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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR-
MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS
DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS
E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM
AMOSTRAS CLÍNICAS
LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Belo Horizonte – MG
2006
LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO
DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR-
MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS
DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS
E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM
AMOSTRAS CLÍNICAS
Orientação: Dr. Vasco Azevedo
Co-orientação: Dr. Anderson Miyoshi
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Belo Horizonte, 2006
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre pelo programa
de Pós-Graduação em Genética, Departamento de
Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais.
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética Celular e Molecular e
realizado com apoio financeiro das seguintes instituições:
� Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
� Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
� Financiadora de Estudos e Projetos – MCT (FINEP)
A organização desta dissertação foi baseada em: FRANÇA, J.L.; BORGES,
S.M.; VASCONCELLOS, A.C.; MAGALHÃES, M.H.A. Manual para normalização
de publicações técnico-científicas. 7ª ed. Belo Horizonte: Ed. UFMG, 2004. 242p.
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação ao meu pai Hilton, minha mãe Marilane, e meus irmãos
Pablo e Carol. Dedico também a todos os meu amigos que estiveram ao meu lado
durante a realização do mestrado.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Minas Gerais, por todas as oportunidades que
me proporcionou nos últimos anos.
À Pós-Graduação em Genética, por todos os ensinamentos fundamentais
para o meu desenvolvimento profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pela ajuda indispensável.
Aos meus orientadores Dr. Vasco Azevedo e Dr. Anderson Miyoshi, pela
confiança depositada e pelo apoio.
Aos grupos de pesquisa dos doutores Sérgio Costa (UFMG), Roberto
Meyer (UFBA), e Francisco Selmo Alves (EMBRAPA), pela disponibilidade de
material e cooperação científica.
Aos estudantes Roberta Pena e Thiago Castro, pelo companheirismo e
empenho no desenvolvimento deste trabalho.
A todos os amigos do Laboratório de Genética Celular e Molecular:
Anderson Miyoshi
Bruna Savassi
Clarissa Rocha
Estela Mares
Fernanda Dorella
Guilherme Augusto
Kátia Leite
Keila Coelho
Naira Electo
Paula Gonçalves
Ricardo Rabelo
Roberta Pena
Thiago Castro
Vasco Azevedo
“Ando devagar porque já tive pressa
e levo esse sorriso, porque já chorei demais
Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe
eu só levo a certeza de que muito pouco eu sei, eu nada sei...”
(Almir Sater e Renato Teixeira – Tocando em Frente)
Gastei uma hora pensando um verso
que a pena não quer escrever.
No entanto ele está cá dentro
inquieto, vivo.
Ele está cá dentro
e não quer sair.
Mas a poesia deste momento
inunda minha vida inteira.
(Carlos Drummond de Andrade – Poesia)
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................IV
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................VI
LISTA DE TABELAS.............................................................................................VII
RESUMO...............................................................................................................VIII
ABSTRACT.............................................................................................................IX
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................1
1.1. Introdução Geral..........................................................................................................2
1.2. Estrutura da Dissertação............................................................................................5
1.3. Revisão da Literatura..................................................................................................6
2. OBJETIVOS.......................................................................................................25
2.1. Objetivo Geral............................................................................................................26
2.2. Objetivos Específicos...............................................................................................26
3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................27
3.1. Equipamentos Utilizados..........................................................................................28
3.2. Reagentes, Meios de Cultura e Soluções................................................................29
3.2.1. Reagentes Utilizados................................................................................................29
3.2.2. Meios de Cultura.......................................................................................................31
3.3. Material Biológico......................................................................................................33
3.3.1. Linhagens Bacterianas e Condições de Cultivo.......................................................33
3.3.2. Amostras Clínicas.....................................................................................................35
3.3.2.1. Amostras de Material Purulento.............................................................................35
3.3.2.2. Amostras de Sangue e Soro..................................................................................35
3.4. Métodos......................................................................................................................37
3.4.1. Isolamento Bacteriano e Identificação Bioquímica dos
Isolados...............................................................................................................................37
3.4.2. Extração de DNA Genômico Bacteriano...................................................................38
3.4.2.1. Extração de DNA Genômico de Culturas Bacterianas..........................................38
3.4.2.2. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras Clínicas de Linfadenite
Caseosa...........................................................................................................39
3.4.2.2.1. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Pus e Sangue com
os Protocolos CTAB-SDS e PK-
ROCHE...............................................................................................................................39
3.4.2.2.2. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Pus e Sangue
com o Protocolo PK-SARCOSIL.........................................................................................40
3.4.2.2.3. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Pus e Sangue
com o Kit Wizard® Genomic DNA Purification
(Promega)...........................................................................................................................41
3.4.2.2.4. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Soro com o Kit
ChargeSwitch gDNA 1 ml Serum
(Invitrogen)..........................................................................................................................41
3.4.3. Dosagem do DNA Genômico Extraído.....................................................................42
3.4.4. Ensaio de PCR-Multiplex..........................................................................................43
3.4.4.1. Teste de Sensibilidade Analítica............................................................................46
3.4.4.2. Teste de Especificidade.........................................................................................46
3.4.4.3. Teste de Reprodutibilidade....................................................................................46
3.4.4.4. Confirmação dos Produtos Amplificados...............................................................47
3.4.4.5. Limite de Detecção em Amostras Clínicas............................................................47
3.4.4.6. Cálculo da Sensibilidade Diagnóstica....................................................................48
3.4.5. Análise Estatística.....................................................................................................48
3.4.6. Determinação da Equivalência Genômica de C.
pseudotuberculosis.............................................................................................................48
3.4.7. Digestão Enzimática dos Produtos da mPCR..........................................................49
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO……..................................................................50
4.1. ARTIGO: Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium
pseudotuberculosis from Pure Cultures and for Rapid Detection of this Pathogen in
Clinical Samples...............................................................................................................51
4.2. Resultados Adicionais..............................................................................................78
4.2.1. Sensibilidade Analítica do Ensaio de mPCR com Diferentes DNA
Polimerases........................................................................................................................78
4.2.2. Equivalência Genômica do Limite de Detecção da mPCR.......................................81
4.2.3. Especificidade do Ensaio de mPCR.........................................................................82
4.2.4. Reprodutibilidade do Ensaio de mPCR....................................................................83
4.2.5. Extração de DNA Genômico de C. pseudotuberculosis a Partir de Amostras Clínicas
de Linfadenite Caseosa......................................................................................................82
4.2.6. Limite de Detecção da mPCR em amostras clínicas................................................85
4.2.7. Detecção de C. pseudotuberculosis em Amostras de
Soro....................................................................................................................................87
4.2.8. Perfil Eletroforético das Digestões Enzimáticas dos Produtos da
mPCR.................................................................................................................................90
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................97
5.1. Conclusões.................................................................................................................98
5.2. Perspectivas...............................................................................................................99
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................100
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
INSTITUIÇÕES
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FAPEMIG Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
ICB Instituto de Ciências Biológicas
UFBA Universidade Federal da Bahia
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
TERMOS TÉCNICOS
AgNO3 Nitrato de Prata
BHI Brain Heart Infusion – Infusão Cérebro Coração
CIP Coleção Instituto Pasteur
cols. Colaboradores
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfato
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
fg Fentograma
g Grama
HCl Ácido Clorídrico
µg Micrograma
µl Microlitro
µM Micromolar
mg Miligrama
MgCl2 Cloreto de Magnésio
min Minutos
ml Mililitro
mM Milimolar
MW Molecular Weight
NaAc Acetato de Sódio
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
ng Nanograma
O.N. Overnight – durante a noite
PCR Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da Polimerase
PEG Polietileno glicol
PM Peso molecular
q.s.p. Quantidade suficiente para
RNase A Ribonuclease A
rpm Revoluções por minuto
Sarcosil Sódio-N-lauroilsarcosina
SDS Sódio Dodecil Sulfato
seg Segundos
Taq Thermus aquaticus
tº Temperatura
U Unidades
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Protocolo passo-a-passo para o desenvolvimento de PCR-multiplex....44
Figura 2. Testes de sensibilidade do ensaio de mPCR.........................................78
Figura 3. Teste de sensibilidade com o sistema Taq DNA Polimerase
Recombinante (Invitrogen), resolvido em gel de poliacrilamida a 6% corado pela
prata........................................................................................................................79
Figura 4. Amplificação do gene 16S rRNA de C. pseudotuberculosis utilizando o
sistema AccuPrime™ (Invitrogen)..........................................................................80
Figura 5. Especificidade da reação de mPCR.......................................................83
Figura 6. Perfis de amplificação de 38 isolados de C.
