefir a 8-10°C por
até 24h, para permitir o crescimento, sobretudo de levedura, a fim de contribuir com
o sabor específico do produto (PRADO et al., 2015).
3.2.1 Composição dos grãos de Kefir
A concentração de inoculo inicial dos grãos (proporção de grãos/leite) afeta
o pH, viscosidade, concentração de lactose final e o perfil microbiológico do produto
final. E, as propriedades físico-químicas e a qualidade do Kefir são afetadas pela
qualidade microbiológica dos grãos, incubação, tempo e temperatura, condições de
saneamento e temperatura de armazenamento e a relação grão-leite, sendo o tipo
e quantidade do leite importante em termos sensoriais e afetam a microbiota dos
grãos a depender do seu teor de carboidratos, lipídeos e proteínas. Os grãos
(Figura 2) são uma massa cor branca a amarelo, macia, gelatinosa, e de tamanho
variando de 0,3-3,5 cm de diâmetro (NAJGEBAUER-LEJKO, 2007; DINC, 2008;
ERTEKIN; GUZEL-SEYDIM, 2010; USLU, 2010; CETINKAYA; ELAL-MUS, 2012;
ALTAY; KARBANCIOGLU-GÜLER; DASKAYA-DIKMEN; HEPERKAN, 2013;
SADY; DOMAGALA; GREGA; PRADO et al., 2015).
Figura 2 – Grãos de Kefir. Retângulo preto corresponde a 1cm
Fonte: Lopitz-Otsoa; Rementeria; Elguezbal; Garaizar, 2006
3.2.2 Composição química
Os grãos de Kefir são compostos de proteínas, lipídios e um polissacarídeo
solúvel, o complexo Kefiran, composto por quantidades iguais d-glicose e d-
galactose, classificado como um glucogalactan solúvel em água e produzido por
Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus plantarum, e outros. O Kefiran traz
vários efeitos benéficos para a saúde, incluindo a diminuição da pressão
sanguínea, imunomodulação, proteção do epitélio, aumento da atividade fagocitária
dos macrófagos peritoneais e pulmonares e aumento das células IgA nestes locais,
atividade antitumoral, atividade antimicrobiana e atividade anti-inflamatória (LIU,
WANG, LIN, LIN, 2002; MAEDA et al., 2004; RODRIGUES, CAPUTO, CARVALHO,
EVANGELISTA, SCHNEEDORF, 2005; DUARTE, VINDEROLA, RITZ,
PERDIGON, MATAR, 2006; VINDEROLA, PERDIGON, DUARTE, FARNWORTH,
MATAR, 2006; MOREIRA et al., 2008; PIERMARIA et al., 2010; MEI, GAO, LI,
2016).
O Lactobacillus Kefiranofaciens tem demonstrado que tem a capacidade de
produzir Kefiran sob diferentes condições. Contudo, o crescimento de células e as
taxas de produção de Kefiran foram mostrados aumentadas quando L.
Kefiranofaciens é cultivado numa cultura mista juntamente com Saccharomyces
cerevisiae, e sob as condições de cultura estabelecida imitando as ações de células
de leveduras, demonstrando a importância da simbiose entre bactérias e leveduras
em Kefir (PRADO et al., 2015).
O primeiro estudo sobre a estrutura do Kefiran foi publicado pela Kooiman
(1968), que propôs uma estrutura composta por duas unidades: Kefiran
(polissacarideo) e Kefirose (pentassacarideo). Em seguida, alguns autores
analisaram a estrutura do polissacarideo com as técnicas atuais, tais como
cromatografia, infravermelho, espectrofotometria e ressonância magnética nuclear,
chegando a estrutura mostrada na figura 3 (PRADO et al., 2015).
Figura 3 – Estrutura do Kefiran.
Fonte: Prado et al., 2015
Os exopolissacarídeos (EPS) produzidos pelo Kefir melhoram a textura e o
sabor do produto. Nos últimos anos, a utilização de Kefiran na indústria de
alimentos ganhou popularidade devido as suas excelentes propriedades
reológicas, podendo melhorar significativamente a viscosidade de produtos lácteos,
favorecer e manter as propriedades do gel e evitar a perda de água durante o
armazenamento. Além dos benefícios para a saúde supracitados, o Kefiran pode
ainda proporcionar efeito terepêutico como imunoestimulante, antimutagênico,
antialérgico, apresenta atividades antiúlcera, além de alto poder como um
composto de probióticos (KÖK-TAŞ; SEYDIM; ÖZER; GUZEL-SEYDIM, 2013;
PRADO et al., 2015).
A caracterização do Kefir não está totalmente descrita, tendo em vista que,
o tipo e o volume do leite utilizado e a composição dos grãos, bem como o processo
de produção utilizados afetam suas propriedades sensoriais, químicas e de textura.
O Kefir contém tipicamente 89-90% de umidade, 0,2% de lipídeos, 3,0% de
proteína, 6,0% de açúcar, 0,7% de cinzas, 1,0% de ácido láctico e 1,0% de álcool
(CAGINDI, 2003; SAKAR, 2007; OTLES; ALTAY et al., 2013).
Em estudo desenvolvido por Wszolek et al. (2001) as propriedades do Kefir
produzido na Escócia e na Polônia utilizando leite bovino, caprino e ovino com
diferentes culturas iniciais, mostrou que a composição química do Kefir variou de
10,6% a 14,9% para sólidos totais, 2,9-6,4% para proteína bruta, 3,8-4,7% para
carboidrato e 0,7-1,1% para cinzas. Magalhães et al. (2011) avaliaram o Kefir
brasileiro e evidenciaram que o mesmo continha 3,91% de proteína, 2,34% de
gordura e 9,62% de matéria seca após 24 h de fermentação. A recomendação da
composição físico-química do Kefir proposta pela FAO/WHO em 2003 e pelo MAPA
em 2007 está descrita na tabela 2.
Tabela 2 – Composição físico-química do Kefir recomendada pela FAO/WHO
(2003) e pelo MAPA (2007).
Parâmetro Padrões FAO Padrões MAPA
Proteína (% m/m) Min 2,7% Min 2,9%
Lipídeo (% m/m) < 10,0% Integral 3,0 a 5,9%
Parcialm. Desn.0,6 a 2,9% Desnatado Máx. 0,5%
Ácido Láctico (% m/m) Min 0,6% < 1% Etanol (% v/m) Não avaliado 0,5 a 1,5%
Os principais produtos formados durante a fermentação são ácido láctico,
CO2 e álcool (OTLES; CAGINDI, 2003). O ácido L (+) lático é o ácido orgânico em
maior quantidade após a fermentação, pois é derivado de aproximadamente 25%
da lactose. Entretanto, as quantidades de etanol e CO2 produzidas durante a
fermentação do Kefir dependem das condições de produção (FARNWORTH,
2005).
3.2.3 Composição Microbiológica
Os grãos de Kefir são compostos por uma mistura microbiana simbiótica de
bactérias de ácido láctico (108UFC / g), leveduras (106-107 UFC / g) e bactérias
ácido acéticas (105UFC / g). A manutenção da união da mistura simbiótica que
compõe o Kefir é possível pela presença do Kefiran (LOPITZ-OTSOA et al., 2006;
MAGALHÃES et al., 2011; KÖK-TAS et al., 2013; PRADO et al, 2015). Diversas
espécies de micro-organismos já foram isolados de Kefir (Tabela 3).
Tabela 3 – Espécies de micro-organismos encontrados no Kefir e nos grãos de Kefir
Espécie Referência
Lactobacillus Lactobacillus acidophillus Santos et al. (2003); Taş et al. (2012)
Lactobacillus brevis Simova et al. (2002); Mobili et al. (2009) Lactobacillus bulgaricus Yuksekdag et al. (2004)
Lactobacillus casei Zhou et al. (2009); Magalhães et al. (2011) Lactobacillus delbrueckii Santos et al. (2003); Simova et al. (2002)
Lactobacillus Kefir Magalhães et al. (2011) Lactobacillus Kefiranofaciens Wang et al. (2008); Leite et al. (2012)
Lactobacillus paracasei Magalhães et al. (2011) Lactobacillus rhamnosus Delfederico et al. (2006)
Lactobacillus mesenteroides Garbers et al. (2004) Lactococcus
Lactococcus lactis subsp. lactis Yuksekdag et al. (2004) Lactococcus lactis subsp. cremoris Yuksekdag et al. (2004)
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis
Garrote et al. (2001)
Leuconostoc Leuconostoc mesenteroides Witthuhn et al. (2005)
Streptococcus Streptococcus cremoris Ergullu & Ucuncu (1983)
Streptococcus thermophilus Yuksekdag et al. (2004); Taş et al. (2012) Enterococcus
Enterococcus durans Yuksekdag et al. (2004); Yang et al. (2007);
Garofalo et al. (2015) Pediococcus
Pediococcus acidilactici Sabir et al. (2010) Pediococcus dextrinicus Sabir et al. (2010)
Pediococcus pentosaceus Sabir et al. (2010) Bactérias ácido acéticas
Acetobacter aceti Koroleva (1991) Acetobacter lovaniensis Magalhães et al. (2011)
Acetobacter syzgii Miguel et al. (2010) Outras Bactérias
Bacillus sp. Angulo et al. (1993) Genus Bifidobacterium Leite et al. (2012) Bifidobacterium bifidum Taş et al. (2012)
Leveduras Candida Kefir Wyder (2001)
Candida albicans Angulo et al. (1993) Candida krusei Witthuhn et al. (2005)
Kluyveromyces lactis Latorre-García et al. (2007); Magalhães et
al. (2011) Kluyveromyces marxianus Taş et al. (2012) Saccharomyces cerevisiae Zhou et al. (2009)
Saccharomyces lactis Motaghi et al. (1997) Saccharomyces exiguus Latorre-García et al. (2007)
Saccharomyces humaticus Latorre-García et al. (2007)
A bebida fermentada (Kefir), pode variar de acordo com a origem, o substrato
utilizado no processo de fermentação e os métodos de manutenção. O Kefir
tibetano, que é usado na China, é composto de Lactobacillus, Lactococcus e
levedura. Bactérias ácido acéticas, também, foram identificadas no Kefir tibetano,
dependendo da região da China de onde foram obtidas. A composição do Kefir
tibetano, difere do inglês, do russo, do irlandês, do originário de Taiwan e do
produzido na Turquia. Entretanto, sabe-se que esta diversidade microbiana é
responsável pelas características físico-químicas e pelas atividades biológicas de
cada Kefir (JIANZHONG et al., 2009; KABAK; DOBSON, 2011; GAO et al., 2012;
ALTAY et al., 2013).
A FAO/WHO (2003) e o MAPA (BRASIL, 2007) traz a composição
microbiológica recomendada para o Kefir, conforme mostra a tabela 4.
Tabela 4 – Composição microbiológica do Kefir recomendada pela FAO/WHO (2003) e MAPA (2007).
Parâmetro Padrões FAO Padrões MAPA
Contagem total de bactérias lácticas (UFC/g)
Min 107 Min 107
Leveduras (UFC/g) Min 104 Min 104
3.2.3.1 Bactérias ácido láticas
As bactérias ácido láticas (BAL) são bactérias Gram-positivas,
facultativamente anaeróbicas, geralmente não móveis e não formadoras de
esporos. São, predominantemente, produtoras de ácido láctico, como produto final
da fermentação, a partir de carboidratos (KHALID, 2011; PFEILER;
KLAENHAMMER, 2007). As características dos principais gêneros estão descritas
na tabela 5.
Possuem um metabolismo exigente, envolvendo requisitos nutricionais
complexos para seu crescimento, o que incluem aminoácidos, peptídeos, bases
nucleotídicas, vitaminas, minerais, ácidos graxos e carboidratos (VODNAR;
PAUCEAN; DULF; SOCACIU, 2010). Entretanto, são bactérias que podem ser
encontradas em larga escala e de forma natural em alimentos fermentados, nos
quais desempenham um importante papel nas propriedades nutritivas e sensoriais
nos tradicionais produtos de leite fermentado, chegando a compor o mais
importante grupo de micro-organismos utilizados em alimentos devido as suas
características fisiológicas que incluem suas propriedades probióticas
(HLADÍKOVA; SMETANKOVA; GREIF; GREIFOVA, 2012).
Tabela 5 – Características dos principais gêneros de bactérias ácido láticas.
Gênero Gram Catalase Forma Tolerância ao oxigênio
Fermentação Produto
Lactobacillus + -
Bacilos ou
Coco Bacilos
Anaeróbico facultativo
ou Microaerófilo
Obrigatoriamente Homofermentativo, Facultativamente
Heterofermentativo, Obrigatoriamente
Heterofermentativo
Ácido Láctico,
CO2
Lactococcus + - Cocos
em cadeia
Anaeróbico facultativo
Homofermentativo Ácido
Láctico
Leuconostoc + - Cocos
em cadeia
Anaeróbico facultativo
Heterofermentativo Ácido
Láctico, CO2
Pediococcus + - Cocos
em tétrades
Anaeróbico facultativo
ou Microaerófilo
Homofermentativo Ácido
Láctico
Streptococcus + - Cocos
em cadeia
Anaeróbico facultativo
Homofermentativo Ácido
Láctico
Enterococcus + - Cocos
em cadeia
Anaeróbico facultativo
Homofermentativo Ácido
Láctico
Fonte: CLAESSON et al, 2007; SARKAR, 2007; EDDINE et al., 2016
Muitas espécies são de importância biotecnológica devido aos seus
aspectos de segurança, alcançados pela utilização há anos na preservação e
manutenção de alimentos (OLIVEIRA et al., 2017). No entanto, a quantidade a ser
utilizada é variável, podendo produzir efeitos positivos, como na fermentação
alcoólica tradicional de cereais, propiciando um ambiente favorável para
fermentações em fases posteriores, além da contribuição no aroma e no sabor
característico da bebida através da produção de etanol, ou negativos, o que pode
ocorrer na produção de molho de soja, onde o teor de ácido indica baixa
fermentação, devendo ser evitado (REE; LEE, JANG-EUN; LEE, CHERL-HO,
2011).
Cepas de Lactobacillus e Leuconostoc desempenham um papel importante
no desenvolvimento do sabor de produtos lácteos fermentados. Por exemplo,
Lactobacillus helveticus e Lactobacillus fermentum, foram isolados de culturas
iniciantes de soro de leite natural autóctones e são importantes na produção de
queijos duros como Grana Padano e Parmigiano Reggiano (GATTI et al., 2013).
Em relação ao Leuconostoc, estes desempenham um papel importante na
produção de compostos de aroma em leites fermentados, manteiga e creme, além
de serem membros da microbiota autóctone de queijos tradicionais de leite cru,
contribuindo para sabores peculiares destes (POGA ČIĆ et al. 2013; MONTEL, et
al., 2014).
As bactérias ácido láticas também são reconhecidas no campo da
biorremediação, especialmente quando as estirpes bacterianas atuam como
sorventes (MONACHESE, BURTON, REID, 2012). Por exemplo, o mecanismo de
captação de cátions de prata por Lactococcus lactis e Lactobacillus casei foi
estudado por Milanowski et al. (2017) onde foi observado que L. casei poderia
crescer no ambiente de cátions de prata e que essas bactérias poderiam ligar mais
a esse elemento se fosse adicionado no momento da inoculação. Essa
dependência não foi observada no caso de L. lactis, visto que a bactéria captou
quase a mesma quantidade de prata adicionada durante a inoculação e após 24
horas.
3.2.3.1.1 Gênero Lactobacillus
O gênero Lactobacillus foi isolado pela primeira vez em 1900 por Moro a
partir das fezes de lactentes amamentados ao seio materno (GOMES; MALCATA,
1999). Este gênero tem uma ampla distribuição, podendo ser encontrado em
alimentos vegetais, no trato gastrintestinal e genital, sendo sua ocorrência
influenciada pelo pH, teor de oxigênio, temperatura (faixa ótima entre 30-40°C) e
interações com outras bactérias (ANTUNES et al., 2007).
Os lactobacilos, compõe o maior gênero das BAL com mais de 100 espécies
descritas, correspondendo a micro-organismos fermentativos e não formadores de
esporos. Muitas de suas espécies estão associadas com a produção de alimentos,
devido à ação conservadora mediante o processo de acidificação com alterações
nos atributos sensoriais e na composição nutricional (CLAESSON, M. J.;
SINDEREN, D. V.; O’TOOLE, P. W., 2007).