pseudotuberculosis.................................................................................................84
Figura 7. Limite de detecção da mPCR em amostras clínicas utilizando dois
sistemas de amplificação diferentes.......................................................................87
Figura 8. Reações de PCR para amplificação do 16S rDNA de C.
pseudotuberculosis e do controle positivo de amplificação 12S rDNA, em 8
amostras de soro de animais portadores de linfadenite
caseosa...................................................................................................................89
Figura 9. Amplificação do gene pld a partir de amostras de
soro.........................................................................................................................89
Figura 10. Digestão enzimática das reações de mPCR com DNAs de C. ulcerans
e C. pseudotuberculosis.........................................................................................91
Figura 11. Mapa de restrição da região amplificada do gene 16S rRNA da C.
pseudotuberculosis.................................................................................................94
Figura 12. Mapa de restrição da região amplificada do gene rpoB da C.
pseudotuberculosis.................................................................................................95
Figura 13. Mapa de restrição da região amplificada do gene pld da C.
pseudotuberculosis.................................................................................................96
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Linhagens bacterianas utilizadas neste estudo......................................34
Tabela 2. Amostras de material purulento utilizadas neste estudo........................36
Tabela 3. Iniciadores utilizados neste estudo.........................................................43
Tabela 4. Reações de mPCR com diferentes polimerases....................................45
RESUMO
Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite
caseosa (LC), uma doença crônica contagiosa que acomete os pequenos
ruminantes e acarreta sérias perdas econômicas para as atividades de ovino e
caprinocultura. Embora o controle desta doença seja baseado primariamente em
detecção e isolamento de animais infectados, ainda não há um método de
diagnóstico completamente satisfatório. Com o objetivo de facilitar a detecção de
C. pseudotuberculosis, no presente trabalho foi desenvolvido um ensaio de PCR-
multiplex (mPCR) que amplifica simultaneamente três genes específicos dessa
bactéria: 16S rDNA (RNA ribossômico 16S), rpoB (subunidade beta da RNA
polimerase), e pld (exotoxina fosfolipase D). Esse novo método permitiu identificar
de forma eficiente 40 isolados de campo de C. pseudotuberculosis; confirmados
através de testes bioquímicos. O ensaio mostrou-se altamente específico, e foi
suficientemente sensível para detectar 1 pg de DNA genômico de C.
pseudotuberculosis. Quando testado com DNA extraído de amostras clínicas de
LC, o limite de detecção foi de 103 UFC desta bactéria. Foi possível detectar C.
pseudotuberculosis diretamente em amostras de pus (n = 56) de ovinos e caprinos
infectados, com alta sensibilidade diagnóstica (94,6%). A possibilidade de detectar
esta bactéria em amostras de soro gerou a perspectiva de identificação de animais
portadores de infecções sub-clínicas. O ensaio de mPCR desenvolvido contribui
significativamente para a detecção rápida de C. pseudotuberculosis e pode ser
usado como alternativa para o diagnóstico da LC.
ABSTRACT
Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous
lymphadenitis (CLA), a debilitating disease of sheep and goats. Accurate diagnosis
of CLA primarily relies upon microbiological examination, followed by biochemical
identification of isolates. In an effort to facilitate C. pseudotuberculosis detection,
we developed a multiplex-PCR (mPCR) assay targeting three genes of this
bacterium: 16S rDNA, rpoB and pld. This method allowed efficient identification of
40 isolates of this bacterium, which had been previously identified by biochemical
testing. Analysis of taxonomically-related species did not generate the C.
pseudotuberculosis mPCR amplification profile, thereby demonstrating the assay’s
specificity. As little as 1 pg of C. pseudotuberculosis genomic DNA was detected
by this mPCR assay, demonstrating the sensitivity of the method. The detection
limit in clinical samples was estimated to be 103 colony-forming units (CFU). We
were able to detect C. pseudotuberculosis directly in pus samples of infected
sheep and goats (n = 56) with a high diagnostic sensitivity (94.6%). The developed
assay significantly improves rapid C. pseudotuberculosis detection and could
supersede bacteriological culture for microbiological and epidemiological diagnosis
of CLA.
1. INTRODUÇÃO
1.1. INTRODUÇÃO GERAL
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva,
parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC) – mal do
caroço – em pequenos ruminantes (Dorella e cols., 2006). Essa doença crônica
contagiosa apresenta-se em duas formas principais: uma forma externa,
caracterizada pelo desenvolvimento de abscessos encapsulados em linfonodos
superficiais de ovinos e caprinos; e uma forma interna, em que os abscessos
aparecem nos linfonodos viscerais ou em órgãos como pulmão, fígado, rins, útero
e baço. As duas formas podem se desenvolver concomitantemente (Kuria e cols.,
2001; Williamson, 2001).
A LC é distribuída mundialmente e é altamente prevalente em países onde
a ovinocaprinocultura é intensa, tais como Austrália, Nova Zelândia, África do Sul,
Estados Unidos, Canadá e Brasil (Williamson, 2001; Arsenault e cols., 2003; Paton
e cols., 2003; Dorella e cols., 2006). No Brasil, os Estados da Região Nordeste
são os mais afetados, em razão de possuírem a maior concentração de rebanhos
ovinos e caprinos do país (Alves & Pinheiro, 1997; Ribeiro e cols., 2001). Minas
Gerais, apesar de ainda possuir um rebanho reduzido, tem apresentado
crescimento na atividade de ovinocultura, e a LC já tem sido observada com alta
freqüência principalmente nos criatórios da região Norte do Estado (Faria e cols.,
2004).
As perdas econômicas acarretadas pela LC são evidenciadas em maior
parte através da diminuição na produção de leite, carne e lã, da desvalorização da
pele devido às cicatrizes, e do custo das drogas e da mão-de-obra para tratar os
abscessos superficiais dos animais (Alves & Pinheiro, 1997). Perdas ainda mais
importantes podem acontecer no abate, quando parte ou até mesmo carcaças
inteiras podem ser condenadas (Arsenault e cols., 2003; Paule, 2003).
O uso de antibióticos para controlar a doença não representa uma
estratégia viável, uma vez que as drogas não penetram na cápsula dos abscessos
(Alves & Pinheiro, 1997; Piontikowski & Shivvers, 1998; Williamson, 2001).
Portanto, o controle da LC deve ser realizado primariamente por medidas
profiláticas. Considerando que a eficiência das vacinas existentes ainda não é
bem definida (Piontikowski & Shivvers, 1998; Paton e cols., 2003; Dorella e cols.,
2006), a identificação dos animais infectados e a privação destes animais do
convívio com os saudáveis permanecem como as principais medidas de manejo
para o controle desta enfermidade (Williamson, 2001; Dorella e cols., 2006).
Alguns autores sugerem uma estratégia ainda mais agressiva, envolvendo o abate
de qualquer animal portador da infecção (Baird, 1997). No entanto, a inexistência
de um método de diagnóstico completamente satisfatório para LC representa um
impedimento ao manejo eficaz (Dercksen e cols., 2000; Menzies e cols., 2004;
Dorella e cols., 2006).
Devido aos resultados divergentes obtidos com testes sorológicos
desenvolvidos até então (Dercksen e cols., 2000; Williamson, 2001; Menzies e
cols., 2004; Dorella e cols., 2006), e em razão da necessidade de diferenciar C.
pseudotuberculosis de um outro agente patogênico envolvido com a
sintomatologia de LC, tais como Arcanobacterium pyogenes e Pasteurella
multocida, o isolamento desta bactéria diretamente do material purulento de
linfonodos permanece como um dos procedimentos mais fidedignos de
diagnóstico (Alves & Pinheiro, 1997; Ribeiro e cols., 2001; Williamson, 2001). Além
disso, quando um teste sorológico é aplicado em estudos de prevalência de LC ou
até mesmo em um programa de erradicação dessa doença num rebanho, é
necessária a disponibilidade de um teste confirmatório altamente sensível e
específico (Dercksen e cols., 2000; Williamson, 2001); tal papel ainda é
desempenhado pela cultura bacteriológica seguida por identificação bioquímica de
isolados. O desenvolvimento de um método rápido e específico para detectar C.
pseudotuberculosis pode ser de grande valor no diagnóstico da LC.
Çetinkaya e cols. (2002) propuseram um teste baseado na reação em
cadeia da polimerase (PCR) para identificar isolados de C. pseudotuberculosis
através da amplificação parcial da seqüência do gene do RNA ribossômico 16S
(16S rDNA). No entanto, o teste apresentou limitações, incluindo a inabilidade de
distinguir a bactéria C. ulcerans e a dependência de cultivo bacteriano prévio.
Neste contexto, a proposta do presente trabalho foi desenvolver um ensaio
de PCR-multiplex (mPCR) para amplificar simultaneamente três genes específicos
da C. pseudotuberculosis, quais sejam: 16S rDNA (RNA ribossômico 16S), rpoB
(subunidade beta da RNA polimerase), e pld (exotoxina fosfolipase D). A
amplificação de múltiplos loci numa mesma reação de PCR é uma estratégia
amplamente utilizada para detecção de patógenos, por apresentar uma série de
vantagens, incluindo a identificação altamente específica do microrganismo de
interesse com grande economia de tempo e de reagentes (Edwards & Gibbs,
1995; Halbert e cols., 2005; O’Halloran & Cafferkey, 2005; Persson & Olsen,
2005).
1.2. ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
O presente trabalho tem início com um artigo de revisão da literatura sobre
C. pseudotuberculosis, do qual participei ativamente da redação, em vias de ser
publicado no periódico científico francês Veterinary Research. Neste artigo são
abordadas as principais questões concernentes à microbiologia e virulência da C.
pseudotuberculosis, bem como os pontos mais importantes relativos ao seu
processo infeccioso em pequenos ruminantes.
Em seguida, são apresentados os objetivos gerais e específicos do
trabalho, os quais se relacionam com o desenvolvimento de um teste molecular
para identificação específica de isolados de C. pseudotuberculosis, além da rápida
detecção desta bactéria em amostras clínicas de animais portadores de LC.
Uma seção detalhada sobre os materiais e métodos utilizados durante o
trabalho foi incluída, para que outros laboratórios possam se beneficiar com estas
metodologias e implementá-las rapidamente.
Os resultados e discussões são apresentados sob a forma de um
manuscrito que será posteriormente submetido para publicação em forma de
artigo em um periódico científico internacional de referência na área de
diagnóstico molecular microbiológico. Ainda nesta seção, são apresentados
resultados adicionais que suportam os dados apresentados no manuscrito do
artigo além de abrirem a possibilidade de confecção de um segundo artigo.
Finalmente, são apresentadas as considerações finais e perspectivas do
trabalho.
1.3. REVISÃO DA LITERATURA
ARTIGO DE REVISÃO:
Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties,
pathogenesis and molecular studies of virulence.
Fernanda Alves DORELLA, Luis Gustavo Carvalho PACHECO, Sérgio Costa
OLIVEIRA, Anderson MIYOSHI, Vasco AZEVEDO.
Vet. Res., no prelo.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Desenvolver um ensaio de PCR-multiplex (mPCR) para amplificar
simultaneamente três genes específicos de Corynebacterium pseudotuberculosis,
e avaliar sua utilidade para a identificação de isolados bacterianos bem como para
a detecção rápida desse patógeno em amostras clínicas de animais suspeitos de
serem portadores de linfadenite caseosa.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
� Padronizar uma reação de PCR para amplificação eficiente e simultânea
dos genes 16S rRNA, rpoB e pld de C. pseudotuberculosis.
� Desenhar iniciadores para amplificação específica do gene pld de C.
pseudotuberculosis, permitindo diferenciação de C. ulcerans.
� Testar a especificidade do ensaio de mPCR, utilizando DNAs genômicos de
bactérias taxonomicamente próximas a C. pseudotuberculosis.
� Avaliar a reprodutibilidade do ensaio desenvolvido, utilizando DNA
genômico de bactérias isoladas em campo.
� Padronizar um protocolo de extração de DNA genômico bacteriano
diretamente de amostras de pus, sangue e soro de animais portadores de
linfadenite caseosa.
� Avaliar a sensibilidade do ensaio de mPCR para detectar C.
pseudotuberculosis em amostras clínicas provenientes de animais
sabidamente infectados.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
� Agitador magnético de soluções (TradeLab)
� Aparato para eletroforese Horizon® 58 (Gibco BRL)
� Balança eletrônica (Marte)
� Banho-maria (Precision)
� Capela química (Permution)
� Centrífuga 5417C (Eppendorf)
� Centrífuga refrigerada MR 23i (Jouan)
� Equipamento de fotodocumentação (Kodak)
� Espectrofotômetro (Bio-Rad)
� Estufa incubadora (Nova Ética)
� Fluxo laminar (Veco)
� Forno Microondas (CCE)
� Freezer -20ºC (Electrolux)
� Freezer -80ºC (Sanyo)
� Micropipetas Pipetman® (Gilson)
� pHMETRO (Digimed)
� Seqüenciador automático MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences)
� Shaker incubador (Nova Ética)
� Termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc.)