3.2.3.1.2 Gênero Lactococcus
Os Lactococcus, incialmente, foram classificados nos gêneros
Streptococcus e Lactobacillus, devido as suas semelhanças. O gênero
Lacotococcus pertence ao grupo das bactérias ácido láticas, sendo encontradas
em vários ambientes e são de grande importância para a indústrias de alimentos
agrícolas, veterinários, médicos e processados. Caracterizam-se como cocos,
geralmente em pares (diplococos) ou em cadeias curtas, Gram-positivos, catalases
negativos e homofermentativos, tendo como espécies reconhecidas L. lactis, L.
garvieae, L. piscium, L. plantarum e L. raffinolactis. As subespécies L. lactis subs.
lactis e L. lactis subs. cremoris são utilizadas em todo o mundo em culturas iniciais
para fermentação de alimentos, em especial, na indústria de laticínios (PU;
DOBOS; LIMSOWTIN; POWELL, 2002; EDDINE; SALIHA; NACERA; BATTACHE;
MILOUD; MEBROUK, 2016).
A atividade anti-inflamatória de Lactococcus lactis subsp. cremoris foi
avaliada usando modelos de inflamação in vivo e in vitro, sendo a colite induzida
em ratos C57BL / 6 por administração de 3% de sulfato de dextrano sódico em água
potável (NISHITANI et al., 2009). As propriedades probióticas de L. lactis subsp.
Cremoris IBB477 atraiu atenção devido aos seus mecanismos de adesão e
sobrevivência no ambiente intestinal, tendo sido estudada por Radziwill-
Bienkowska et al. (2016). Já Luerce et al. (2014) estudaram três cepas de L. lactis
in vitro utilizando células epiteliais intestinais, através da administração de L. lactis
NCDO 2118 durante 4 dias a ratos C57BL / 6 durante o período de remissão de
colite induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS).
3.2.2.1.3 Gênero Leuconostoc
Na França, em 1985, culturas de sangue de uma mulher diagnosticada com
lúpus eritematoso, cursando com choque séptico e tratada com vancomicina,
produziram cocos Gram-positivos resistentes à vancomicina. Os mesmos cocos,
resistentes à vancomicina, surgiram no sangue de outro paciente acometido de
pneumonia pós-operatória que, posteriormente, foi tratado com penicilina, tendo
melhorado clinicamente. Inicialmente, a bactéria foi identificada como
Streptococcus, porém, por apresentar um padrão de resistência atípico à
vancomicina, análises laboratoriais adicionais foram realizadas, levando a
identificação do gênero Leuconostoc (SINNOTT; GARLAND, 1991).
A sua nomenclatura deriva das palavras gregas leucos (claro) e nostoc
(algas), são caracterizados como cocos Gram-positivos e heterofermentativos, com
morfologia de colônia e bioquímica semelhante a Streptococcus e Lactobacillus,
entretanto, a produção de gás a partir da glicose é característica de Leuconostoc
spp., mas não de Streptococcus, permitindo assim a sua diferenciação. Já a
diferença bioquímica de Leuconostoc e Lactobacillus formadores de gás utiliza
hidrólise de arginina, que ocorre com Lactobacillus, mas não com Leuconostoc.
Incluem-se no género Leuconostoc quatro espécies, L. mesenteroides, L.
paramesenteroides, L. lactis e L. oenos (SINNOTT; GARLAND, 1991).
Os nichos naturais de Leuconostoc são as vegetações verdes e as raízes,
sendo estes também conhecidos habitantes de produtos lácteos e açúcar
processado, uma vez que a partir do seu habitat natural crescem facilmente para
outros meios (vegetais, frutas, cereais, carne e leite), são utilizados pela indústria
de alimentos para aromatizar produtos lácteos e para melhorar a decapagem e
processos de fermentação (FLÓRES et al., 2016).
Portanto, eles são frequentemente encontrados como parte da comunidade
BAL inicialmente envolvida na fabricação e amadurecimento de diversos alimentos
fermentados e bebidas, tais como azeitonas, carne, cacau, vinho e produtos
lácteos. Na tecnologia de laticínios, as cepas de Leuconostoc são benéficas para
inúmeros aspectos tecnológicos ligados à sua capacidade de produzir ácidos
orgânicos, dióxido de carbono, dextrans e, especialmente, compostos aromáticos,
como diacetil, acetaldeído e acetoína. Para isso, as cepas bem caracterizadas são
intencionalmente adicionadas como novas culturas variáveis em vários processos
de produção para controlar as fermentações e contribuir para as propriedades
sensoriais e reológicas do produto final (FLÓRES et al., 2016).
As cepas de Leuconostoc também estão ligadas a alguns aspectos
negativos, incluindo deterioração (por exemplo, na indústria de cana-de-açúcar e
produtos alimentares por formação de limo) e segurança (uma vez que foram,
ocasionalmente, identificados em isolados clínicos humanos). No entanto, sua
longa história de consumo seguro em alimentos tradicionais fermentados levou à
conclusão de que Leuconostoc é em geral considerado como micro-organismo
seguro. Neste sentido, a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos
(EFSA) considera Leuconostoc como adequado para a abordagem qualificada de
presunção de segurança (QPS), o que exige que as cepas tecnológicas destinadas
a serem introduzidas na cadeia alimentar não sejam adquiridas ou transferíveis
determinantes de resistência aos antimicrobianos de importância clínica e
veterinária para prevenir a disseminação lateral destes (FLÓRES et al., 2016).
3.2.3.2 Leveduras
Classificadas no reino dos fungos e com mais de 1500 espécies descritas,
as leveduras são micro-organismos eucarióticos e unicelulares de grande
importância para a indústria de alimentos e bebidas. O Kefir é um produto que
apresenta algumas características que são atribuídas às atividades das leveduras
(KURTZMAN; FELL, 2006; QUEROL; FLEET, 2006).
Uraz et al. (2012) isolaram leveduras do Kefir da Turquia, foram encontrados
um total de 66 diferentes espécies, onde 51% das leveduras encontradas eram da
espécie Candida kefyr, 33% representavam a espécie Candida famata e apenas
2% das leveduras presentes no Kefir avaliado eram da espécie Saccharomyces
cerevisiae. Ainda com relação ao Kefir turco, mas de regiões diferentes, Kök-taş et
al. (2012) identificaram como maiores representantes de leveduras as espécies
Kluyveromyces marxianus e Kluyveromyces dobzhanskii.
As leveduras têm sido consideradas como um dos micro-organismos que
apresentam potencial probiótico, e estudos têm sido desenvolvidos para comprovar
este efeito. Martins et al. (2013) avaliaram a proteção da levedura S. boulardii
contra Salmonella typhimurium, os resultados mostraram que a levedura pode ser
útil como adjuvante em ratos doentes, infectados com febre tifóide, mesmo quando
iniciada após o aparecimento da doença.
Perricone et al. (2014) isolaram leveduras provenientes de Altamura (região
sul da Itália) e testaram a capacidade probiótica das mesmas, 18 isolados foram
submetidos à seleção para verificar suas características probióticas (sobrevivência
em pH 2,5 enriquecido com sais biliares, resistência à antibióticos, atividade
antimicrobiana para patógenos de origem alimentar, propriedades hidrofóbicas e
produção de biofilme), mas, apenas Saccharomyces cerevisiae estirpe 2 e
Saccharomyces cerevisiae estirpe 4 foram selecionados e avaliadas em relação a
simulação do trânsito gastrointestinal, estes isolados mostraram uma tendência
semelhante à S. boulardii em relação ao seu potencial probiótico.
Leveduras isoladas de Kefir proveniente da Argentina foram identificadas e
avaliadas em relação ao seu potencial probiótico, 34 estirpes foram isoladas e
identificadas por meio de métodos microbiológicos clássicos e genética molecular
clássica, destas, 13 isolados apresentaram-se resistentes aos sais biliares. Além
da resistência, K. marxianus CIDCA 8154 e S. cerevisiae CIDCA 8112 também
apresentaram capacidade de adesão às células epiteliais do intestino e a sobreviver
à passagem através do trato gastrointestinal de ratos (DIOSMA, et al. 2013).
3.2.3.3 Bactérias ácido acéticas
As bactérias ácido acéticas (BAA) compõem um grande grupo de bactérias
caracterizadas por se apresentarem como Gram-negativas ou Gram-variáveis,
obrigatoriamente aeróbicas e não formam esporos, são catalases positivas e
oxidase negativo. Segundo Ruiz et al. (2000), as bactérias ácido acéticas são
divididas nos gêneros Acetobacter, Acidomonas, Gluconobacter e
Gluconacetobacter, entretanto, Gluconobacter e Acetobacter são as mais
estudadas como produtoras de ácido acético para indústrias.
Acetobacter e Gluconobacter tem forma pleomórficas que pode ser esférica,
alongada, curvada ou filamentosa, em forma de haste, retas ou ligeiramente curvas,
cujo tamanho pode variar de 0,4-1,0 μm de largura por 0,6-0,8 μm de comprimento,
ocorrendo individualmente, em pares ou em cadeia. Em meios líquidos,
Acetobacter forma um anel, filme ou película, através do qual é observada uma
turbidez uniforme do meio e um depósito celular. Algumas cepas produzem um
pigmento rosa, não difuso, enquanto outros podem produzir um pigmento solúvel,
marrom escuro (KERSTERS; LISDIYANTI; KOMAGATA; SWINGS, 2006; MAAL;
SHAFIEE, 2009). De modo geral, as BAA têm sido enumeradas pela viabilidade de
colônias em meios sólidos, entretanto, nem todos os meios promovem o
crescimento de todas as bactérias de forma igualitária, ou seja, os meios são
seletivos para uma cepa ou outra (GULLO; CAGGIA; DE VERO; GIUDICI, 2006).
No campo da biotecnologia, o interesse pelas bactérias ácido acéticas é
devido ao seu processo de fermentação, através do qual ocorre por oxidação
incompleta de álcoois e açúcares em uma excreção quase quantitativa dos
produtos de oxidação correspondentes no meio de cultura (DEPPENMEIER et al.,
2002; ADACHI et al., 2003; MATSUSHITA et al., 2003). Como exemplo, tem a
produção de ácido acético a partir de etanol ou de ácido D-glucônico a partir de D-
glicose (DEPPENMEIER et al., 2002; LINO et al., 2012).
Sainz et al. (2016) testaram dezenove cepas pertencentes a oito espécies
diferentes de BAA para selecionar aqueles que poderiam produzir ácido D-
glucônico a partir de D-glicose sem consumir D-frutose em uma produção de bebida
fermentada não alcoólica de morangos. Ao final do estudo foi possível conseguir a
conversão seletiva de D-glicose em ácido D-glucônico sem fermentar a D-frutose.
G. japonicus CECT 8443 e G. oxydans Po5, pertencentes ao gênero
Gluconobacter, foram as melhores cepas para este processo. No entanto, a escolha
da cepa dependerá da concentração final de ácido D-glucônico desejado.
Ua-Arak et al. (2016), considerando que as BAA podem produzir
exopolissacarídeo (EPS) de peso molecular extremamente elevado, o que as torna
potenciais candidatas para a formação de estruturas em pães, fermentaram, em
condição aeróbica alternativa, cereal sem glúten com cepas de BAA que
produziram Gluconobacter albidus TMW 2.1191, Kozakia baliensis NBRC 16680 e
Neoasaia chiangmaiensis NBRC 101099 em massas de trigo sarraceno (mourisco)
contendo melaço como fonte natural de sacarose. As características das BAA nas
fermentações da massa asseguram os potenciais de usá-las para melhorar os pães
sem glúten com qualidade e sem o uso de aditivos, substituindo hidrocolóides
comerciais formadores de estrutura atualmente utilizados por EPS produzidos in
situ.
3.2.4 Interação dos micro-organismos do Kefir durante a fementação
O crescimento e a atividade dos micro-organismos em alimentos
fermentados são dependentes de vários fatores, tais como: disponibilidade de
fontes de carbono, nitrogênio e nutrientes específicos para cada metabolismo do
micro-organismo submetido a fermentação, pH do substrato, teor de umidade,
temperatura de incubação e presença de outros micro-organismos competidores.
Ao produzir um único produto final principal os micro-organismos são chamados
homofermentativos (figura 4), e os que produzem mais de um produto são
chamados heterofermentativos (FELLOWS, 2006).
Figura 4 – Homofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise.
Fonte: Adaptado de ABDEL-RAHMAN; TASHIRO; SONOMOTO (2013).
As BAL homofermentativas possuem enzimas aldolases e produzem ácido
lático como o principal produto final. São, portanto, de interesse para a produção
de ácido láctico em escala comercial. Em contrapartida, as BAL heterfermentativas
produzem outros subprodutos além do ácido láctico. O metabolismo
heterofermentativo usa o caminho alternativo de pentose monofosfato, convertendo
açúcares de 6-carbono (hexoses) em açúcares de 5 carbonos (pentoses) por
fosfocetolase, conforme ilustrado na figura 5 (ABDEL-RAHMAN et al., 2011).
Figura 5 – Heterofermentação esquemático pela via metabólica da glicólise.
Fonte: Adaptado de ABDEL-RAHMAN; TASHIRO; SONOMOTO (2013).
O processo fermentativo do Kefir ocorre por simbiose entre bactérias ácido
láticas, leveduras e bactérias ácido acéticas, que metabolizam e produzem seus
produtos finais, conforme ilustrado na figura 6. Os produtos da fermentação do Kefir
são, predominantemente, oriundos das fermentações láticas por BAL. A sequência
de bactérias lácticas em processo fermentativo é determinada pela sua tolerância
ácida (FELLOWS, 2006).
Figura 6 – Metabolismo dos micro-organismos durante a fermentação de Kefir.
BAL = Bactérias ácido láticas; BAA = Bactérias ácido acéticas
O gênero Lactococcus normalmente tem um crescimento mais rápido do que
as leveduras devido a sua capacidade em metabolizar a lactose liberando ácido
láctico. No entanto, quando o ambiente se torna muito ácido (0,7 a 1,0% de ácido
láctico), os Lactococcus são inibidos e superados por espécies mais tolerantes ao
ácido, como os Lactobacillus. As leveduras que são de extrema importância no
processo fermentativo, também são favorecidas com a acidez e encontram o
ambiente favorável para produção de fatores essenciais de crescimento, como
aminoácidos, vitaminas, alteração do pH, secreção de etanol e produção de CO2
(FELLOWS, 2006; LOPITZ-OTSOA et al., 2006). O etanol produzido torna-se
biodisponível para que as bactérias ácido acéticas exerçam seu metabolismo e
produzam ácido acético (MAGALHÃES et al., 2010).
3.2.5 Benefícios do Kefir na saúde humana
O processo fermentativo do Kefir atrelado a diversidade de sua microbiota,
seja atuando de forma independente ou sinérgica, acarreta em vários e importantes
benefícios para a saúde, entre estes: propriedades fisiológicas, profiláticas e
terapêuticas (Figura 7) (LEITE et al., 2013).
Figura 7 - Diagrama esquemático dos efeitos fisiológicos benéficos do Kefir na saúde humana.
Fonte: Adaptado de Rosa et al. (2017)
3.2.5.1 Atuação no trato gastrintestinal
Estudos e relatos clínicos evidenciam a eficácia das bactérias probióticas na
prevenção e tratamento de infecções intestinais, a medida que os probióticos atuam
no aumento da resistência do hospedeiro aos agentes patogênicos intestinais por
vários mecanismos: produção de substâncias inibitórias, bloqueio de locais de
adesão na superfície intestinal, competição por nutrientes e estimulação da
imunidade tanto na mucosa como a nível sistêmico (OHLAND; MACNAUGHTON,
2010; ZHANG et al., 2013). O Kefir por possuir uma gama de micro-organismos
com potencial probiótico, tem sido estudado como adjuvante no tratamento das
patologias a do trato gastrintestinal.
Bolla et al. (2013) testaram o efeito protetor de uma mistura constituída por
micro-organismos isolados do Kefir (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus Kefir,
Lactococcus lactis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae) em
ratos infectados com Clostridium difficile. Os ratos receberam oralmente 200 mg de
clindamicina no dia 7 e depois foram infectados com 1 x 108 UFC de C. difficile por
gavage, 6 dos 7 animais infectados desenvolveram diarreia e 5 de 7 do grupo
placebo morreram no final do experimento. No grupo de animais infectados e
tratados, apenas 1 de 7 ratos apresentou diarreia e nenhum deles morreu. As
seções histológicas mostraram apenas um ligeiro engrossamento da mucosa com
presença de infiltrado linfócito. Estes resultados demonstram que um tratamento
oral com uma mistura de bactérias e leveduras isoladas de Kefir foi capaz de
prevenir diarreia e enterocolite desencadeada por C. difficile.
Em outro estudo, Montijo-Prieto et al. (2015) isolaram Lactobacillus
plantarum C4 do Kefir e o testaram quanto à sua capacidade protetora e
imunomoduladora em yersiniose. Ratos foram infectados com uma estirpe de
sorotipo O9 de baixa patogenicidade de Yersinia enterocolitica que resulta em uma
infecção intestinal prolongada com colonização das placas de Peyer. O pré-
tratamento com C4 não teve efeito sobre a excreção fecal de Yersinia, mas reduziu
a colonização das placas de Peyer. Este efeito protetor foi associado ao status pró-
inflamatório na mucosa intestinal – aumento da produção do Fator de Necrose
Tumoral α (TNF-α) nos infectados tratados com C4 – e houve um aumento na
secreção total de Imunoglubulina A (IgA). A nível sistêmico, C4 não promoveu uma
resposta pró-inflamatória, embora a produção da citoquina imunorreguladora
Interferon-γ (IFN-γ) tenha sido melhorada. Esses achados sugerem que L.
plantarum C4 pode aumentar a resistência a infecções intestinais por meio de sua
atividade imunomoduladora.
3.2.5.2 Atuação no sistema imune
As interações entre bactérias comensais, epitélio intestinal e células do
sistema imune desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase
intestinal (KELLY; MULDER, 2012; RESCIGNO, 2011). O uso de probióticos para
modular as respostas imunes a nível da mucosa e a nível sistêmico tem
demonstrado ser uma interessante alternativa quanto à prevenção e tratamento de
doenças infecciosas e em casos de diversas imunopatologias, como doenças
inflamatórias intestinais e alergias (GAUDANA; DHANANI; BAGCHI, 2010;
HEINEMAN et al., 2012; TOH et al., 2012). Estudos têm relatado propriedades
imunomoduladoras para diferentes leveduras e bactérias isoladas de grãos de
Kefir.
Carasi et al. (2015) selecionaram e administraram a cepa Lactobacillus Kefiri
CIDCA 8348, isolados de grãos de Kefir, em ratos suíços saudáveis diariamente
durante 21 dias. A probioticoterapia aumentou a IgA em fezes e reduziu a
expressão de mediadores pró-inflamatórios em placas de Peyer e nos linfonodos
mesentéricos, onde também aumentou a isoleucina-10 (IL-10). Em conclusão,
cepas de L. Kefiri, isoladas de Kefir, estimularam a produção de diferentes
proporções de citocinas pró / anti-inflamatórias in vitro, demonstrando efeitos não
apenas na redução da expressão de mediadores pró-inflamatórios, mas também
no aumento das moléculas anti-inflamatórias em locais indutores e efetores do
sistema imunológico intestinal.
Entre as leveduras do Kefir, Romanin el al. (2010) verificaram que as cepas
Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 e Saccharomyces cerevisiae CIDCA 8112
reduzem a resposta inata no epitélio intestinal por meio de um mecanismo
dependente da modulação do fator nuclear kappa B (NF-kB), o que indica que o
Kefir contém micro-organismos capazes de abolir a resposta inflamatória epitelial
intestinal que pode explicar algumas das propriedades atribuídas a este leite
fermentado.
3.2.5.3 Ação antibacteriana
Desde o início do século XX os efeitos positivos do consumo regular de
iogurtes contendo micro-organismos têm sido estudados, o que levou a observação
da existência de uma importante competição entre BAL e patógenos que
desencadeia em benefícios à saúde. O Kefir, como probiótico, tem o seu potencial
contra micro-organismos patogênicos atribuída a produção de ácido láctico, ácido
acético, peróxido de hidrogênio, dióxido de carbono, etanol, diacetil e bacteriocinas
produzidas pelas BAL, BAA e leveduras durante o ciclo normal da fermentação
(FARNWORTH, 2005; LOPITZ-OTSOA et al., 2006).
Carasi et al. (2014) estudaram a atividade antibacteriana de Lactobacillus
Kefiri, onde todas as cepas de Kefiri foram capazes de inibir os patógenos Gram
(+) e Gram (-), em análises in vitro. O L. Kefiri CIDCA 8348 foi selecionado para
realizar estudos in vivo. Os ratos foram tratados diariamente com uma dose oral de
108 UFC durante 21 dias e não apresentaram sinais de dor, letargia, desidratação
ou diarréia. Além disso, não houve nenhuma diferença na secreção de citocinas
pró-inflamatórias entre ratos tratados e controlados. Também não foi observado
translocação de micro-organismos para o sangue, baço ou fígado. Tais
descobertas, evidenciaram que L. Kefiri CIDCA 8348 é um micro-organismo isolado
de um produto lácteo com um grande potencial como probiótico para uso humano
ou animal.
Miao et al. (2016) purificaram o peptídeo antimicrobiano F3 do Kefir,
demonstrando que este apresenta uma estrutura química especial, tem baixo peso
molecular e contém uma leucina e uma tirosina com dois radicais fosfato. Este
peptídeo apresentou atividade antimicrobiana em um amplo espectro de
organismos, incluindo várias bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem
como fungos, com valores de concentração inibitória mínima variando de 125 a 500
μg / mL. Por fim, o F3 tem o potencial de servir como conservante natural valioso
na indústria de alimentos.
3.2.5.4 Ação hipocolesterolêmica
Com o frequente aumento do índice de comorbidades, como as doenças
cardiovasculares (DCV), na população, sobretudo associadas aos níveis de
colesterol séricos elevados, estudos tem sido desenvolvidos acerca do consumo
diário de produtos probióticos visando a redução da concentração de colesterol na
circulação (ROSA et al., 2017).
Liu et al. (2006) avaliaram a propriedade hipocolesterolêmica do Kefir de leite
e do Kefir de “leite de soja”. Ratos machos foram alimentados com uma dieta livre
de colesterol ou enriquecida com colesterol contendo 10% de leite desnatado, Kefir
de leite e Kefir de “leite de soja” durante 8 semanas. A dieta de Kefir de “leite de
soja” levou a um aumento significativo na excreção fecal de esteróis neutros e
ácidos biliares em comparação com as outras duas dietas. E, também provocou
uma diminuição significativa na proporção sérica de colesterol não-HDL para HDL-
colesterol, em comparação com o controle, do que as outras dietas. Esses achados
demonstram que o Kefir de “leite de soja” pode ser considerado como um produto
promissor em termos de prevenção de doença cardiovascular (DCV) através de
sua ação hipocolesterolêmica.
Os efeitos do Lactobacillus plantarum MA2, isolados do Kefir tradicional
tibetano chinês, sobre a redução dos níveis de colesterol e na microbiota de ratos,
foram avaliados por Wang et al. (2009). Os ratos foram alimentados com uma dieta
enriquecida com colesterol e suplementada com L. plantarum MA2 liofilizado. Os
resultados mostraram que houve uma significativa redução do colesterol total
sérico, colesterol-Lipoproteína de baixa densidade (LDLc) e triglicerídeos, enquanto
não houve alteração no colesterol-lipoproteínas de alta densidade (HDLc). Além
disso, o colesterol total no fígado e os triglicerídeos também diminuíram. No
entanto, a excreção fecal de colesterol e triglicerídeos aumentaram
significativamente (p <0,05) em comparação com o controle. Além disso, L.
plantarum MA2 aumentou a população de bactérias ácido láticas e bifidobactérias
fecal, mas não alterou o número de Escherichia coli em relação ao controle.
Ostadrahimi et al. (2015) realizaram um ensaio clínico randomizado duplo-
cego controlado com placebo em 60 pacientes diabéticos com idade entre 35 e 65
anos. Os pacientes consumiram 600mL de Kefir diariamente durante 8 semanas.
Ao final do estudo, verificaram que os níveis séricos de triglicerídeos, colesterol
total, LDL e HDL do grupo que consumiu Kefir não apresentaram diferenças
significativas quando comparado com o grupo controle, evidenciando que o Kefir
não conseguiu reduzir os níveis plasmáticos dos lipídeos em portadores de
diabetes.
3.2.5.5 Ação anticarcinogênica
O potencial efeito do Kefir na modulação da carcinogênese pode ser
atribuída aos polissacarídeos e aos compostos bioativos. Os polissacarídeos
solúveis em água, mostraram efeito protetor contra metástases pulmonares,
enquanto a fração de polissacarídeo insolúvel em água inibiu a metástase de
melanoma em ratos. Além disso, os compostos bioativos de Kefir podem prevenir
o início do câncer ou suprimir o crescimento dos tumores já iniciados, dificultando
a ação de enzimas, impedindo a conversão de agentes pró-carcinogênicos em
carcinógenos (LOPITZ-OTSOA et al., 2006).
Liu et al. (2002) estudaram a resposta da imunoglobulina A na mucosa
intestinal e o efeito antitumoral de Kefir de leite e de leite de soja administrados, via
oral, em ratos portadores de tumores durante 30 dias. Ao final do estudo verificaram
que os Kefirs não apenas inibiram o crescimento tumoral e induziram a lise da forma
apoptótica das células tumorais, como também aumentou o nível total de IgA em
extratos de tecido da parede do intestino delgado, o que sugere que os Kefirs de
leite e de leite de soja podem ser considerados promissores para a prevenção e
aprimoramento da resistência da mucosa a infecções gastrointestinais e ao câncer.
Khoury et al. (2014) avaliaram a capacidade do Kefir em inibir a proliferação
e a motilidade e induzir a apoptose de células de câncer colorretal Caco-2 e HT29.
Os resultados mostram que Kefir foi capaz de induzir a prisão do ciclo celular na
fase G1, diminuir a expressão de mRNA do fator de crescimento transformante-α
(TGF-α) e do fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) em HT29 e p21 foi
visto como independente de p53, o que pode ser o motivo da parada do ciclo celular
na fase G1 observada após o tratamento com Kefir. Além disso, a proporção dos
genes pró-apoptótico e anti-apoptótico, respectivamente, Bax: Bcl-2 aumenta,
consistentemente, após o tratamento com Kefir indicando seu efeito pró-apoptótico.
Os dados obtidos sugerem ainda, que o Kefir é capaz de inibir a proliferação e
induzir a apoptose em células HT-29 e Caco-2 de câncer colorretal mas não exibe
um efeito significativo sobre a motilidade e a invasão destas células in vitro.
3.2.5.6 Ação do Kefir na intolerância a lactose
A lactose é um dissacarídeo, formado por glicose e galactose, que para ser
adequadamente absorvido pela mucosa intestinal é necessário sofrer hidrólise
enzimática através de uma β-galactosidase conhecida como lactase. No entanto,
há pessoas que apresentam deficiência na atividade desta enzima acarretando no
diagnóstico de intolerância a lactose que leva a sintomas como meteorismo, dor ou
desconforto intestinal e diarreia osmótica. Tanto o leite quanto os seus derivados
contêm concentrações elevadas de lactose, o que faz com que estes produtos
sejam, normalmente, excluídos da dieta de um intolerante a lactose (DE VRESE;
MARTEAU, 2007).
Entretanto, produtos fermentados apresentam a característica de promover
um esvaziamento gástrico tardio, facilitando a digestão da lactose, uma vez que
prolongam a ação residual da lactase e, ainda, promovem a redução da
sensibilidade aos sintomas de má absorção. O Kefir, durante sua fermentação,
reduz o teor de lactose, pois a β-galactosidade é uma enzima naturalmente
presente nos grãos de Kefir, o que leva a produção de um produto final adequado
para pessoas que apresentam o quadro de intolerância a lactose (AHMED et al.,
2013).
Hertzler; Clancy (2003) fizeram um estudo pioneiro em adultos, clinicalmente
saudáveis, com diagnóstico de intolerância a lactose. Na pesquisa, ficou
evidenciado que o consumo de Kefir melhorou a digestão da lactose de forma
semelhante ao iogurte natural, reduzindo também a flatulência gerada pela digestão
do leite em uma média de 65%. Além disso, o percentual de β-galactosidade foi
60% maior do que o encontrado no iogurte natural.
3.3 Métodos de conservação de alimentos
A indústria alimentícia, através da tecnologia, tem desenvolvido ao longo dos
anos, técnicas de conservação que propiciem o aumento da vida de prateleira de
um produto inibindo alterações microbiológicas e bioquímicas e, assim, permite que
um alimento chegue com qualidade nutricional e sensorial ao seu consumidor final.
Os métodos utilizados são os mais diversos, o que engloba o emprego de calor ou
frio, modificações de pH, atmosfera e atividade de água (com redução do seu teor
ou sua imobilização). Porém, a escolha do método vai depender das características
do alimento, aspectos que se têm o interesse de preservar, tempo de vida útil
pretendido, pré-existência de maquinário na indústria e viabilidade econômica
(FELLOWS, 2006).
Nos alimentos que contém micro-organismos vivos, os diversos fatores que
podem afetar o comportamento destes, assim como as diferentes composições dos
alimentos nos quais estão inseridos tem que ser considerados, pois podem interferir
na concentração celular dos probióticos, impedindo que estes atinjam o intestino
vivos e metabolicamente ativos. Alguns destes fatores são a acidificação do produto
final, a quantidade de oxigênio tanto no produto quanto o que penetra através da
embalagem, nível de oxigênio, pH e ácidos produzidos no período de
armazenamento. Por conseguinte, também a perda de viabilidade ocorre durante o
trânsito gastrointestinal, onde os principais fatores de estresse são o pH e o
deslocamento biliar, que são considerados como um obstáculo que os probióticos
têm de superar para cumprir o seu papel biológico. Neste contexto, diferentes
estratégias tecnológicas que objetivam conservar e manter a viabilidade celular dos
probióticos têm sido utilizadas, entre estas a secagem por liofilização (SOUZA et
al., 2011; PRISCO; MURIELLO, 2016).
3.3.1 Liofilização
A liofilização ou secagem a frio (freeze dryer) trata-se de um método de
conservação que realiza uma secagem por sublimação sob vácuo. A pressão de
vapor d’água do alimento é mantida abaixo de 4,58 Torr (610,5 Pa) e a temperatura
abaixo de 0,0099ºC (pressão e temperatura características do ponto triplo), onde a
água encontra-se em estado sólido, o que faz com que ao promover o aquecimento
do alimento, o gelo sublima diretamente para o estado de vapor sem se fundir, ou
seja, sem passar pelo estado líquido (Figura 8), minimizando assim várias reações
de degradação que ocorrem durante a secagem, como a reação de Maillard,
desnaturação de proteínas e reações enzimáticas, e, portanto, é uma boa
alternativa de secagem para alimentos (FELLOWS, 2006; AGUIAR et al., 2012).
Figura 8 – Diagrama de fases da água mostrando a sublimação do gelo.
Fonte: Adaptado de Fellows, 2006
Segundo Baruffaldi e Oliveira (1998) o termo “liófilo” significa amigo do
solvente, o que define com fidelidade as características dos produtos liofilizados:
altamente higroscópicos e de fácil dissolução na água. A liofilização é um
importante processo industrial para secagem de alimentos, materiais cirúrgicos,
farmacêuticos e outros, os quais têm estrutura interna ou composição química
sujeitas à degradação térmica (BOSS, 2004).
O processo de liofilização consiste em três etapas: (1) congelamento de um
material úmido; (2) secagem primária: a água livre congelada sofre sublimação; (3)
secagem secundária: a água ligada é eliminada por dessorção. Para remover a
umidade a uma temperatura abaixo de 0ºC, a liofilização requer alto vácuo para
aumentar o gradiente de transferência de massa entre a frente de sublimação e o
meio de secagem (Figura 9). A remoção do vapor d’água do alimento ocorre de
forma contínua ao se manter a pressão na câmara do liofilizador abaixo da pressão
de vapor na superfície do gelo através de uma bomba de vácuo e da condensação
dos vapores diretamente em gelo (sublimação inversa) através de uma serpentina
de refrigeração, de forma que, a medida que a secagem prossegue, a frente de
sublimação se move para o interior do alimento congelado, promovendo a
desidratação deste (FELLOWS, 2006; REYES; MAHN; HUENULAF, 2011).