� Transiluminador (BioSystematica)
� Vortex (IKA)
3.2. REAGENTES, MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES
3.2.1. REAGENTES UTILIZADOS
� 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)
� AccuPrime Taq DNA Polymerase System (Invitrogen)
� Ácido Bórico (Cirq)
� Acrilamida (Promega)
� Ágar bacteriológico (bioBRÁS)
� Agarose (Eurobio)
� AgNO3 (Synth)
� Água mili-Q autoclavada
� Álcool Isoamílico (Synth)
� Azul de Bromofenol (Synth)
� Bgl I (Stratagene)
� Brain Heart Infusion (Oxoid)
� Brometo de Etídio (Eurobio)
� ChargeSwitch gDNA 1 ml Serum Kit (Invitrogen)
� Cla I (Promega)
� Clorofórmio (Cirq)
� CTAB
� DYEnamic ET Dye Terminator Kit (Amersham Biosciences)
� EDTA (Synth)
� Eppendorf® MasterMix 2.5X (Eppendorf)
� Etanol (Synth)
� Formaldeído (Merck)
� GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas)
� Glicogênio (Gibco)
� HCl (Merck)
� Lysozyma (USB)
� NaAc (Synth)
� NaCl (Cirq)
� NaOH (Cin. Química)
� NN Metil-bisacrilamida (Promega)
� Persulfato de amônio (Gibco)
� Polietileno glicol (PEG) 8000
� Proteinase K (Invitrogen)
� RNase A (Invitrogen)
� SDS (Synth)
� Sódio-N-lauroilsarcosina (Powder)
� Taq DNA Polymerase, Recombinant (Invitrogen)
� Tris-base (Invitrogen)
� Tween-80
� UltraPure™ Buffer-Saturated Phenol (Invitrogen)
� Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)
3.2.2. MEIOS DE CULTURA
Caldo “Infusão Cérebro-Coração” (Brain Heart Infusion) e placas BHI ágar:
37 g de BHI em pó (Oxoid, Hampshire, Inglaterra) são adicionados a 1 litro de
água destilada; após homogeneizar, o pH da mistura é acertado para 7,4 e o meio
é então autoclavado por 20 minutos a 120ºC. Este meio é acrescido de ágar
bacteriológico na concentração final de 1,5% para cultura em meio sólido. Para o
preparo de placas BHI ágar-sangue, adiciona-se sangue de carneiro na
concentração final de 5%.
3.2.3. SOLUÇÕES
Acrilamida 29:1 (1 litro): Misturar: 290 g de acrilamida; 10 g de NN Metil-
bisacrilamida; completar com água destilada para 1.000 ml.
Brometo de Etídio: Estocar a 5 mg/ml. Utilizar a 0,1-0,5 µg/ml. Conservar ao
abrigo da luz.
CTAB-NaCl: Misturar: 40 ml de solução de CTAB (10%) e 50 ml de solução de
NaCl (5M).
Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico: Misturar em um recipiente de vidro
escuro: 25 ml de solução saturada de fenol; 24 ml de clorofórmio; e 1 ml de álcool
isoamílico.
Glicogênio (20 mg/ml): Adicionar 100 mg de glicogênio a 5 ml de água destilada.
Filtrar a mistura em filtro de 0,45 µµµµm.
Persulfato de amônio (10%): Diluir 10 g de persulfato de amônio em 100 ml de água
destilada. Aliquotar em microtubos de 1,5 ml.
Polietileno glicol (PEG) 8000 (15%): Misturar: 3,75 g de PEG 8000; 3,65 g de NaCl;
completar com água destilada para 25 ml (agitar em banho-maria).
Sarcosil (30%): Diluir 30 g de sódio-N-lauroilsarcosina em 100 ml de água destilada.
Estocar a 4ºC.
Solução de coloração: Misturar: 0,15 g de AgNO3; 50 ml de solução fixadora;
completar com 100 ml de água destilada.
Solução fixadora: Misturar: 100 ml de etanol absoluto; 5 ml de ácido acético;
completar com água destilada para 1.000 ml (homogeneizar por inversão).
Solução reveladora: Misturar: 15 g de NaOH; 3 ml de formaldeído; completar
com água destilada para 1.000 ml (homogeneizar em agitador).
Tampão de Amostra (5X): Glicerol a 50%; Azul de bromofenol a 0,20%; e solvente
TBE a 2,5X. Estocar a 4ºC.
TBE 5X (4 litros): Misturar: 216 g deTris-base; 110 g de ácido bórico; 80 ml de
EDTA (0,5 M; pH 8,0); completar com água destilada para 4.000 ml; homogeneizar
e medir o pH (entre 8,0 e 8,5).
Tris-EDTA-lisozima (Solução II – Extração de DNA genômico): Misturar: 1 ml
de Tris-HCl (1M; pH 7,0); 2 ml de EDTA (0,5M; pH 8,0); 6 ml de NaCl (5M); e 1 g
de lysozyma; completar com água destilada para 100 ml. [Concentrações finais:
Tris-HCl (10mM); EDTA (10mM); NaCl (300mM); lisozima (10 mg/ml)].
Tris-EDTA-RNAse (Solução I – Extração de DNA genômico): Misturar: 1 ml de
Tris-HCl (1M; pH 7,0); 2 ml de EDTA (0,5M; pH 8,0); 6 ml de NaCl (5M); e RNase
A; completar com água destilada para 100 ml. [Concentrações finais: Tris-HCl
(10mM); EDTA (10mM); NaCl (300mM); RNase A (50 µg/ml)].
3.3. MATERIAL BIOLÓGICO
3.3.1. LINHAGENS BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTIVO
As linhagens bacterianas utilizadas neste estudo estão listadas na tabela 1.
As bactérias foram cultivadas em caldo “infusão cérebro-coração”, em aerobiose, a
37ºC por 48-72 horas, ou mantidas em placas BHI ágar. Para as linhagens de C. bovis,
Tween-80 foi adicionado ao meio de cultura, na concentração final de 1%.
Tabela 1. Linhagens bacterianas utilizadas neste estudo.
Designação da linhagem Características / Fonte
Arcanobacterium haemolyticum SL2212 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes A93 00085 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes HJ26 BA224.11 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes-like HJ51 B Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
A. pyogenes-like HJ51 Da Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
Corynebacterium amycolatum HJ08
I4218 LV
Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. bovis DL BOV23 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. bovis DL BOV25 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. pseudotuberculosis biovar equi
CIP 5297
Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. pseudotuberculosis biovar ovis
(VD21; VD23; VD27; VD28; VD33; VD36;
VD37; VD38; VD41; VD42; VD43; VD44;
Bactérias isoladas a partir de
animais criados extensivamente e
identificadas como C.