Figura 9 – Liofilizador em funcionamento com bomba de vácuo
Os fatores que controlam o tempo de secagem são descritos pela equação 1.
(1)
Onde td (s) = tempo de secagem; x (m) = espessura do alimento; ρ (Kg m-3)
= densidade total do alimento seco; M1 = teor de umidade inicial; M2 = teor de
umidade final na camada seca; λs = calor latente de sublimação; kd = condutividade
térmica da camada desidratada. Observa-se que o tempo de secagem é
proporcional ao quadrado da espessura do alimento, o que significa que ao duplicar
a espessura, o tempo de secagem irá aumentar por um fator de quatro, por isso,
recomenda-se que as camadas do produto a ser liofilizado sejam finas (FELLOWS,
2006).
Os alimentos liofilizados apresentam alta conservação das características
sensoriais, boa qualidade nutricional e retenção de 80 a 100% do aroma, uma vez
que este não é absorvido no vapor d’água produzido pela sublimação, ficando preso
na matriz do alimento (FELLOWS, 2006). Além disso, esta técnica facilita a
manutenção e o armazenamento das culturas e garante a estabilidade das
características morfológicas e bioquímicas das células estocadas (muitas de alto
valor agregado) e a não necessidade de manuseamento e estocagem do produto
em local refrigerado. Porém, uma etapa crítica da liofilização é o congelamento que
pode causar lioinjúrias celular irreversíveis, contudo, é possível fazer uso da
crioproteção para minimizar tais efeitos negativos, sendo um dos maiores desafios
da criopreservação realizar um congelamento com menores danos celulares
(AGUIAR et al., 2012).
As características físico-químicas ideais para um crioprotetor são baixo peso
molecular, alta solubilidade em água e baixa toxicidade celular. Estes podem ser
classificados em penetrantes ou intracelulares, como metanol, etilenoglicol,
propilenoglicol, dimetilformaldeído, metilacetamida, DMSO e glicerol; e
crioprotetores não penetrantes ou extracelulares, como os mono, oligo e
polissacarídeos, manitol, sorbitol, dextrana, metilcelulose, polietilenoglicol entre
outros. E, essas diferenças de permeabilidade afetam os mecanismos pelos quais
ocorre a proteção ao material biológico (LIMA, 2011; AGUIAR et al., 2012).
Os crioprotetores não penetrantes ou extracelulares induzem o aumento da
osmolaridade do meio externo, gerando a passagem da água do interior da célula
para o meio extracelular, prevenindo a formação de cristais de gelo durante o
congelamento. Portanto, são apropriados à preservação de micro-organismos por
se fixarem à superfície microbiana formando uma camada viscosa capaz de
proteger mais efetivamente suas paredes celulares e membranas. Já os
crioprotetores penetrantes ou intracelulares realizam ligações com as moléculas de
água, minimizando a formação e o tamanho dos cristais de gelo, bem como,
reduzem as concentrações de soluto tanto no meio extracelular quanto no
intracelular (HUBÁLEK, 2003).
Com isso, os agentes crioprotetores atuam prevenindo a cristalização ao
reduzir a atividade de água (COSTA, 2010). Na criomicrobiologia, o glicerol é o
principal álcool utilizado com sucesso que atua penetrando na membrana celular
através da difusão passiva. Todavia, alguns açúcares têm se mostrado capazes de
atuar como agentes crioprotetores ao promoverem alterações na permeabilidade e
na separação lateral dos componentes da membrana plasmática. A sacarose tem
sido frequentemente utilizada para a criopreservação de micro-organismos em
concentrações de 1-68% (média 10%). Outros agentes relatados são a trealose,
usada nas concentrações de 5 a 19% (média 10%), o glicerol a 10%, leite
desnatado a 10%, inositol a 10%, rafinose a 5 ou 10%, glicose de 1 a 18% (média
4%) e lactose de 1 a 10% (média 8%) (HUBÁLEK, 2003; AGUIAR et al., 2012).
Segundo Kennedy (2000), se o alimento puder ser formulado ou acrescido
com carboidratos, a temperatura de transição vítrea aumenta e, sendo este
aumento acima da temperatura de estocagem, a estabilidade e a vida de prateleira
dos produtos aumentarão. Com isso carboidratos típicos como sacarose, já citada,
a maltose, a frutose e a maltodextrina têm sido utilizados visando o aumento da
temperatura de transição vítrea.
Em estudo desenvolvido por CARVAJAL, MACDONALD e LANIERA (1999)
ficou evidenciado que a tensão superficial aumentou em soluções de
maltodextrinas 15 e 20 DE, em concentração de 8%, semelhantes à sacarose. Isto
suporta a hipótese de que os produtos de hidrólise de amido podem crioproteger
pelo mesmo mecanismo que a sacarose e o sorbitol.
3.3.1.1 Liofilização na indústria de alimentos
A atividade da água (aw) ou água livre disponível para que ocorram reações
químicas e biológicas, representa uma indicação de estabilidade alimentar em
relação ao crescimento microbiano. Com isso, vários processos industriais foram
desenvolvidos para promover a secagem de alimentos, com consequente redução
da aw e, promoção da preservação destes (OLIVEIRA; BRANDÃO; SILVA, 2016).
Os alimentos secos têm o seu peso reduzido, o que facilita o seu transporte e
armazenamento e devem apresentar como características um teor de água inferior
a 25g/100g e atividade de água abaixo de 0,6 (STEVENSON et al., 2015; DE
BRUIJN et al., 2016). Neste conceito, a liofilização tem sido empregada na indústria
de alimentos em diversos tipos de produtos.
Lilli et al. (2015) compararam a eficácia das secagens por liofilização e por
pulverização da proteína da clara do ovo fosforilada com tripolifosfato de sódio
(TPF). Os pós liofilizados foram superiores em termos de solubilidade, estabilidade
da emulsão, capacidade de retenção de água, capacidade de absorção de óleo e
água e resistência ao calor quando comparados aos pós secados por pulverização.
Os resultados na viscosidade não mostraram diferenças significativas entre
liofilizados e pulverizados. Já em termos de capacidade de formação de espuma e
estabilidade desta, os pós secos por pulverização foram melhores. No entanto, a
secagem por pulverização exigiu o tempo mais longo. Com isso, a liofilização foi
considerada o melhor método em termos de produção de pós da proteína da clara
do ovo modificados, com propriedades funcionais superiores.
A capacidade de retenção de compostos bioativos em framboesas
desidratadas por liofilização e por convecção a ar foi avaliada por Sette et al. (2017),
os resultados apontaram uma maior retenção de compostos bioativos nas amostras
submetidas a secagem por liofilização. López et al. (2016) avaliaram os efeitos de
cinco métodos de secagem diferentes: secagem por convecção, secagem a vácuo,
liofilização, secagem por radiação infravermelha e secagem solar em várias
propriedades características das bagas de murta do sul do Chile. O processo de
liofilização causou menos danos aos componentes bioativos, os flavonoides totais
permaneceram praticamente inalterados. As amostras liofilizadas apresentaram
ainda maior taxa de reidratação e a capacidade de retenção de água,
significativamente diferente das amostras dos outros métodos de secagem. A
microestrutura das amostras liofilizadas mostrou semelhança com a das bagas não
processadas, enquanto ocorreu colapso da parede celular notável durante os
demais processos de secagem.
Grãos de Kefir foram liofilizados para preservar a atividade microbiana e
prolongar a vida útil, determinando a melhor temperatura de armazenamento. Os
grãos foram liofilizados e posteriormente foram armazenados em um filme de
plástico multicamada com uma barreira de umidade durante 90 dias a temperaturas
variáveis. A atividade microbiana continuou até o 60º dia de armazenamento a 4ºC.
A análise de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para determinar
o Lactobacillus Kefiranofaciens como um micro-organismo de indicação de
atividade constante. Concluiu-se que a conservação de grãos de Kefir por meio de
liofilização protege a microbiota interna incorporada, prolongando a vida útil dos
grãos (KOK-TAS, 2015).
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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Artigo 1
Efeito crioprotetor de maltodextrina e sacarose na viabilidade celular do Kefir de leite submetido à secagem por liofilização
RESUMO
Kefir é uma bebida fermentada exclusivamente por grãos de Kefir, constituída por
uma colônia de micro-organismos simbióticos imersos em uma matriz de
polissacarídeo e proteínas, que apresenta potencial probiótico. No entanto, a
instabilidade dos micro-organismos, tem levado a procedimentos de secagem,
como a liofilização, visando o aumento da estabilidade, maior flexibilidade para
consumo e manutenção da viabilidade celular. Todavia, o congelamento que
antecede a liofilização é uma etapa crítica, o que leva a necessidade de utilizar
crioprotetores para evitar a lioinjúria. Objetivou-se neste estudo desenvolver e
caracterizar físico-química e microbiologicamente Kefir de leite liofilizado, avaliando
o efeito crioprotetor de maltodextrina e sacarose na manutenção da viabilidade
celular. O processo de fermentação sem agitação, durante 24h, com a proporção
de 5% de grãos de Kefir foi realizado em leite UHT e em leite pasteurizado, as
bebidas obtidas foram analisadas em termos de pH, acidez, atividade de água,
sólidos solúveis totais, lactose, umidade, cinzas, proteínas, lipídeos e carboidratos.
O perfil microbiológico das amostras foi traçado pela contagem total de bactérias e
leveduras, isolamento e identificação dos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium,
Acetobacter, Enterococcus e Candida. As bebidas apresentaram diferenças na
composição físico-química e microbiológica. O Kefir fermentado em leite
pasteurizado apresentou melhor composição nutricional e maior concentração
celular, sendo este submetido a liofilização. Foi realizado um planejamento fatorial
completo 22 com 4 pontos fatoriais e 3 pontos centrais, totalizando 7 ensaios. Os
efeitos crioprotetores de maltodextrina e sacarose foram avaliados pela contagem
total de bactérias e leveduras após a liofilização. Os resultados evidenciaram maior
influência da sacarose na preservação dos micro-organismos com taxa de
sobrevivência celular de bactérias de 97,71% em MRS e 96,68% em M17 e 89,63%
para leveduras. A sobrevivência das bactérias isoladas dos liofilizados, em escala
decrescente, foi de Enterococcus durans, Acetobacter spp., Bifidobacterium spp.,
Lactobacillus spp. Diante destes resultados, foi selecionado o ensaio com 10% de
sacarose e submetido à avaliação físico-química, cujos resultados demonstram boa
qualidade nutricional e viabilidade celular satisfatória com potencial efeito
probiótico.
Palavras-chaves: Alimentos Funcionais. Crioproteção. Desidratação. Probióticos.
ABSTRACT
Kefir is a drink fermented exclusive by grains of Kefir, it is constituted by a colony of
symbiotic microorganism immerses in a matrix of polysaccharides and proteins, that
presents probiotic potential. Meanwhile, the instability of the microorganism, has
conducted the dehydration procedures, as lyophilization, to intend stability
improvements, better flexibility for consumption and maintenance of cell viability.
Otherwise, the freezing process before the lyophilization is a critic phase, which
leads to the necessity to use cryoprotections to avoid the injury cell. The objective
of this study was to develop a characterized physical-chemical e microbiologically
Kefir of milk lyophilized, evaluating the effect of the cryoprotections of maltodextrin
and sucrose in the maintenance of cell viability. The process of fermentation without
agitation, among 24 hours, with the proportion of 5% grains of Kefir was realized in
UHT milk and in pasteurized milk, the drinks obtained were analyzed in pH, acidity,
activity on water, total soluble solids, lactose, moisture, ashes, proteins, lipids and
carbohydrates. The microbiological profile of the samples was made by the total
counting of bacteria and yeast, isolation and identification of the genders
Lactobacillus, Bifidobacterium, Acetobacter, Enterococcus and Candida. The drinks
presented differences in the physical-chemical composition and microbiological.
The Kefir fermented in pasteurized milk presented better nutritional composition and
higher cell concentration, when submitted to lyophilization. A complete factorial
planning was realized 22 with 4 factorial points and 3 central point, total of 7 analysis.
The cryoprotections of maltodextrin and sucrose were evaluated by the bacteria
total counting and yeast after lyophilization. The results evidenced major influence
of the sucrose in microorganism preservation with a tax of cell survival of the
bacteria of 97,71% in MRS, 96,68% in M17 and 89,63% for yeast in YGC. The
survival of the isolated bacteria of the lyophilized, in decreasing scale, was the
Enterococcus durans, Acetobacter spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. In
face of these results, the analysis selected was with 10% of sucrose and submitted
to physical-chemical evaluation, which results demonstrate good nutritional quality
and satisfactory cell viability with potential probiotic effect.
Keywords: Functional Food. Cryoprotection. Dehydration. Probiotics.
1 INTRODUÇÃO
Em busca da elaboração de produtos alimentícios que proporcionem
benefícios à saúde, a indústria de alimentos tem investido em tecnologia e
pesquisas para desenvolver produtos diferenciados pelas propriedades fisiológicas
e bioquímicas que são capazes de desempenhar no organismo humano (FRANÇA
et al., 2010). Neste contexto, destacam-se os probióticos, que através da ação de
micro-organismos vivos conferem benefícios para a saúde do hospedeiro
(FAO/WHO, 2001).
Dentre os probióticos utilizados na alimentação humana, pode-se destacar
o Kefir. Originário das montanhas do Cáucaso e considerado um dom de Deus
entre o povo muçulmano, o Kefir (derivada da palavra turca "keif", que pode ser
traduzida como bom sentimento que pode ser sentido após bebê-lo) é um produto
probiótico e benéfico para a saúde, cujo interesse de consumo tem aumentado
(LOPITZ-OTSOA; REMENTERIA; ELGUEZBAL; GARAIZAR, 2006). A bebida
láctea fermentada conhecida como Kefir, se diferencia dos leites fermentados
tradicionais (iogurte) por ser produzida, apenas, a partir de uma mistura de
leveduras e bactérias, com propriedades probióticas, conhecida como grãos de
Kefir, fermentados em leite reconstituído de vaca, ovelha, cabra integral ou
desnatado ou ainda “leites” de fonte não animal, como de coco e de soja, sucos de
fruta e/ou soluções de açúcar e melaço. Apresentando como características
sensoriais o aspecto cremoso e sabor ligeiramente ácido (KABAK; DOBSON, 2011;
MAGALHÃES et al., 2011).
Os grãos de Kefir são compostos de proteínas, lipídios e um polissacarídeo
solúvel, o complexo Kefiran, que envolve e mantém a simbiose entre leveduras e
bactérias. O Kefiran, no organismo, atua na diminuição da pressão sanguínea, na
imunomodulação, na proteção do epitélio, no aumento da atividade fagocitária dos
macrófagos peritoneais e pulmonares e aumento das células IgA nestes locais, na
atividade antitumoral, na atividade antimicrobiana e na atividade anti-inflamatória
(LIU et al., 2002; RODRIGUES et al., 2005; DUARTE et al., 2006; VINDEROLA et
al., 2006; MOREIRA et al., 2008; PIERMARIA et al., 2010; MEI et al., 2016).
Entretanto, diferentes fatores que podem afetar o comportamento de micro-
organismos e os diferentes ambientes onde os alimentos se encontram devem ser
considerados, pois podem interferir no requisito essencial onde os probióticos
necessitam atingir, o intestino. Com isso, diferentes estratégias tecnológicas que
objetivam conservar e manter a viabilidade celular dos probióticos têm sido
utilizadas, como tecnologias de secagem (SOUZA et al., 2011; PRISCO;
MURIELLO, 2016).
O processo de liofilização consiste em uma secagem por sublimação sob
vácuo, onde a água ou a substância aquosa passa da fase sólida direto para a fase
vapor, minimizando várias reações de degradação que ocorrem durante a
secagem, como a reação de Maillard, desnaturação de proteínas e reações
enzimáticas. Portanto, é considerado como o meio mais eficaz de se obter produtos
desidratados com alta qualidade sensorial e com boa viabilidade celular (ATALAR;
DERVISOGLU, 2015). Porém, uma etapa crítica da liofilização é o congelamento
que antecede o processo e pode causar lioinjúrias celulares irreversíveis. Assim,
objetivando minimizar tais efeitos indesejáveis tem sido feito uso da crioproteção
através de vários agentes, como álcoois e carboidratos (AGUIAR et al., 2012).
Portanto, objetivou-se com este estudo produzir Kefir de leite por liofilização,
a partir de um estudo avaliando a utilização de leites submetidos a diferentes
tratamentos térmicos e o efeito crioprotetor da maltodextrina e da sacarose na
viabilidade celular de micro-organismos presentes no produto desidratado.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Manipulação e manutenção dos grãos de Kefir
Os grãos de Kefir de leite foram adquiridos por doação proveniente do
laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal de Pernambuco
– Centro Acadêmico de Vitória (CAV), localizado na Zona da Mata Sul de
Pernambuco. Os leites utilizados nesta pesquisa foram adquiridos no comércio
local. Os grãos foram inoculados em concentração de 5% (p/v) em duas bases
lácteas: leite integral UHT (Bom Leite®) e leite integral pasteurizado (Bom Leite®),
nomeadas como KA e KB, respectivamente. O desenvolvimento e obtenção das
bebidas seguiram as etapas descritas no fluxograma apresentado na figura 1.
Figura 1 – Fluxograma da metodologia para a obtenção das bebidas fermentadas a partir dos grãos de Kefir
Fonte: Adaptado de Prado et al, 2015.
As bebidas foram fermentadas no Laboratório de Processamento de
Alimentos do Departamento de Ciências Domésticas da Universidade Federal de
Pernambuco, campus sede, Recife – PE. A fermentação ocorreu sem agitação em
erlenmeyers de 500mL previamente esterilizados, sendo incubadas em estufa com
circulação e renovação de ar a 25ºC por 24h. A seguir, procedeu-se a tamisagem
em peneira, sob assepsia, onde os grãos retidos na tamisagem foram novamente
inoculados, repetindo-se as etapas acima descritas. As bebidas fermentadas
obtidas foram mantidas sob refrigeração a 6ºC em BOD (Biochemical Oxygen
Demand) para maturação, em seguida foram realizadas as etapas de
caracterização das mesmas.
Após o período de maturação, as bebidas foram analisadas quanto aos
parâmetros físico-químicos e microbiológicos, sendo a que apresentou melhores
resultados, selecionada para secagem por liofilização.
2.2 Caracterização físico-química
As análises físico-químicas foram realizadas no Laboratório de Análise
Físico-Química de Alimentos do Departamento de Ciências Domésticas da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, campus sede, Recife – PE.
2.2.1Acidez titulável e pH
A determinação de acidez titulável foi realizada através da titulação com
solução de álcali padrão a acidez do produto, utilizando-se o indicador fenolftaleína
1% e NaOH (hidróxido de sódio) a 0,1N até se obter a coloração rósea permanente
por 30 segundos, conforme A.O.A.C (2002). Os resultados foram expressos g.100-
1 de ácido láctico.
O pH foi determinado utilizando phmetro de bancada calibrado com soluções
tampão de pH (4,0 e 7,0), conforme A.O.A.C (2002).
2.2.2 Atividade de água
A atividade de água foi determinada por meio do equipamento Aqualab
(4TE®, Washington, EUA), ao qual analisa a pressão do vapor de água do produto
sobre a pressão de vapor da água pura.
2.2.3 Determinação de açúcares redutores em lactose
Os açúcares totais e redutores das amostras foram determinados pelo
método volumétrico de Lane-Eynon (923.09) no qual se baseia na capacidade dos
glicídios, em meio fortemente alcalino e a quente, de formar enodiol, composto com
forte poder redutor, que em presença de Cu++ se oxida e reduz o cobre a Cu+, dando
origem a um precipitado vermelho tijolo de Cu2O. Para esta metodologia é utilizado
solução de ferrocianeto de potássio 15%, sulfato de zinco 30% com o objetivo de
retirar interferências como pigmentos, proteínas ao qual junto com as amostras
foram submetidas a filtragem para recolher o sobrenadante. Para a titulação foram
utilizadas Solução de Fehling A e Fehling B sob aquecimento até se obter o
desaparecimento da coloração azul e o surgimento da cor vermelho tijolo com a
formação de um precipitado. Para verificação do ponto de virada foi adicionado 4
gotas de azul de metileno 0,1 %, conforme A.O.A.C. (2002). Os resultados foram
expressos em g.100g-1.
2.2.4 Teor de umidade
A determinação de umidade foi realizada por balança de infravermelho
(MARTE – IDSO – Piracicaba/SP) a 105ºC durante 30 minutos. Os resultados foram
expressos em percentual (%).
2.2.5 Cinzas
A determinação de cinzas foi realizada pelo método termogravimétrico
935.42. Através da carbonização em temperatura baixa seguida da incineração das
amostras a temperatura de 550ºC em mufla. Seguindo-se de repetidas operações
de aquecimento e resfriamento até se atingir o peso constante, conforme A.O.A.C
(2002).
2.2.6 Sólidos Solúveis Totais (SST)
A determinação de sólidos solúveis totais através do uso de refratômetro
(Reichert® r2i300, New York. EUA) com os valores de índice de refração expresso
em ºBrix. A leitura das amostras foi realizada em temperatura ambiente.
2.2.7 Proteínas
A determinação de proteína foi realizada segundo o método clássico de
Kjeldahl (991.22) que se baseia na decomposição da matéria orgânica, por
combustão úmida através de aquecimento a 400ºC com ácido sulfúrico
concentrado, na presença de catalisador. O nitrogênio presente na solução ácida
resultante foi determinado por destilação por arraste de vapor, seguida de titulação
com ácido bórico diluído. O percentual da fração proteica foi calculado utilizando o
fator de conversão do nitrogênio para proteína de 6,38 (utilizado para produtos
lácteos) e fator de correção da solução de ácido clorídrico 0,1N, conforme A.O.A.C
(2002). Os resultados foram expressos em g.100g-1.
2.2.8 Lipídeos
A determinação de lipídeos foi realizada pelo método de Gerber, conforme
British Standards Institution (1989). O método se baseia na quebra da emulsão do
leite com ácido sulfúrico concentrado (densidade 1,820 – 1,830) e na utilização de
uma substância desemulsificante, o álcool isoamílico. A leitura do percentual de
gordura das amostras úmidas foi realizada de forma direta na escala do butirômetro
de Gerber. Os resultados foram expressos em g.100g-1.
2.2.9 Carboidratos Totais
A determinação de carboidratos totais foi calculada por diferença:
CT = 100 – (umidade + proteínas + lipídeos + cinzas)
Os resultados foram expressos em g.100g-1.
2.2.10 Valor Calórico
Os valores, expresso em kilocalorias (Kcal) foi calculado considerando os
fatores de Atwater para conversão dos macronutrientes:
1g Proteínas = 4Kcal
1g Carboidratos = 4Kcal
1g Lipídeos = 9Kcal
2.2.11 Cor
Os valores de cor no sistema CIE Lab foram mensurados por colorimetria,
em colorímetro (Konica Minolta, CR-400, Japão) operando em sistema CIELAB (L*
a* b*).
Onde:
L* = Luminosidade das bebidas;
a* = intensidades de cor vermelha ou verde das bebidas;
b* = intensidades da cor amarela ou azul das bebidas.
As aferições aconteceram em 5 locais diferentes com referência aos pontos
cardeais, totalizando toda a área da amostra e as leituras foram realizadas
utilizando o iluminante C.
2.3 Caracterização microbiológica
As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de
Processamento e Análise de Alimentos do Departamento de Tecnologia Rural da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, campus sede, Recife – PE e no
Laboratório Municipal de Saúde Pública do Recife – PE.
As bebidas desenvolvidas e os ensaios liofilizados foram submetidos a
diluições decimais seriadas em água peptonada 0,1% esterilizada. A primeira
diluição (10-1) foi realizada ao adicionar uma alíquota de 1 mL de cada bebida ou
1g do liofilizado em recipiente previamente esterilizado contendo 9 mL de água
peptonada 0,1%, seguindo-se de homogeneização. A partir desta diluição foram
realizadas diluições decimais seriadas até 10-7.
2.3.1 Contagem global e identificação de Leveduras
A partir das diluições decimais seriadas realizadas na etapa anterior, foram
retiradas alíquotas de 0,1 mL para serem semeadas na superfície do meio ágar
extrato de levedura enriquecido com glicose e adicionado de cloranfenicol (YGC)
com o auxílio da alça de Drigalski pelo método de espalhamento (Figura 2). As
placas foram incubadas invertidas, em condições de aerobiose, a 30ºC durante 72
horas, conforme metodologia adaptada de Manolopoulou et al. (2003).
A identificação foi realizada por automação com intermédio do sistema
VITEK® 2 Compact (Biomeurieux®) que se baseia na emissão do sinal colorimétrico
gerado pelas reações bioquímicas provocadas pelas leveduras em contato com os
reagentes presentes nos poços dos cartões YST YS07. As colônias foram diluídas
em 3mL de solução salina estéril 0,45% NaCl em tubo de ensaio, a turbidez da
suspensão foi ajustada de acordo com a escala 2 de McFarland por meio do
DensiChek (Biomeurieux®), e inoculadas nos poços do respectivo cartão.
Figura 2 – Plaqueamento pelo método de superfície para contagem global de leveduras
2.3.2 Contagem global e identificação de bactérias
A enumeração das células bacterianas viáveis foi realizada após diluições
seriadas (Item 2.4). O plaqueamento foi realizado através de pour plate, em meios
sólidos MRS (Man, Rogosa & Sharpe) (MERCK®) e M17 (SIGMA®) com alíquota
de 1mL de cada amostra (Figura 3). Em seguida, as placas foram incubadas
invertidas, em anaerobiose, a 37ºC durante 72 horas.
Figura 3 – Plaqueamento pelo método de pour plate para contagem global de bactérias
A identificação das bactérias foi realizada a partir das diluições decimais
seriadas descritas no item 2.4, com retiradas de alíquotas de 0,1 mL para serem
semeadas na superfície dos meios sólidos MRS e M17 modificados, contendo
0,002% de azul de bromofenol (Merck®) com o auxílio da alça de Drigalski pelo
método de espalhamento (Figura 4). Posteriormente, as placas foram incubadas,
em anaerobiose a 37ºC durante 48 horas. O azul de bromofenol é um indicador de
pH que promove o desenvolvimento de diferentes colorações nas colônias no meio
e detecta diferentes intervalos de pH de 3 (amarelo) a 5 (azul) gerados por bactérias
ácido-láticas, proporcionando uma maior diferenciação macroscópica entre elas
(LEE; LEE, 2008).
Figura 4 – Plaqueamento em meios modificados para isolamento de bactérias
Todas as colônias foram diferenciadas de acordo com o tempo de
crescimento, coloração, morfologia e tamanho. A coloração de Gram foi realizada
para verificar a forma celular, tamanho e características tintoriais. De acordo com
as características morfológicas de cada grupo bacteriano foram realizados testes
específicos conforme ilustra a figura 5.
Figura 5 – Desenho esquemático da identificação das bactérias
BGP: Bacilos Gram Positivos; CGP: Cocos Gram Positivos
Os Cocos Gram Positivos (CGP) foram submetidos ao teste para a presença
de catalase. As cepas com teste negativo foram identificadas por automação com
o uso do sistema VITEK® 2 Compact (Biomeurieux®) que se baseia na emissão do
sinal colorimétrico gerado pelas reações bioquímicas provocadas pelas bactérias
em contato com os reagentes presentes nos poços dos cartões AST 285. As
colônias foram diluídas em 3mL de solução salina estéril 0,45% NaCl em tudo de
ensaio, a turbidez da suspensão foi ajustada de acordo com a escala 0,5 de
McFarland determinada por meio do DensiChek (Biomeurieux®), e inoculadas nos
poços do repectivo cartão.
Isolados que apresentaram características microscópicas Gram variável, em
forma pleomórfica (esférica, alongada ou curvada) e produtoras da enzima catalase
foram inoculadas em tubos de ensaio contendo caldo GEY - glicose (2%), etanol
(5%) e extrato de levedura (1%) com pH do meio ajustado para 4,5. Os inóculos
foram incubados a 30ºC em aerobiose por 3-5 dias para se obter o crescimento
adequado verificado pela formação de uma película, através do qual foi observada
uma turbidez uniforme do meio e um depósito celular. Após o período de incubação,
uma alíquota de 10µL da cultura foi semeada em GEY-ágar contendo 0,3% de
CaCO3 (p/v). Bactérias do gênero Acetobacter spp. no meio GEY-ágar produzem
ácido acético a partir de etanol, promovendo a dissolução do carbonato de cálcio
em torno das colônias e ocasionando a formação de uma zona clara ao redor destas
(KOMMANEE et al., 2008).
Os Bacilos Gram Positivos (BGP) foram submetidos aos testes para a
presença de catalase e de citocromo oxidase (apenas para as colônias suspeitas
de pertencerem ao gênero Lactobacillus).
2.4 Delineamento experimental da obtenção da bebida liofilizada
Para obtenção da bebida liofilizada foi realizado um planejamento fatorial 22,
com 4 pontos fatoriais (níveis + 1) e 3 pontos centrais (nível 0), totalizando 7
ensaios. As variáveis independentes foram: Maltodextrina (%) e Sacarose (%),
conforme tabela 1. As variáveis dependentes foram: Contagem de Bactérias em
meio de cultura MRS (log UFC/g), Contagem de Bactérias em meio de cultura em
M17 (log UFC/g) e Contagem de Leveduras em meio de cultura YGC (log UFC/g).
Os dados obtidos foram ajustados ao seguinte polinômio:
MSSMtCTY 12210),,( (1)
Em que βn são os coeficientes de regressão, y é a resposta em questão
(contagens de bactérias nos meios MRS e M17 e leveduras no meio YGC) e M e S
são as variáveis independentes (Maltodextrina e Sacarose, respectivamente).
Tabela 1 – Níveis codificados e decodificados das variáveis independentes
Variáveis -1 0 1
Maltodextrina (%) 0 4 8 Sacarose (%) 0 5 10
Todas as etapas da liofilização foram realizadas no campus de Vitória de
Santo Antão da Universidade Federal de Pernambuco. O manuseio das bebidas
para adição dos crioprotetores foi realizado no Laboratório de Microbiologia de
Alimentos. Os 7 ensaios foram congelados em ultra freezer a –80ºC em overnight,
no Laboratório de Tecnologia de Biomateriais. Subsequentemente, foram
submetidas ao processo de liofilização (SP Scientific Sentry 2.0) a uma temperatura
de –50ºC e vácuo de 100mT no Laboratório de Tecnologia de Alimentos. A
estocagem dos pós liofilizados foi realizada em frascos de penicilina de vidro
estéreis e hermeticamente fechados sob refrigeração.
A sobrevivência dos micro-organismos foi determinada por meio da
contagem de células viáveis após a reidratação dos pós em água peptonada 0,1%
esterilizada, conforme ilustrado nas figuras 2 e 3. O cálculo para determinação da
taxa de sobrevivência foi realizado pela Equação 2:
(2)
Onde No e N representam o número de micro-organismos antes (Kefir) e
após a secagem (Kefir liofilizado), respectivamente.
O ensaio do planejamento que apresentou melhor resposta quanto as
variáveis dependentes foi submetido a caracterização físico-química (pH, acidez,
atividade de água, umidade, açúcares redutores em lactose, proteínas, e
carboidratos, conforme descritos no item 2.2. Os resultados das análises de
lipídeos e cor foram processados em fórmulas para melhor expressar tais
parâmetros.
A análise de lipídeos foi realizada pelo método de Gerber, conforme British
Standards Institution (1989). O teor lipídico do pó lifolizado foi obtido através da
equação:
% de Lipídeos = L x 11,33 / m (3)
Onde L = leitura no butirômetro; 11,33 = massa em gramas de 11mL da
amostra fluida usada nos butirômetros para leite; m = massa da amostra, em
gramas.