VD45; VD46; VD48; VD50; VD52; VD53;
VD54; VD55; VD56; VD57; VD58; VD59;
VD60; VD61; VD62; VD63; VD99; 01; 05;
08; 09; 11; 12; 21; 217)
pseudotuberculosis biovar ovis
através de testes bioquímicos por
técnicos da UFBA.
C. pseudotuberculosis biovar ovis
T1
Instituto de Ciências da Saúde,
UFBA, Brasil.
C. pseudotuberculosis biovar ovis
1002
Instituto de Ciências da Saúde,
UFBA, Brasil.
C. pseudotuberculosis biovar ovis
ULCC06.334
Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. pseudotuberculosis biovar ovis
CIP 102968T
Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. renale CIP 6937 Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. renale CIP 103421T Coleção Instituto Pasteur, França.*
C. ulcerans ULCA3.675,1 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. ulcerans HJ01 BM3796.3 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. ulcerans HJ02 MN 675.3 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
C. ulcerans ULCB12.735,2 Hospital Universitário Ghent,
Bélgica.*
* Bactérias gentilmente cedidas pelo Dr. Mario Vaneechoutte, Ghent University Hospital, Bélgica.
T Linhagem de referência.
3.3.2. AMOSTRAS CLÍNICAS
3.3.2.1. AMOSTRAS DE MATERIAL PURULENTO
Amostras de material purulento (n = 56) foram coletadas assepticamente de
abscessos presentes em linfonodos de ovelhas ou cabras naturalmente
portadoras de linfadenite caseosa (Carminati, 2005). As coletas foram realizadas
em duas regiões endêmicas para esta doença na região Nordeste do Brasil, por
técnicos da UFBA (Salvador – BA) e da EMBRAPA Caprinos (Sobral –CE). A
tabela 2 apresenta o detalhamento das amostras de pus utilizadas neste estudo.
3.3.2.2. AMOSTRAS DE SANGUE E SORO
Amostras de sangue e soro foram obtidas tanto de animais apresentando
sinais clínicos de linfadenite caseosa (n = 19) quanto de animais que não
apresentavam nenhum sinal da doença (n = 20) e pertenciam a rebanhos sem
histórico de infecção por C. pseudotuberculosis. Foi utilizado o sistema
Vacutainer de coleta de sangue (Becton Dickinson, Estados Unidos).
Tabela 2. Amostras de material purulento utilizadas neste estudo.
Animal* Espécie Raça Fonte Animal* Espécie Raça Fonte
100 Ovina ND UFBA 34/05 Ovina ND EMB.
SN Ovina ND UFBA 318 Caprina ND EMB.
15 Ovina ND UFBA 37/05 Ovina ND EMB.
52B Ovina ND UFBA 588 Caprina ND EMB.
108 Ovina ND UFBA 33/05 Ovina ND EMB.
154 Ovina ND UFBA 10 Caprina ND EMB.
1 (23/08) Caprina ND UFBA 351 Caprina ND EMB.
2 (23/08) Caprina ND UFBA 3673 Caprina ND EMB.
3 (23/08) Caprina ND UFBA 782 Caprina ND EMB.
4 (23/08) Caprina ND UFBA 87 Caprina Can. EMB.
5 (23/08) Caprina ND UFBA SN Caprina ND EMB.
6 (23/08) Caprina ND UFBA 94 Caprina ND EMB.
7 (23/08) Caprina ND UFBA 450 Caprina Mox. EMB.
8 (23/08) Caprina ND UFBA 197 Caprina ND EMB.
9 (23/08) Caprina ND UFBA 272 Caprina Ang. EMB.
10(23/08) Caprina ND UFBA SN Ovina ND EMB.
11(23/08) Caprina ND UFBA 371 Caprina Ang. EMB.
12(23/08) Caprina ND UFBA 3406 Caprina ND EMB.
13(23/08) Caprina ND UFBA 240 Caprina Mox. EMB.
14(23/08) Caprina ND UFBA 57 Ovina S.In. EMB.
2 (14/07) Caprina ND UFBA 01 Ovina ND EMB.
7 (14/07) Caprina ND UFBA 589 Caprina ND EMB.
382 Caprina ND EMB. 3647 Caprina ND EMB.
27/09 Caprina ND EMB. 3556 Caprina ND EMB.
412 Caprina ND EMB. 2641 Caprina ND EMB.
Lab47 Caprina ND EMB. 640 Caprina ND EMB.
35 Caprina ND EMB. 462BNB Caprina ND EMB.
0279 Caprina ND EMB. 3618 Caprina ND EMB.
EMB. = EMBRAPA Caprinos. ND = Não definida. Can. = Canindé. Mox. = Moxotó. Ang. = Anglo.
S.In. = Santa Inês.
*Número de identificação do animal na Universidade Federal da Bahia ou na EMBRAPA Caprinos.
3.4. MÉTODOS
3.4.1. ISOLAMENTO BACTERIANO E IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA
DOS ISOLADOS
Todas as amostras de pus coletadas foram submetidas a cultivo bacteriano,
como mencionado no item 3.3.1. Teste de Gram foi realizado com as colônias
obtidas que apresentaram morfologia semelhante a C. pseudotuberculosis
(colônias pequenas de coloração creme-alaranjada e opaca). Os isolados que
apresentaram coloração Gram-positiva foram submetidos a testes bioquímicos
para identificação bacteriana (testes de urease, catalase, e fermentação de
glicose) (Smibert & Krieg, 1994; Carminati, 2005). Os que apresentaram
resultados positivos nestes testes bioquímicos foram posteriormente submetidos
aos testes de hemólise sinérgica com Rhodococcus equi ATCC33701 e inibição
de beta-hemólise com Staphylococcus aureus ATCC25923 (Smibert & Krieg,
1994; Carminati, 2005). Confirmação da identificação foi realizada com a bateria
comercial de testes bioquímicos API Coryne (bioMérieux SA, França).
O isolamento e identificação de C. pseudotuberculosis foi utilizado como
padrão-ouro para avaliar a sensibilidade do teste estudado.
3.4.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO
3.4.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE CULTURAS
BACTERIANAS
A extração de DNA genômico a partir de culturas foi realizada da mesma
forma para todas as linhagens bacterianas utilizadas neste estudo. Culturas de 20
ml foram centrifugadas a 5.000 rpm, por 10 min., a 4ºC. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado ressuspendido em 1 ml de solução I (vide item 3.2.3).
Após vortexar, a mistura foi novamente centrifugada, desta vez a 13.000 rpm, por
10 min., a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado, e foi adicionado
1 ml de solução II (vide item 3.2.3). Após ressuspender o precipitado, a amostra foi
incubada em banho-maria por 30 min. a 37ºC. Foram adicionados 30 µl de sarcosil
30%; a amostra foi homogeneizada por 15 min. e então deixada em banho-maria a
65ºC por 5 min., seguido por incubação a 4ºC por 5 min.
Para purificação do DNA extraído, foi utilizado um protocolo padrão de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Sambrook e cols., 1989). Em resumo, 1 ml da
solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (vide item 3.2.3) foi adicionado à
amostra. Após vortexadas, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 7
min. A fase superior da amostra foi retirada e transferida para um novo microtubo
de 2 ml. Repetiu-se o passo de purificação com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico.