A análise de cor foi realizada no sistema CIE Lab foram mensurados por
colorimetria, em colorímetro (Konica Minolta, CR-400, Japão) operando em sistema
CIELAB (L* a* b*). A diferença de cor foi calculada por meio da média da cor (ΔE*)
entre bebidas fermentadas por grãos de Kefir antes e após a secagem por
liofilização, segundo a equação:
ΔE* = [(L*-L0)2 + (a*-a0*)2 + ((b*-b0*)2]1/2 (4)
Onde:
ΔE* = diferença de cor
L0* e L* = Luminosidades das bebidas antes e após a secagem por
liofilização, respectivamente;
a0* e a* = intensidades de cor vermelha ou verde das bebidas antes e após
a secagem por liofilização, respectivamente;
b0* e b* = intensidades da cor amarela ou azul das bebidas antes e após a
secagem por liofilização, respectivamente.
As aferições aconteceram em 5 locais diferentes com referência aos pontos
cardeais, totalizando toda a área da amostra e as leituras foram realizadas
utilizando o iluminante C.
2.5 Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as
médias comparadas pelo teste de Duncan (p < 0,05) para comparação entre as
médias, através do software estatístico Statistica for Windows 6.0 (STATSOFT,
1997).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Composição físico-química de Kefir de leite integral pasteurizado e Kefir de
leite integral UHT
A composição físico-química das bebidas produzidas com leite pasteurizado
e leite UHT fermentados com concentração de 5% de grãos de Kefir durante 24h
estão descritos na tabela 2.
Tabela 2 – Composição físico-química de Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).
Análises Bebidas
KA KB
pH 3,68±0,015b 3,76±0,015a
Acidez (g.100g-1 de Ác. Láctico) 0,965±0,025a 0,936±0,025a
Sólidos Solúveis Totais (%) 6,6±0,0a 6,6±0,0a
Lactose (g.100g-1) 3,11±0,010b 3,38±0,020a
Aw 0,9903±0,0005a 0,9887±0,0002b
Cor
L* 86,52±0,88a 87,92±0,11a
a* -2,870±0,106a -1,950±0,062b
b* 5,48±0,43b 8,91±0,12a
Médias com letras iguais na horizontal não diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste “t” de student;
KA = Kefir fermentado em leite integral pasteurizado; KB = Kefir fermentado em leite integral UHT
As duas amostras diferiram estatisticamente entre si quanto ao pH (p<0,05),
com valores mais baixos para KA, e ambos dados foram inferiores ao pH típico do
Kefir que varia entre 4,0 e 4,4 (IRIGOYEN; ARANA; CASTIELLA; TORRE; IBÁÑEZ,
2005). Isto pode ser esclarecido pela acidificação decorrente do aumento dos ciclos
fermentativos e consequente liberação dos ácidos advindos do metabolismo das
bactérias e leveduras que se tornam cada vez mais ativas durante o bioprocesso
(WANG et al., 2016). De forma semelhante, Fiorda et al. (2016) em estudo que
acompanhou as mudanças de pH do tempo 0 até 48h de fermentação verificaram
um decréscimo deste ao longo do processo, atingindo valores abaixo de 4,0 em
24h, mas diferentemente KöK-Taş et al. (2013) obtiveram pH de 4,47 após 22h de
fermentação possivelmente devido a menor concentração dos grãos de Kefir de
2%.
Quanto ao teor de ácido láctico, encontrado nas duas amostras, os dados
não diferiram significativamente entre si (p>0,05). Os valores encontrados
corroboram com a legislação brasileira vigente que preconiza um percentual menor
que 1% para leite fermentado com grãos de Kefir (BRASIL, 2007). Kavas (2015)
encontrou valor mais baixo para ácido láctico (0,81%) em leite de vaca fermentado
com 2,5% de grãos de Kefir, já no leite de camelo fermentado com 5% de grãos de
Kefir o teor de ácido lático foi maior (0,92%), semelhante a este estudo,
evidenciando que maiores concentrações de grãos de Kefir tendem a elevar a
quantidade de ácido láctico, acidificando a base láctea na qual foi inoculado.
Quanto ao teor de lactose, houve diferença significativa (p<0,05) nos
resultados encontrados, com menor teor na amostra KA. O valor obtido na análise
de KB assemelha-se ao encontrado por Ohlsson et al. (2017) que obtiveram 3,36%
em Kefir de leite integral, cujos valores foram inferiores aos encontrados por
Kucerová et al (2017) em leite (4,6%) e em iogurte (3,9%), comprovando a ação da
β-galactosidase, naturalmente presente nos grãos de Kefir, sobre a lactose,
reduzindo-a a valores toleráveis por pessoas com diagnóstico de intolerância a
lactose (AHMED et al., 2013).
Segundo Tronco (2010) o leite e grande parte de seus produtos lácteos é
formado predominantemente de água, com percentual de cerca de 87,3%, o que
representa valores elevados para atividade de água. No presente estudo, este
parâmetro, mostrou diferença significativa (p<0,05) entre as duas amostras, com
valores de 0,9903 em KA e 0,9887 em KB, próximos aos encontrados por Tavares
et al. (2011) que obtiveram média de 0,98% de água livre em Kefir.
Os sólidos solúveis totais (SST) presentes nas duas amostras não diferiram
estatisticamente entre si (p>0,05), com média de 6,6ºBrix. Os baixos valores
corroboram com a formulação das bebidas desenvolvidas que não receberam
adição de solutos. Ademais a fermentação do leite pelos micro-organismos propicia
menores valores de sólidos solúveis, conforme verificado por Fernandes et al.
(2017) ao analisar os SST em leite de soja não fermentado obtendo valores de 4,4
a 4,8ºBrix, enquanto que no leite de soja fermentado por Kefir encontrou uma
redução acentuada nos sólidos, chegando a níveis de 1,23 a 1,27ºBrix. A correlação
da fermentação e decréscimo dos SST também foi elucidada por Corona et al.
(2016) em estudo de sucos de cenoura, erva-doce, melão, cebola, morango e
tomate fermentados por Kefir, com valores de 3,38; 1,87; 3,83; 9,17; 2,47 e
1,97ºBrix, respectivamente, a medida que os mesmos sucos não fermentados
reportaram valores de 8,15; 4,45; 10,05; 9,95; 5,95 e 4,45ºBrix.
A análise de cor é de grande importância nos alimentos, uma vez que está
intimamente relacionada com a qualidade do produto analisado. O parâmetro L*
que indica luminosidade não apresentou diferença significativa (p>0,05) entre as
duas amostras, nas quais foram encontrados valores mais próximos de 100
(branco), justificado pelo uso de leite como base láctea. Entretanto, as amostras
diferiram estatisticamente entre si (p<0,05) nos valores de a* e b*. Ambas
apresentaram valores negativos para a* que corroboram com a ausência da
coloração vermelha e pouca incidência de verde, com valores mais negativos na
bebida KA. Os valores do parâmetro de cromaticidade b* apresentaram-se positivos
nas duas bebidas, devido a uma tendência para o amarelo justificada pela
integridade do teor de lipídeos das duas bases lácteas utilizadas. Todos os
parâmetros de cor (L*, a*, b*) corroboram com os encontrados por Ribeiro (2015),
em análises de Kefir de leite integral, com valores elevados de L*, negativos para
a* e positivos para b*.
3.2 Composição centesimal de Kefir de leite integral pasteurizado e Kefir de leite
integral UHT
Os valores relativos a composição centesimal (umidade, calorias, proteínas,
lipídeos, carboidratos e cinzas) das bebidas produzidas com leite pasteurizado e
leite UHT fermentadas com grãos de Kefir estão descritos na tabela 3.
Tabela 3 – Composição centesimal de Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).
Análises Bebidas
KA KB
Umidade (%) 88,41±0,40a 88,47±0,16a
Proteína (g.100g-1) 2,60±0,17a 2,83±0,11a
Lipídeos (g.100g-1) 2,80±0,10a 2,03±0,06b
Carboidratos (g.100g-1) 5,67±0,19a 5,99±0,13a
Cinzas (g.100g-1) 0,52±0,03b 0,68±0,06a
Calorias (Kcal.100g-1) 58,28±2,10a 53,55±1,00b
Médias com letras iguais na horizontal não diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste “t” de student
Na composição centesimal, as bebidas não diferiram significativamente
(p>0,05) entre si quanto à umidade, proteínas e carboidratos, com valores médios
de 88,44%, 2,72g/100g e 5,83g/100g, respectivamente. O percentual de umidade
encontrado nas bebidas foi semelhante ao encontrado por Ribeiro (2015) que
constatou teores de 88,56 a 89,41% em amostras de Kefir oriundos da região
Noroeste do Rio Grande do Sul. Os valores de proteína revelaram um teor
ligeiramente abaixo do preconizado pela legislação brasileira vigente que
determina o mínimo de 2,9% (BRASIL, 2007). Os teores de carboidratos foram
inferiores aos encontrados por Carneiro (2010) que obteve 8,12g/100g em Kefir de
leite. Menores valores protéicos e de glicídeos estão relacionados a altas taxas de
crescimento de bactérias ácido lácticas, tendo em vista que estas para se
desenvolverem exigem nutrientes complexos como os aminoácidos e peptídeos,
além de promoverem a metabolização de carboidratos (ABDEL-RAHMAN et al.
2013).
Os valores encontrados para lipídeos diferiram significativamente (p<0,05)
entre as bebidas (KA e KB), com valores 2,80g e 2,03g, respectivamente, sendo
inferiores ao preconizado pela legislação brasileira vigente para Kefir em leite
integral que recomenda teores entre 3,00 e 5,9% (BRASIL, 2007). Em
contrapartida, a FAO/WHO (2003) traz uma maior abrangência para o parâmetro
lipídeos em Kefir, com percentual <10%, independente se a base láctea utilizada
na fermentação é integral, desnatada ou parcialmente desnatada. Em 2011,
Magalhães et al., avaliaram o Kefir brasileiro e evidenciaram que o mesmo continha
2,34% de gordura após 24h de fermentação, resultado semelhante ao encontrado
no presente estudo com mesmo tempo de fermentação.
Os teores de cinzas das bebidas analisadas diferiram significativamente
entre si (p<0,05), com maior teor para KB com 0,68%, semelhante ao encontrado
por Ribeiro (2015) que obteve 0,71% de cinzas em Kefir. O valor calórico diferiu
significativamente (p<0,05) entre as duas bebidas, sendo maior para KA
(58,28Kcal) em detrimento de KB (53,55Kcal). A maior quantidade de calorias em
KA é consequência do maior percentual lipídico encontrado na amostra. Entretanto,
Carneiro (2010) encontrou 70,56Kcal para Kefir de leite, sendo superior aos
achados neste estudo.
3.3 Concentração celular de bactérias e leveduras em Kefir de leite integral
pasteurizado e Kefir de leite integral UHT
Os resultados quanto a contagem microbiológica de bactérias e leveduras
nas bebidas analisadas estão descritos na tabela 4. A composição microbiológica
natural do Kefir, evidencia maior presença de bactérias que leveduras o que
corrobora com os resultados encontrados, cujos valores, para ambos tipos de
micro-organismos, estão de acordo com a legislação vigente que preconiza o
mínimo de 4 Log UFC/g para leveduras e 7 Log UFC/g para bactérias (BRASIL,
2007). Atalar et al. (2015) encontraram resultados inferiores para leveduras, entre
4,54-5,89 Log UFC/mL. As contagens de leveduras do presente estudo são
semelhantes aos descritos por Guzel-Seydim et al. (2005) que obtiveram 6,16 Log
UFC/mL. As leveduras foram identificadas por automação com 99% de
sensibilidade para Candida krusei, cuja espécie foi encontrada por Witthuhn et al.
(2005) compondo a microbiota do Kefir. Pedersen et al. (2012) isolaram C. krusei
de cereal fermentado da África e avaliaram seu potencial probiótico, o que foi
comprovado pela avaliação da sobrevivência em sais biliares, baixo pH,
crescimento em células epiteliais e resistência transepitelial.
Quanto a contagem de bactérias, os resultados encontrados corroboram
com Garofalo et al. (2015) que analisaram Kefir de diferentes regiões da Itália e
obtiveram concentrações celulares de bactérias variando de 7,38 a 9,04 Log UFC/g
em MRS.
Tabela 4 – Concentração celular total de bactérias e leveduras em Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).
Micro-organismo Meios de culturas
Bebidas
KA (Log UFC/g)
KB (Log UFC/g)
Bactérias MRS 7,41±0,07Ba 7,16±0,02Bb
M17 9,485±0,007Aa 9,447±0,003Ab Leveduras YGC 6,46±0,08a 6,29±0,09a
abc Médias com letras iguais na horizontal não diferem significativamente (p<0,05) pelo teste “t” de student; ABC Medias seguidas de letras iguais na vertical não diferem significativamente pelo teste de Duncan (p<0,05)
As interações entre bactérias e leveduras em Kefir são complexas e ainda
não foram totalmente elucidadas. Sabe-se que através desta interação pode
ocorrer estímulo ou inibição de uma ou ambas, uma vez que há competição por
nutrientes que favorecem o crescimento e, também, há produção de metabólitos
que podem inibir ou estimular umas em detrimento das outras (LOPITZ-OTZOA et
al., 2006). Entretanto, quando as bactérias do Kefir são separadas das leveduras,
não há um crescimento eficiente, evidenciando a importância da interação e da
união destas (PRADO et al., 2015).
Prado et al. (2015) evidenciaram que a composição microbiológica do Kefir
é influenciada pela origem do grão, tempo e condição de fermentação, temperatura,
tipo do leite, concentração de grãos inoculados, entre outros fatores. No presente
estudo, as bebidas elaboradas variaram apenas quanto aos tratamentos térmicos
dos leites utilizados, o que não demonstrou diferença significativa na concentração
de leveduras nos produtos finais. Em contrapartida, foi suficiente para diferir
significativamente quanto a concentração celular de bactérias, com maior
predominância na bebida com leite pasteurizado (KA).
Os resultados encontrados evidenciam que o leite submetido à
pasteurização, tratamento térmico brando, propiciou um ambiente mais favorável
para o desenvolvimento bacteriano quando comparado ao leite tratado em
temperatura ultra elevada (UHT). Pestana et al. (2015) avaliaram o efeito da
pasteurização e do processamento UHT na composição físico-química e no perfil
de ácido graxos em leite bovino, cujos resultados não evidenciaram alteração
substancial na composição físico-química e no perfil de ácidos graxos dos leites.
Sabe-se, que o tratamento térmico em temperaturas mais elevadas provoca
desnaturação de proteínas, acúmulo de reação não-enzimática (reações de
Maillard) e inicia processos oxidativos que deterioram a qualidade dos produtos
UHT durante o armazenamento, podendo resultar em redução da qualidade
(JANSSON et al., 2014; JIANG et al., 2017). O leite UHT demonstrou ser menos
favorável para o desenvolvimento de bactérias, o que corrobora com a diferença da
concentração celular encontrada nas duas bebidas desenvolvidas (Tabela 4).
Além disso, a contagem celular de bactérias em meio sólido M17 foi
consideravelmente mais elevada do que em meio sólido MRS, com diferença
significativa de 2 ciclos logarítmicos nas duas amostras. A composição dos dois
meios utilizados (Anexo A) para contagem de bactérias apresenta particularidades
que influenciaram na taxa de crescimento bacteriano.
As fontes de nitrogênio, vitaminas do complexo B e íons essenciais para o
crescimento de micro-organismos não apresentam grandes diferenças, uma vez
que os dois meios são compostos por caseína hidrolisada, extratos de carne e
leveduras e magnésio. As diferenças entre os dois meios de culturas estão na fonte
de carbono. O MRS contém citrato, acetato e Tween 80, que não são encontrados
no M17. O Tween 80 não configura como uma fonte primordial que implicaria em
uma deficiência do M17, uma vez que este só passa a ser consumido após a
utilização de outros fatores de crescimento, sobretudo quando o meio é rico em
proteínas (AL-NASERI et al., 2013), como é o caso do M17 que além da caseína,
dispõe de peptona de carne e de soja não encontradas no MRS.
Ademais, os dois meios contêm sais que disponibilizam fosfato para os
micro-organismos, sendo que o sal β-glicerofosfato dissódico pentahidratado do
M17 aumenta a estabilidade do meio sendo compatível com o cálcio, exercendo
importante papel na adsorção de íons metálicos e impede a cristalização de sais,
desta forma oferece maior flexibilidade em atender as necessidades de fosfato sem
alterar o uso de outros eletrólitos (DING et al., 2015).
A maior fonte de carboidrato do MRS é a glicose que já se encontra na
composição do próprio meio e sofre ação do calor na autoclavagem,
desencadeando a reação química, não-enzimática, conhecida como reação de
Maillard (JIANG et al., 2017), evidenciada pelo escurecimento do meio após
esterilização. Em contrapartida, a fonte de carbono do M17 é a lactose adicionada
após autoclavagem o que minimiza perdas e reações indesejadas no aquecimento
durante a esterilização. Portanto, os nutrientes que compõem o M17 encontram-se
mais biodisponíveis no meio pronto o que propicia uma maior taxa de crescimento
de micro-organismos quando comparado ao MRS.
3.4 Isolamento de bactérias
As duas bebidas apresentaram diversidade bacteriana semelhante,
diferindo, apenas, em um tipo de Lactobacillus spp que não foi isolado na bebida
KB. Todos os isolados se encontravam em maior concentração em KA, com
exceção do gênero Acetobacter spp que apresentou maior contagem em KB, o que
pode ser justificado pela menor concentração e diversidade celular em KB e
consequente menor competição por nutrientes (Tabela 5)
Tabela 5 – Bactérias isoladas de Kefir elaborado com leite pasteurizado (KA) e UHT (KB).
abc Médias seguidas de letras iguais na horizontal , no mesmo meio de cultura e microrganismo não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste “t” de Student; ABC Médias seguidas de letras iguais na vertical no mesmo microorganismos entre os meios de cultura não diferem significativamente (p>0,05) pelo “t” de Student. *Sugestivo de Lactobacillus spp.; **Sugestivo de Bifidobacterium spp.; ***Meios de cultura com adição de 0,002% de azul de bromofenol.
Houve diferença significativa (p<0,05) na contagem dos isolados por tipo de
meio de cultura, com valores maiores no meio M17, com exceção do sugestivo de
Identificação Meios de cultura***
Bebidas
KA KB
(Log UFC/g) (Log UFC/g)
Enterococcus durans MRS 4,39±0,13Ba 4,24±0,34Ba M17 5,23±0,04Aa 5,06±0,03Ab
Bifidobacterium spp**
MRS 5,15±0,21Aa 4,54±0,34Ab M17 5,15±0,21Aa 4,15±0,21Ab
Lactobacillus spp *1 MRS 8,41±0,02Aa 6,65±0,02Ab M17 4,65±0,07Ba 4,54±0,08Ba
Acetobacter spp MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 7,77±0,01Ab 8,55±0,00Aa
Lactobacillus spp *2 MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 6,37±0,06Aa 6,30±0,07Aa
Lactobacillus spp *3 MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Aa
M17 6,00±0,03Aa 0,00±0,00Ab
Lactobacillus spp 1, cuja maior concentração foi evidenciada no MRS nas duas
bebidas. Os resultados evidenciam que os meios sólidos M17 e MRS não foram
seletivos, tendo em vista que em ambos foram isolados Enterococcus durans,
Bifidobacterium spp e Lactobacillus spp, com exceção do sugestivo de
Lactobacillus spp 3, isolado apenas na bebida KA e no meio M17, e Acetobacter
spp que não foi isolado no MRS, mas foi isolado no M17, mesmo este não sendo
um meio específico para este gênero, nos dois tipos de Kefir.
Acetobacter spp, por ser mais fastidioso, para crescer em placas junto com
outros micro-organismos, necessitou de uma exigência maior por nutrientes,
portanto, pelos fatores já discutidos anteriormente acerca do M17 quanto a
biodisponibilidade de nutrientes, o ambiente criado neste meio de cultura, foi mais
favorável para que o Acetobacter spp. encontrasse condições para se desenvolver.
Além disso, a presença de β-glicerofosfato dissódico pentahidratado no M17, por
este ser um derivado fosfórico do glicerol, constitui uma das melhores fontes de
carbono para Acetobacter spp. (SANTOS JÚNIOR, 2009), respaldando o
crescimento no M17 e o não crescimento no MRS. A confirmação da identificação
do Acetobacter spp., em meio específico, está ilustrada na figura 6.
Figura 6 – Crescimento de Acetobacter spp. em caldo GEY e GEY-Ágar
A: Caldo GEY sem inóculo (controle); B: Caldo GEY inoculado com Acetobacter spp.; C: Crescimento das colônias de Acetobacter spp. inoculado na superfície do meio sólido GEY e a presença de um halo em torno do inóculo.
O crescimento de Acetobacter spp. em caldo GEY foi caracterizado pelo
surgimento de uma película que gerou uma turbidez uniforme e um depósito celular
(6B) e, em meio GEY sólido adicionado de CaCo3, o Acetobacter spp. formou ácido
acético a partir de etanol, provocando a dissolução do carbonato de cálcio em torno
das colônias e consequente formação de uma zona clara (Figura 6C) ao redor
destas.
O gênero Enterococcus faz parte do grande grupo de bactérias do ácido
láctico, entretanto é pouco estudada para fins probióticos e seu isolamento em Kefir
não é comum. Garofalo et al. (2015), isolaram e identificaram Enterococcus durans
de grãos de Kefir de três regiões distintas da Itália. No presente estudo
Enterococcus durans foi identificado nas duas bebidas de Kefir desenvolvidas,
sendo confirmadas por automação com 99% de sensibilidade. Os potenciais efeitos
probióticos desta espécie foram estudas por Pieniz (2013) que ao analisar E.
durans verificou que este é resistente ao trato gastrointestinal, e possui capacidade
de exercer atividade antimicrobiana e antioxidante, apresentando-se como uma
estirpe probiótica promissora.
Bifidobacterium, juntamente com os Lactobacillus, formam os gêneros mais
estudados e empregados por seus efeitos probióticos. Porém o gênero
Bifidobacterium é nutricionalmente exigente, o que torna difícil o seu crescimento e
isolamento em Kefir, que apresenta uma composição microbiológica diversificada
gerando um ambiente de intensa competição por nutrientes. Leite et al. (2012) ao
analisarem o perfil microbiológico dos grãos de Kefir brasileiro isolaram o gênero
Bifidobacterium, enquanto em outro estudo desenvolvido por Kök-Taş et al. (2012)
Bifidobacterium bifidum foi isolado do grão de Kefir turco, entretanto a literatura não
relata o isolamento deste gênero na bebida. Salienta-se que o isolamento do
gênero Bifidibacterium spp. foi verificado duas formulações de Kefir desenvolvidas,
com maior concentração no Kefir fermentado em leite pasteurizado (Tabela 5).
O não isolamento do gênero Lactococcus, que é frequentemente encontrado
em Kefir, cujo meio de referência utilizado em sua identificação é o M17 (GEMELAS
et al., 2013) pode ter ocorrido devido a acentuada acidez das bebidas (Tabela 1) e
consequente aumento de ácido láctico, uma vez que este micro-organismo é
sensível a valores baixos de pH e consequente maior concentração de ácido láctico
na forma não dissociada (HANSEN et al., 2016).
De modo geral, as bebidas fermentadas apresentaram diferenças entre si,
tanto na composição físico-química quanto na microbiológica. O tratamento térmico
ao qual o leite foi submetido influenciou nesta composição, a ponto de propiciar o
favorecimento de uma maior atuação das enzimas e micro-organismos do Kefir, na
bebida desenvolvida em leite pasteurizado. Com isso, a bebida KA apresentou
menor teor de lactose, fruto da maior ação da β-galactosidase na degradação da
lactose em galactose e glicose. Esta última, ao sofrer ação das bactérias, presentes
em maior quantidade em KA, foi convertida em ácido láctico, o que justifica o maior
teor deste e consequente menor valor de pH na bebida KA em detrimento de KB.
Neste contexto, por apresentar maior concentração celular, otimização de
custo para produção em escala industrial e melhores parâmetros químicos,
inclusive menores valores de lactose, a bebida fermentada em leite pasteurizado
(KA) foi selecionada e submetida a liofilização.
3.5 Efeito dos crioprotetores na manutenção dos micro-organismos do Kefir
Na tabela 6 estão apresentadas as concentrações celulares de bactérias em
meio de cultura MRS e M17 e das leveduras em meio de cultura YGC de Kefir de
leite integral pasteurizado, submetido a secagem por liofilização, dos 07 ensaios
gerados pelo Planejamento Fatorial 22.
Os resultados evidenciaram que os ensaios KAL1 e KAL2 apresentaram
melhores respostas, não apresentando diferença significativa (p>0,05) na
concentração celular de bactérias no mesmo meio, porém houve diferença
significativa na contagem de leveduras, com melhor resultado obtido no ensaio
KAL2 com 10% de sacarose. O ensaio KAL3 com 8% de maltodextrina foi o que
apresentou resposta menos satisfatória na viabilidade celular de bactérias e
leveduras. Se compararmos os ensaios KAL1 com KAL3 e KAL2 com KAL4 verifica-
se que o percentual de maltodextrina foi constante e o de sacarose diminuiu
ocasionando uma queda significativa na contagem de bactérias e leveduras.
Tabela 6 – Contagens de bactérias nos meios sólidos MRS e M17 e de leveduras em meio sólido YGC de ensaios de Kefir de leite pasteurizado liofilizado gerados
por um planejamento fatorial 22.
Ensaios Maltodextrina (%)
Sacarose (%)
Bactérias em MRS
(log UFC/g)
Bactérias em M17 (log
UFC/g)
Leveduras em YGC
(log UFC/g)
KAL1 8 10 7,10±0,03Ab 9,20±0,01Aa 5,40±0,08B
KAL2 0 10 7,24±0,13Ab 9,17±0,03Aa 5,79±0,08A
KAL3 8 0 5,08±0,16Db 7,36±0,01Ca 4,69±0,06D
KAL4 0 0 5,83±0,03Cb 7,27±0,14Ca 4,33±0,08E
KAL5 4 5 6,31±0,01Bb 8,25±0,02Ba 5,05±0,03C
KAL6 4 5 6,36±0,13Bb 8,23±0,03Ba 5,07±0,06C
KAL7 4 5 6,33±0,16Bb 8,24±0,01Ba 5,04±0,03C
abc Médias seguidas de letras iguais na horizontal entre as culturas empregadas para bacterias não diferem (p>0,05) pelo teste “t” de Student; ABC Médias seguidas de letras iguais na vertical não diferem significativamente (p>0,05) pelo teste de Duncan; KAL1: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 1; KAL2: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 2; KAL3: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 3; KAL4: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 4; KAL5: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 5; KAL6: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 6; KAL7: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 7.
O teste de significância do modelo de regressão, os coeficientes do modelo
individual e a falta de ajuste foram realizados por ANOVA. Os resultados da ANOVA
e a falta de testes de ajuste são mostrados na Tabela 7. Os resultados mostraram
que os modelos desenvolvidos foram significativos e que não houve falta de ajuste
em nenhuma das equações (p > 0,05). Isso significa que os modelos são
adequados para representar a relação entre respostas e fatores.
95
Tabela 7 – Análise de variancia (ANOVA) para os resultados do planejamento fatorial 22 de Kefir de leite pasteurizado liofilizado.
Fontes de
variação
Grau de Liberdade
(GL)
Contagem de Bactérias em MRS
Contagem Bactérias em M17
Contagem de Leveduras em YGC
SQ MQ p SQ MQ p SQ MQ p
M (L) 1 0,198 0,198 0,003 0,004 0,004 0,027 0,0002 0,0002 0,430
S (L) 1 2,941 2,941 0,0002 3,497 3,497 0,00003 1,1772 1,1772 0,0002
M x S 1 0,093 0,093 0,007 0,001 0,001 0,095 0,1406 0,1406 0,0016
Falta de ajuste
1 0,0007 0,0007 0,392 0,0002 0,0002 0,321 0,000001 0,000001 0,950
Erro Puro 2 0,0013 0,00065 0,0002 0,0001 0,000467 0,000233
Total 6 3,234 3,5024 1,318468 M: Maltodextrina; S: Sacarose; L: Linear; SQ: Soma Quadrática; MQ: Media Quadrática
96
O uso de crioprotetores, é um parâmetro importante no processo de
secagem de micro-organismos para minimizar efeitos negativos como formação de
cristais de gelo no interior das células durante o congelamento e evitar lioinjúrias
irreversíveis (AGUIAR et al., 2012). Os crioprotetores avaliados no presente estudo
foram a maltodextrina (0-8%) e a sacarose (0-10%) isolados ou associados. Os
efeitos lineares da sacarose foram estatisticamente eficazes (p<0,05) na taxa de
sobrevivência celular de bactérias e leveduras, entretanto os efeitos lineares de
maltodextrina apresentaram-se eficazes somente na sobrevivência de bactérias.
Os efeitos lineares da sacarose associada a maltodextrina foram estatisticamente
eficazes para bactérias em MRS e leveduras em YGC, porém não mostrou eficácia
na sobrevivência de bactérias em M17 (Tabela 7).
Os dados do planejamento foram bem ajustados a equação linear proposta,
com coeficiente de determinação (R2) próximo de 1 (Tabela 8). Também é possível
observar que quanto maior o percentual de sacarose, maior a concentração celular
de bactérias e leveduras, enquanto que a associação da maltodextrina a sacarose
não influencia na concentração de bactérias, na mesma forma, o percentual de
maltodextrina isolada não tem representação significativa na concentração de
leveduras.
Tabela 8 – Efeito das variáveis independentes sobre as variáveis dependentes (contagem de bactérias nos meios sólidos MRS e M17 e contagem de leveduras em meio sólido YGC em log UFC/g) de Kefir de leite pasteurizado liofilizado
Bactérias em MRS
(log UFC/g) Bactérias em M17
(log UFC/g) Leveduras em
YGC (log UFC/g)
Média 6,32 8,25 5,05
1 -0,44 0,06 NS
2 1,71 1,87 1,08
1x2 0,30 NS -0,37
R2 0,999 0,999 0,999
1: Maltodextrina (%); 2: Sacarose (%); R2: coeficiente de determinação; NS: não significativo (p>0,05)
3.6 Taxa de sobrevivência de micro-organismos em Kefir liofilizado
3.6.1 Taxa de sobrevivência de bactérias em MRS
A contagem média total de bactérias em meio de cultura sólido MRS na
bebida Kefir in natura foi de 7,41 Log UFC/g (Tabela 4). Após a secagem a taxa de
97
sobrevivência máxima de bactérias em MRS foi de 7,24 Log UFC/g em ensaio
utilizando 10% de sacarose como crioprotetor (Tabela 6), o que representa uma
taxa de sobrevivência celular de 97,71%. As menores taxas evidenciadas nas
contagens em meio MRS foram nos ensaios KAL3 e KAL4 com valores de 68,56%
e 78,68%, respectivamente. A sobrevivência de bactérias em MRS não foi
significativamente (p<0,05) afetadas pelo efeito linear de maltodextrina, sacarose e
sua interação (Tabela 7; Figura 7A). A superfície de resposta indica que embora a
taxa de sobrevivência não tenha sido significativamente afetada pelos dois
crioprotetores, a sacarose exerceu maior influência nas condições testadas.
Em estudo, desenvolvido por Kok-Tas (2015) onde realizou a liofilização de
grãos de Kefir, sem crioprotetores, com temperatura de congelamento de -20ºC, os
resultados da contagem em placa com MRS mostraram valores médios mais
elevados (8,75 Log UFC/g).
3.6.2 Taxa de sobrevivência de bactérias em M17
A contagem média total de bactérias em meio de cultura sólido M17 no Kefir
in natura foi de 9,485 Log UFC/g (Tabela 4). A concentração celular máxima de
bactérias em M17 após a secagem foi observada como 9,20 Log UFC/g (Tabela 6)
em ensaio utilizando a associação de 8% de maltodextrina e 10% de sacarose,
representando 97,00% de sobrevivência celular, semelhante ao ensaio contendo
apenas 10% de sacarose que apresentou taxa de sobrevivência celular de 96,68%.