Ao final, a fase superior da amostra foi transferida para um novo microtubo, a fim
de proceder-se à precipitação do DNA genômico. Etanol absoluto foi adicionado
numa quantidade equivalente a duas vezes o volume da amostra. Acrescentou-se
solução de NaAC (3M) numa quantidade equivalente a 10% do volume da
amostra, e solução de glicogênio equivalente a 1% do volume total. O DNA foi
precipitado O.N. a -20ºC. Após centrifugação a 13.000 rpm por 10 min., o
precipitado foi lavado com etanol a 70% e o DNA ressuspendido em água mili-Q
estéril.
3.4.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS CLÍNICAS DE LINFADENITE CASEOSA
3.4.2.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM OS PROTOCOLOS CTAB-SDS E PK-ROCHE
Dois protocolos previamente descritos para extração de DNA de
Mycobacterium tuberculosis a partir de amostras clínicas de pacientes portadores
de tuberculose (Honoré-Bouakline e cols., 2003) foram utilizados para extração de
DNA de C. pseudotuberculosis a partir das amostras clínicas de linfadenite
caseosa. Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma
amostra de sangue foram ressuspendidos em 1 ml de solução II (vide item 3.2.3),
em um microtubo de 2 ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC
por 1 hora. 20 µl de proteinase K (20 mg/ml) foram adicionados a cada uma das
amostras, que foram incubadas em banho-maria a 56ºC por 2-3 horas. Após o
tempo de incubação, as amostras foram separadas em duas alíquotas de 500 µl.
À primeira alíquota, foram adicionados 35 µl de SDS a 10%; a amostra foi
vortexada e incubada em banho-maria a 65ºC, por 10 minutos. Foram adicionados
90 µl de CTAB-NaCl, e novamente a amostra foi incubada a 65ºC por 10 minutos.
A segunda alíquota de 500 µl foi centrifugada por 5 minutos a 13.000 rpm;
parte do sobrenadante foi retirada com uma pipeta, de forma a restarem 100 µl de
solução no final. A amostra foi então incubada por 15 minutos a 95ºC para
inativação da proteinase K.
O DNA presente em ambas alíquotas foi purificado e precipitado como
descrito no item 3.4.2.1.
3.4.2.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM O PROTOCOLO PK-SARCOSIL
Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma amostra
de sangue foram ressuspendidos em 1 ml de solução II (vide item 3.2.3), em um
microtubo de 2ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 1
hora. 20 µl de proteinase K (20 mg/ml) foram adicionados a cada uma das
amostras, que foram incubadas em banho-maria a 56ºC por 2-3 horas. Após o
tempo de incubação, as amostras foram separadas em duas alíquotas de 500 µl.
A cada alíquota foram acrescentados 25 µl de sarcosil 30%. As amostras foram
homogeneizadas por 15 min. e incubadas em banho-maria a 65ºC por 5 min. Após
incubação a 4ºC por 5 min., prosseguiu-se a purificação e precipitação do DNA,
como mencionado no item 3.4.2.1.
3.4.2.2.3. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM O KIT WIZARD® GENOMIC DNA
PURIFICATION (PROMEGA)
Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma amostra
de sangue foram ressuspendidos em 600 µl de solução II (vide item 3.2.3), em um
microtubo de 2ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 1
hora. Após centrifugação a 13.000 rpm por 2 min., o sobrenadante foi descartado
e foram acrescentados 600 µl de “Nuclei Lysis Solution”; a mistura foi
homogeneizada gentilmente com o auxílio de uma pipeta. Incubou-se em banho-
maria a 80ºC por 5 min.; as amostras foram deixadas para esfriar a temperatura
ambiente. Então, adicionou-se 3 µl de “RNase solution”; após homogeneizar,
novamente as amostras foram incubadas, desta vez a 37ºC por 30 min. Adicionou-
se 200 µl de “Protein Precipitation Solution” e seguiu-se incubação no gelo por 5
min. As misturas foram centrifugadas a 13.000 rpm por 3 min. e o sobrenadante
contendo DNA foi transferido para um novo tubo. A precipitação do DNA foi
realizada como mencionado no item 3.4.2.1.
3.4.2.2.4. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE
AMOSTRAS DE SORO COM O KIT CHARGESWITCH gDNA 1 ML SERUM
(INVITROGEN)
A extração de DNA a partir das amostras de soro foi feita de acordo com as
recomendações do fabricante do “ChargeSwitch® gDNA 1 ml Serum Kit”.
Brevemente, a 1 ml de soro foram adicionados 700 µl do tampão de lise (L19), 30
µl de proteinase K e 5 µl de RNase A. A mistura foi misturada gentilmente e
incubada à temperatura ambiente por 20 min. Então, foram adicionados 250 µl do
tampão de purificação (N7) e 30 µl da solução contendo esferas magnéticas. Após
homogeneizar, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 2 min.;
posteriormente, os microtubos foram colocados na raque magnética por 3 min.
Assim que se formou o precipitado de esferas magnéticas no fundo dos tubos, os
sobrenadantes foram retirados com o auxílio de pipeta e descartados. Os tubos
foram retirados da raque magnética, e o precipitado foi ressuspendido em 1 ml de
tampão de lavagem (W12). Após voltar os tubos para a raque, os sobrenadantes
foram novamente retirados e repetiu-se a lavagem dos precipitados. A fim de eluir
o DNA ligado às esferas magnéticas, 50 µl de tampão de eluição (E5) foram
adicionados a cada amostra; incubou-se por 2 min. à temperatura ambiente e os
tubos foram recolocados na raque magnética até que todas as esferas
precipitassem. O sobrenadante contendo o DNA purificado foi transferido para um
novo microtubo.
3.4.3. DOSAGEM DO DNA GENÔMICO EXTRAÍDO
A dosagem do DNA genômico extraído foi feita com o auxílio de um
espectrofotômetro, como descrito (Brigido, 2003). Basicamente, a medida de
absorbância num comprimento de onda de 260 nm foi multiplicada pelo fator de
conversão para DNA fita dupla (50) e pela diluição da amostra, para obter a
concentração em µg/ml.
3.4.4. ENSAIO DE PCR-MULTIPLEX
A tabela 3 lista os iniciadores utilizados neste estudo. A padronização do
ensaio de PCR-multiplex seguiu basicamente os passos descritos por Henegariu e
cols. (1997), sumarizados na figura 1.
As reações foram feitas para um volume final de 10 µl. A tabela 4 lista as
concentrações de reagentes utilizadas com cada uma das três polimerases
testadas.
Os iniciadores 12S-F e 12S-R (12S rDNA de caprinos e ovinos) são
incluídos nas reações com DNA extraído diretamente de amostras clínicas. O
produto de 274 pb funciona como um controle interno de amplificação não
competitivo (Hoorfar e cols., 2004), o qual permite diferenciar amostras que inibem
a reação de PCR das que são verdadeiramente negativas.
Tabela 3. Iniciadores utilizados neste estudo.