Enquanto que as menores taxas de sobrevivência celular foram evidenciadas nas
contagens em meio M17 nos ensaios KAL3 e KAL4 com valores de 77,60% e
76,65%, respectivamente. A sobrevivência de bactérias em M17 não foi afetada
estatisticamente (p<0,05) pelo efeito linear de maltodextrina e sacarose
isoladamente, entretanto, a interação linear entre os dois crioprotetores afetou
estatisticamente (p>0,05) a taxa de sobrevivência destas (Tabela 7; Figura 7B). A
superfície de resposta mostra os efeitos da maltodextrina e da sacarose na taxa de
sobrevivência de bactérias em M17, para esta variável dependente a sacarose
também mostrou maior influência na superfície de resposta.
Kok-Tas (2015) ao realizar contagem em placas com meio M17 em amostras
de grãos de Kefir liofilizados que obteve valor de 8,92 Log UFC/g. Em outro estudo,
desenvolvido por Atalar et al. (2015), com Kefir atomizado, foram realizadas
98
contagens celulares em M17 evidenciando valores bem inferiores do encontrado
no presente trabalho, com concentração média de 2,44 Log UFC/g para
Lactococcus spp., cuja confirmação do gênero foi baseada apenas pela contagem
em placa contendo M17, não tendo sido realizado nenhum teste posterior.
3.6.3 Taxa de sobrevivência celular de leveduras em YGC
A contagem média total de leveduras em meio de cultura sólido YGC no Kefir
in natura desenvolvido em leite pasteurizado foi de 6,46 Log UFC/g (Tabela 4).
Concentração celular máxima de leveduras em YGC após a secagem por
liofilização foi de 5,79 Log UFC/g em ensaio utilizando 10% de sacarose (Tabela
6), elucidando uma taxa de sobrevivência celular de levedura de 89,63%. Valores
inferiores foram encontrados por Kok-Tas (2015) em grãos de Kefir liofilizados sem
crioprotetores, 4,35 Log UFC/g para leveduras, semelhante ao ensaio
desenvolvido, neste estudo, também sem crioprotetor (KAL4) que apresentou
concentração de 4,33 Log UFC/g para leveduras. A sobrevivência celular de
leveduras em YGC não sofreu alteração significativa (p>0,05) pelo efeito linear de
sacarose sozinha e associada à maltodextrina, entretanto o efeito linear da
maltodetrina de forma isolada afetou estatisticamente (p<0,05) a taxa de
sobrevivência celular de leveduras em YGC (Tabela 7; Figura 7C). Observa-se na
superfície de resposta que a maior influência na concentração celular de leveduras
ocorreu pela ação da sacarose.
Atalar et al. (2015) ao promoverem secagem de Kefir por spray drying não
observaram sobrevivência de leveduras, demonstrando que a secagem por
atomização exerce efeito negativo na viabilidade destes micro-orgnismos de devido
a sua sensiblidade térmica. O resultado obtido no presente estudo demonstra que
a liofilização é um processo adequado para desidratação de produtos contendo
leveduras, sobretudo ao observar que as menores taxas de sobrevivência de
leveduras foram nos ensaios KAL3 e KAL4 (72,60% e 67,03%, respectivamente),
o que ainda evidencia uma alta representatividade celular.
99
Figura 7 – Superfície de resposta da concentração celular (Log UFC/g): bactérias em MRS (A); bactérias em M17 (B); leveduras em YGC (C) em função do
percentual de maltodextrina e sacarose de Kefir de leite pasteurizado liofilizado.
3.7 Bactérias isoladas de Kefir de leite integral pasteurizado após a secagem por liofilização
A concentração celular de micro-organismos isolados nas bebidas de Kefir
liofilizado está apresentada na tabela 9. Os resultados evidenciam que todos os
gêneros isolados na bebida sobreviveram ao processo de secagem, com exceção
do sugestivo de Lactobacillus spp. 3, provavelmente por ser uma cepa mais
sensível as agressões do congelamento e secagem quando comparada às demais.
100
O gênero Acetobacter spp. foi o que manteve a maior concentração celular, seguido
por sugestivo de Lactobacillus spp. 2, Enterococcus durans, Bifidobacterium spp. e
sugestivo de Lactobacillus spp. 1. As maiores contagens dos isolados, concordando
com os resultados do Kefir úmido, foram encontradas no meio M17, com exceção
do gênero Bifidobacterium spp. nas bebidas KAL1, KAL3, KAL4, KAL5 e KAL6 e do
gênero Enterococcus durans em KAL3, KAL4, KAL5, KAL6 e KAL7.
Os ensaios KAL1 e KAL2 apresentaram melhores respostas, com maiores
concentrações celulares. O ensaio KAL3 apresentou menores concentrações de
bactérias e menor variabilidade de gênero, resultado semelhante ao controle (sem
crioprotetor) KAL4. Os achados de isolados corroboram com os resultados da
contagem total de bactérias (Tabela 6) com atuação mais eficiente da sacarose
como crioprotetor em detrimento da maltodextrina.
101
Tabela 9 – Bactérias isoladas em Kefir de leite pasteurizado liofilizado (KAL)
abc Médias seguidas de letras iguais na horizontal no mesmo meio de cultura não diferem significativamente (p<0,05) pelo teste de Duncan; ABC Médias seguidas de letras iguais na vertical entre os meios de cultura no mesmo microrganismos não diferem entre si (p<0,05) pelo teste t de Student. KAL1: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 1; KAL2: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 2; KAL3: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 3; KAL4: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 4; KAL5: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 5; KAL6: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 6; KAL7: Kefir de leite pasteurizado liofilizado – ensaio 7. *Sugestivo de Lactobacillus spp; **Sugestivo de Bifidobacterium spp.;***Meios de culturas com adição de 0,002% de azul de bromofenol.
Identificação Meios de cultura***
Concentração celular (Log UFC/g) Kefir Liofilizado
KAL1 KAL2 KAL3 KAL4 KAL5 KAL6 KAL7
Enterococcus durans
MRS 5,00±0,00Ad 5,15±0,21Acd 4,58±0,01Ae 4,15±0,21Af 5,50±0,10Aab 5,60±0,01Aa 5,30±0,0Abc M17 4,92±0,03Aa 4,90 ±0,00Aa 0,00±0,00Bd 0,00±0,00Bd 4,50±0,14Bb 4,39±0,13Bbc 4,15±0,21Bc
Bifidobacterium spp**
MRS 5,00±0,00Aa 3,39±0,13Bd 3,39±0,13Ad 4,15±0,21Ab 4,50±0,01Ac 5,00±0,00Aa 4,00±0,00Bb M17 4,15±0,21Bbc 4,15±0,21Abc 0,00±0,00Bd 0,00±0,00Bd 4,00±0,00Bc 4,81±0,05Ba 4,45±0,21Ab
Lactobacillus spp *1
MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Aa 0,00±0,00Aa 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 3,30±0,01Ab 3,00±0,00Ac 0,00±0,00Ad 0,00±0,00Ad 3,48±0,01Aa 3,00±0,00Ac 3,00±0,00Ac
Acetobacter spp MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 7,62±0,03Aa 7,69±0,11Aa 5,81±0,05Ac 7,70±0,03Aa 7,71±0,06Aa 7,70±0,03Aa 7,44±0,05Ab
Lactobacillus spp *2
MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Aa 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 6,00±0,01Aa 6,00±0,01Aa 0,00±0,00Ae 5,78±0,01Ab 4,54±0,02Ac 4,15±0,03Ad 4,15±0,02Ad
Lactobacillus spp *3
MRS 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba M17 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba 0,00±0,00Ba
102
3.7 Otimização
As condições de secagem por liofilização foram otimizadas para determinar
a taxa de sobrevivência de bactérias e leveduras em Kefir em pó. As condições
ótimas do processo foram determinadas pelas respostas com a função de
desejabilidade (maior sobrevivência celular). As melhores condições de secagem
de Kefir foram encontradas com o ensaio crioprotegido por sacarose a 10% (KAL2).
A maltodextrina como crioprotetor não mostrou efeito significativo sobre a taxa de
sobrevivência celular de micro-organismos em Kefir de leite liofilizado. As
concentrações celulares de bactérias em MRS, bactérias em M17 e leveduras em
YGC, expressos em Log UFC/g, na melhor condição obtida neste estudo foram
7,24, 9,17 e 5,79, respectivamente (Tabela 6). Atalar et al. (2015) em estudo com
grãos de Kefir liofilizados sem uso de crioprotetor e obtiveram taxas de
sobrevivência celular para Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc e Leveduras
de 2,40, 2,99, 2,56 e 2,54 Log UFC/g, respectivamente, sendo inferiores aos
encontrados no presente trabalho.
3.8 Composição físico-química de Kefir de leite pasteurizado liofilizado nas
condições de processamento da melhor resposta do planejamento fatorial
Os resultados da avaliação físico-química do Kefir de leite pasteurizado
liofilizado utilizando como crioprotetor 10% de sacarose estão apresentados na
tabela 10.
Um dos principais parâmetros analisados em alimentos secos é a atividade
de água e umidade que deve estar abaixo de 0,6 e inferior a 25%, respectivamente
(DE BRUIJN et al., 2016, STEVENSON et al., 2015). Portanto os valores obtidos
para Aw (0,291) e umidade (4,25%) permitem que o Kefir de leite liofilizado seja
classificado como um produto desidratado. Baixos valores de atividade de água são
importantes na preservação de alimentos, pois significa que o produto dispõe de
pouca água livre para a ocorrência de reações químicas e biológicas indesejáveis
(OLIVEIRA; BRANDÃO; SILVA, 2016).
103
Tabela 10 – Parâmetros físicos e químicos de Kefir de leite pasteurizado submetido a secagem por liofilização crioprotegido por sacarose a 10% (KAL2).
ANÁLISES RESULTADOS
Aw 0,291 ±0,006
pH 3,467 ±,006
Acidez (g.100g-1 de Ác. Láctico) 5,439±0,184
Lactose (g.100g-1) 12,193 ±0,095
Proteína (g.100g-1) 13,97 ±0,16
Lipídeo (g.100g-1) 10,10 ±0,02
Carboidrato (g.100g-1) 68,61±0,21
Umidade (%) 4,25 ±0,20
Cinzas (g.100g-1) 3,06 ±0,05
Cor
L* 89,76 ±0,18
a* -2,41 ±0,03
b* 12,27 ±0,05
ΔE* 4,18
O pH, de 3,46, se manteve próximo ao observado na amostra úmida, de 3,68
(Tabela 1). Os valores de cor também se mantiveram próximos aos da bebida antes
da liofilização (Tabela 1) com elevado valor de L* (89,76), cromaticidade a* negativa
(-2,41) e cromaticidade b* positiva (12,27). Estudos sobre os limites da diferença
de cor (ΔE*) ainda são escassos, os valores de tolerância devem ser definidos para
cada produto, no entanto, o valor obtido de 4,18 para o kefir liofilizado não indicou
diferença de cor perceptível a visão humana no produto analisado. Os demais
parâmetros analisados (acidez, lactose, proteína, lipídeos, carboidratos e cinzas)
apresentaram valores mais elevados do que a bebida in natura, sendo esperados
devido a retirada de água e consequente concentração dos constituintes do produto
durante a secagem, elucidando o potencial efeito de manutenção da qualidade de
alimentos submetidos a liofilização.
4 CONCLUSÃO
O leite pasteurizado apresenta ambiente favorável para a fermentação de
grãos de Kefir, evidenciado pela maior concentração celular obtida em KA.
104
O isolamento e identificação de Bifidobacterium spp. nas duas bebidas
desenvolvidas configura um achado importante, não só por todas as propriedades
deste gênero, que é um dos mais empregados como probióticos, mas pelo fato de
se encontrar poucas evidências de isolamento de Bifidobacterium em Kefir quando
todos se remetem ao isolamento em grãos.
A maltodextrina como crioprotetor no processo de liofilização do Kefir de leite
pasteurizado não apresenta eficácia na crioproteção dos micro-organismos nas
condições de ensaios avaliados.
A sacarose, na concentração de 10%, apresenta eficácia na crioproteção
dos micro-organismos do Kefir, propiciando um produto desidratado com boa
qualidade nutricional e viabilidade celular satisfatória com potencial efeito
probiótico.
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111
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Estudos acerca do desenvolvimento de Kefir em pó ainda são escassos na
literatura, sobretudo na utilização do processo de secagem por liofilização, o que
torna necessário que novos estudos sejam realizados com mais análises das
propriedades microbiológicas e físico-químicas do Kefir em pó, além da
determinação da vida de prateleira do produto.
112
APÊNDICE A Características das bactérias isoladas de bebidas fermentadas por grãos de Kefir de leite e de Kefir liofilizado por semeio em
superfície em meios de culturas modificados
Micro-organismo
Isolado Meio de Cultura
Modificado***
Característica macroscópica da
colônia Forma Gram Catalase Oxidase Esporo
Lactobacillus spp.* 1
1 MRS Redonda, pequena,
brilhante, ponto central branco, borda translúcida
Bacilo Longo + - - Não
esporulado
1 M17 Redonda, pequena,
brilhante, ponto central branco, borda translúcida
Bacilo Longo + - - Não
esporulado
Lactobacillus spp.* 2
2 M17 Redonda, média,
brilhante, ponto central azul, borda branca
Cocobacilo + - - Não
esporulado
Lactobacillus spp.* 3
3 M17 Redonda, média,
brilhante, azul escura Bacilo Curto + - -
Não esporulado
Enterococcus durans
4 MRS Redonda, pequena,
brilhante, branca Cocos em
cadeia + - NR
Não esporulado
4 M17 Redonda, pequena,
brilhante, azul escura, borda fina transparente
Cocos em cadeia
+ - NR Não
esporulado
Bifidobacterium spp.**
5 MRS Redonda, pequena,
brilhante, azul escura
Bacilo em forma de
bastonetes bifurcado
+ - NR Não
esporulado
5 M17 Redonda, pequena,
brilhante, azul escura
Bacilo em forma de
bastonetes bifurcado
+ - NR Não
esporulado
Acetobacter spp.
6 M17 Redonda, pequena,
brilhante, branca Pleomórfica Variável + NR
Não esporulado
NR: Não recomendado; *Sugestivo de Lactobacillus spp; **Sugestivo de Bifidobacterium spp.;***Meios de culturas com adição de 0,002% de azul de bromofenol
113
APÊNDICE B
A: aspecto macroscópico do semeio em superfície em meio de cultura MRS modificado e B: aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de Lactobacillus spp. 1
114
APÊNDICE C
A: aspecto macroscópico do semeio em superfície em meio de cultura M17 modificado e B: aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de Lactobacillus spp. 2
115
APÊNDICE D
A: apecto macroscópico: semeio em superfície em meio de cultura M17 modificado (A) e B: aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de Lactobacillus
spp. 3
116
APÊNDICE E
Aspecto macroscópico: A) semeio em superfície em meios de culturas MRS, B) M17 modificados, C) aspecto microscópico (1000X) - Enterococcus durans
117
APÊNDICE F
Aspecto macroscópico: semeio em superfície em meio de cultura M17 modificado (A) e aspecto microscópico (1000X) - Acetobacter spp. (B)
118
APÊNDICE G
Aspecto macroscópico: A) semeio em superfície em meios de culturas MRS, B) M17 modificados e C) aspecto microscópico (1000X) - Sugestivo de
Bifidobacterium spp. 2
119
APÊNDICE H
A: aspecto macroscópico do semeio em superfície em meio de cultura YGC e B: aspecto microscópico (1000X) - Candida krusei (B)
120
ANEXO A
Composição dos meios sólidos MRS (Merck®) e M17 (Sigma®)
MRS M17
Nutrientes g/L Nutrientes g/L
Hidrogenofosfato dipotássico 2,0 β-glicerofosfato dissódico
pentahidratado 19,0
Extrato de carne 10,0 Extrato de carne 5,0
Extrato de levedura 4,0 Extrato de levedura 2,5
Digestão enzimática de
caseína 10,0 Peptona de caseína 2,5
Tween 80 1,08 Peptona de carne 2,5
Citrato de hidrogênio Di-
Amônia 2,0
Peptona de soja 5,0
Acetato de sódio 5,0
Sulfato de Magnésio
Heptahidratado 0,2
Sulfato de magnésio
hidratado 0,25
Sulfato de manganês
Monohidratado 0,04 Ácido ascórbico 0,5
Ágar 14,0 Ágar 12,75
D (+) – Glicose 20,0
Solução de Lactose
adicionada de forma
asséptica
10%
pH a 25ºC 5,6-5,9 pH a 25ºC 7,1 ± 0,2