Iniciador Seqüência Gene-alvo [ ] uso Fonte
16S-F 5’-ACCGCACTTTAGTGTGTGTG-3’ 16S rDNA 2 µM
16S-R 5’-TCTCTACGCCGATCTTGTAT-3’ 16S rDNA 2 µM
Çetinkaya e cols., 2002
C2700F 5’-CGTATGAACATCGGCCAGGT-3’ rpoB 2 µM
C3130R 5’-TCCATTTCGCCGAAGCGCTG-3’ rpoB 2 µM
Khamis e cols., 2004
MPLD1 5’-ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA-3’ pld 2 µM
MPLD2.1 5’-ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG-3’ pld 2 µM
Este trabalho.a
12S-F 5’-CCAGCCACCGCGGTCATACG-3’ 12S rDNA 0,2 µM
12S-R 5’-TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG-3’ 12S rDNA 0,2 µM
Este trabalho.b
a Iniciadores desenhados de acordo com a seqüência do gene da phospholipase D de C.
pseudotuberculosis (acesso GenBank: L16585). b Iniciadores desenhados de acordo com as seqüências do 12S rDNA de Capra hircus e Ovis aries
(acessos GenBanK: AJ490504 e AJ490503).
Figura 1. Protocolo passo-a-passo para o desenvolvimento e otimização de
PCR-multiplex. TRADUZIDO e ADAPTADO: Henegariu e cols., 1997.
Passo 1. Escolha das seqüências dos iniciadores • GC = 30-60% • 20 pb ou maior • Produtos de amplificação separáveis em gel de agarose
Passo 2. Teste/ alinhe os iniciadores • uns com os outros • BLAST para seqüências repetitivas
Passo 3. PCR singleplex: programa inicial � Amplifique todos os loci individualmente; mesmas condições � Use tampão a 1X, sem adjuvantes � Ajuste somente as condições dos ciclos
Passo 4. PCR Multiplex: mistura equimolar de iniciadores � 0,1 a 0,4 µM de cada iniciador � Use o programa de PCR do passo 3
A. Todos os produtos estão fracos a) Use tempos de extensão maiores b) Diminua tº de extensão para 62-68ºC c) Diminua tº de anelamento em pequenos passos (2ºC) d) Ajuste a conc. de Taq polimerase
B. Produtos pequenos estão fracos a) Aumente a conc. de tampão para 1,4-2X b) Diminua tº de anelamento e ou extensão c) Aumente a conc. de iniciadores para os loci fracos
C. Produtos grandes estão fracos a) Aumente o tempo de extensão b) Aumente tº de anelamento e ou extensão c) Aumente a conc. de iniciadores para os loci fracos d) Diminua a conc. de tampão para 0,7-0,8X mas mantenha MgCl2 constante a 1.5-2 mM
D. Produtos inespecíficos a) grandes: aumente conc. tampão para 1,4-2X b) pequenos: diminua conc. de tampão para 0,7-0,9X c) Aumente gradualmente a tº anelamento d) Diminua a quantidade de molde e enzima e) Aumente MgCl2 (máx. 12 mM)
Passo 5.
Quando necessário, diluições seriadas de duas vezes (1:2, 1:4, 1:8) foram
realizadas com as amostras clínicas, a fim de remover a inibição da PCR.
As reações foram preparadas em microtubos de 200 µl (PerkinElmer) e
realizadas em um termociclador (PTC-100, MJ Research Inc.), nas condições
descritas na tabela 4. Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de
agarose a 1% corado com brometo de etídio.
Tabela 4. Reações de mPCR com diferentes polimerases.
Sistemas e Reagentes Concentração
Final
Condições dos
Ciclos
AccuPrime™ Taq DNA polymerase
Tampão 10X II 1X
Iniciadores 2 µM ou 0,2 µM a
Taq DNA polimerase 1,5 U
DNA molde 10-100ng b
H2O mili-Q q.s.p. 10 µl
P1: 95ºC por 3 min.
P2: 95ºC por 1 min.
P3: 58ºC por 40 seg
P4: 68ºC por 1 min.
e 30 seg.
P5: 40 X de P2 a P4
P6: 68ºC por 7 min.
Taq DNA Polymerase, Recombinant
Tampão 10X 1X
dNTPs 2 mM
MgCl2 3 mM
Iniciadores 2 µM ou 0,2 µM a
Taq DNA polimerase 1,5 U
DNA molde 10-100ng b
H2O mili-Q q.s.p. 10 µl
P1: 95ºC por 3 min.
P2: 95ºC por 1 min.
P3: 58ºC por 40 seg
P4: 72ºC por 1 min.
e 30 seg.
P5: 40 X de P2 a P4
P6: 72ºC por 7 min.
Eppendorf® MasterMix (2.5X)
MasterMix (2.5X) 1X
DNA molde 10-100ng b
H2O mili-Q q.s.p. 10 µl
As mesmas
descritas para
AccuPrime™ Taq
DNA polymerase.
a Veja tabela 3. P = Passo. b Somente em reações utilizando DNA extraído de culturas puras.
3.4.4.1. TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA
Para testar a sensibilidade analítica do ensaio de mPCR, DNA genômico de
C. pseudotuberculosis CIP 102968T foi extraído (vide item 3.4.2.1) e dosado em
espectrofotômetro. A concentração do DNA foi acertada para 100 ng/µl e diluições
seriadas de dez vezes foram realizadas, como segue: 10 ng/µl; 1 ng/µl; 100 pg/µl;
10 pg/µl; 1 pg/µl; 100 fg/µl; e 10 fg/µl. Reações de PCR foram feitas em triplicata
com cada uma destas concentrações de DNA, para todas as polimerases
testadas. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1%.
Uma das séries de reações foi corrida em gel de poliacrilamida a 6% corado
pela prata, para avaliar se haveria diferença na sensibilidade de detecção de
produtos amplificados, comparado ao gel de agarose a 1%.
3.4.4.2. TESTE DE ESPECIFICIDADE
Para testar a especificidade do ensaio de mPCR foram feitas reações
contendo 10 ng de DNA genômico de cada uma das linhagens bacterianas
taxonomicamente próximas a C. pseudotuberculosis, listadas na tabela 1. O perfil
de amplificação de cada linhagem foi analisado em gel de agarose a 1%.
3.4.4.3. TESTE DE REPRODUTIBILIDADE
A reprodutibilidade do ensaio de mPCR foi testada com 40 isolados de C.
pseudotuberculosis, previamente identificados por testes bioquímicos (Tab. 1).
3.4.4.4. CONFIRMAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS
Para confirmar a especificidade dos produtos amplificados pelo ensaio de
mPCR, cada um dos três genes foi amplificado separadamente para dez isolados
de C. pseudotuberculosis; os produtos de PCR foram purificados por um protocolo
de precipitação utilizando PEG 8000 (Kusukawa e cols., 1990), e posteriormente
seqüenciados. Basicamente, o produto da reação de PCR foi transferido para um
microtubo de 500 µl. Volume igual de solução de PEG 8000 (15%) foi adicionado e
a mistura foi incubada em banho-maria a 37ºC por 15 min. Após centrifugar a
13.000 rpm por 15 min., o sobrenadante foi cuidadosamente retirado com a pipeta
e descartado. 125 µl de etanol a 80% gelado foram adicionados e centrifugou-se
novamente a 13.000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi retirado com a pipeta.
Realizou-se mais uma lavagem com etanol 80%, e o precipitado seco foi
ressuspendido em água mili-Q.
A reação de sequenciamento dos produtos de PCR purificados foi feita
utilizando o kit DYEnamic ET Dye Terminator (Amersham Biosciences), de acordo
com as recomendações do fabricante. As seqüências foram geradas no aparelho
MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences).
3.4.4.5. LIMITE DE DETECÇÃO EM AMOSTRAS CLÍNICAS
Para determinar o limite de detecção do ensaio de mPCR em amostras
clínicas, amostras de sangue de caprinos não-portadores de linfadenite caseosa
foram misturadas com diluições de uma cultura de 48 horas de C.
pseudotuberculosis. Essas diluições foram previamente plaqueadas em meio BHI-
ágar para determinar a quantidade de unidades formadoras de colônia (UFC) de
C. pseudotuberculosis por ml. A mistura foi processada por todo o protocolo de
extração descrito no item 3.4.2.2.2. Reações de mPCR foram feitas com os DNAs
extraídos de todas as misturas. O teste de limite de detecção foi realizado em
triplicata e o resultado expresso como uma média dos três valores.
3.4.4.6. CÁLCULO DA SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA
Para calcular a sensibilidade diagnóstica do ensaio de mPCR, foi obtida a
proporção entre as amostras que renderam um resultado positivo no teste e
aquelas que renderam resultados positivos no teste de referência (isolamento e
identificação bacteriana) (McAdam, 2000).
3.4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Uma análise foi realizada para avaliar se há diferença na sensibilidade do
ensaio de mPCR quando aplicado em amostras de ovinos ou caprinos. Para tal,
uma tabela 2 x 2 foi construída com os resultados obtidos e aplicou-se o teste qui-
quadrado (Ayres e cols., 2000). O pacote de análises estatísticas STATISTICA
(StatSoft, Inc.) foi utilizado para calcular intervalos de confiança.
3.4.6. DETERMINAÇÃO DA EQUIVALÊNCIA GENÔMICA DE C.
pseudotuberculosis
Para determinar a equivalência em fg do genoma de 1 UFC de C.
pseudotuberculosis extraiu-se o DNA genômico de uma cultura de 10 ml cuja
densidade de células foi determinada por plaqueamento. O DNA extraído foi
dosado em espectrofotômetro e a relação “Quantidade de DNA/ Nº de UFC” foi
calculada.
3.4.7. DIGESTÃO ENZIMÁTICA DOS PRODUTOS DA mPCR
Os produtos de mPCR de 4 linhagens de C. pseudotuberculosis e 4
linhagens de C. ulcerans foram utilizados, diretamente ou após precipitação, em
reações de digestão enzimática com as enzimas de restrição Cla I e Bgl I; as
reações foram feitas de acordo com as recomendações dos fabricantes. Este teste
foi realizado a fim de avaliar se seria possível identificar polimorfismos de
comprimento de fragmentos de restrição entre os isolados.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. ARTIGO
Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium
pseudotuberculosis from Pure Cultures and for Rapid Detection of this
Pathogen in Clinical Samples
Luis G. C. Pacheco, Roberta R. Pena, Thiago L. P. Castro, Fernanda A. Dorella,
Robson C. Bahia, Renato Carminati, Marcílio N. L. Frota, Sérgio C. Oliveira,
Roberto Meyer, Francisco S. F. Alves, Anderson Miyoshi, Vasco Azevedo.
Este manuscrito será submetido para publicação em forma de artigo num
periódico científico internacional de referência na área de diagnóstico molecular
microbiológico.
Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from
Pure Cultures and for Rapid Detection of this Pathogen in Clinical Samples
Running title: MULTIPLEX PCR FOR DETECTION OF C. PSEUDOTUBERCULOSIS
Luis G. C. Pacheco,1, 2 Roberta R. Pena,1 Thiago L. P. Castro,1 Fernanda A. Dorella,1
Robson C. Bahia,3 Renato Carminati,3 Marcílio N. L. Frota,4 Sérgio C. Oliveira,2 Roberto
Meyer,3 Francisco S. F. Alves,5 Anderson Miyoshi,1 and Vasco Azevedo1*
Departamento de Biologia Geral 1 and Departamento de Bioquímica e Imunologia
2,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte – MG, Brazil; Departamento de
Bio-Interação, Universidade Federal da Bahia, Salvador – BA, Brazil;3
Universidade
Estadual Vale do Acaraú, Sobral – CE, Brazil;4 and Centro Nacional de Pesquisa de
Caprinos, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Sobral – CE, Brazil.5
* Corresponding author. Mailing address: Departamento de Biologia Geral, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627,
Belo Horizonte – MG, 31.270-901, Brazil. Phone/ Fax: + 55 31 34 99 26 10. E-mail:
vasco@icb.ufmg.br
ABSTRACT
Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous
lymphadenitis (CLA), a debilitating disease of sheep and goats. Accurate diagnosis of CLA
primarily relies upon microbiological examination, followed by biochemical identification
of isolates. In an effort to facilitate C. pseudotuberculosis detection, we developed a
multiplex-PCR (mPCR) assay targeting three genes of this bacterium: 16S rDNA, rpoB and
pld. This method allowed efficient identification of 40 isolates of this bacterium, which had
been previously identified by biochemical testing. Analysis of taxonomically-related
species did not generate the C. pseudotuberculosis mPCR amplification profile, thereby
demonstrating the assay’s specificity. As little as 1 pg of C. pseudotuberculosis genomic
DNA was detected by this mPCR assay, demonstrating the sensitivity of the method. The
detection limit in clinical samples was estimated to be 103 colony-forming units (CFU). We
were able to detect C. pseudotuberculosis directly in pus samples of infected sheep and
goats (n = 56) with a high diagnostic sensitivity (94.6%). The developed assay significantly
improves rapid C. pseudotuberculosis detection and could supersede bacteriological culture
for microbiological and epidemiological diagnosis of CLA.
Corynebacterium pseudotuberculosis is a mycolic acid-containing facultative
intracellular actinomycete associated with the development of abscesses in a variety of
mammalian hosts (10, 25, 32). This Gram-positive bacterium most commonly causes
ulcerative lymphangitis in horses and caseous lymphadenitis (CLA) in small ruminants (3,
36). The latter is a chronic disease of sheep and goats, mainly characterized by the
formation of suppurative abscesses in superficial and internal lymph nodes (17, 36). CLA is
globally distributed and causes important economic losses for ovine and caprine
husbandries, due to reduced wool, meat and milk yields, culling of affected animals and
condemnation of carcasses and skins in slaughterhouses (10, 36).
Once established in a herd or flock, CLA eradication is problematic due to the
inefficacy of antimicrobial therapy (27, 34, 36). The most reliable control strategy for this
disease involves vaccinating livestock and identifying and removing infected animals (4,
23). However, this approach is hindered by limitations in current diagnostic techniques (10,
21, 36).
Many serological tests have been proposed for CLA diagnosis, including the
complement fixation test (30), the synergistic hemolysis-inhibition test (5), the
microagglutination assay (20), and a C. pseudotuberculosis-exotoxin (phospholipase D)
antigen-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (8). Although these tests may
be of great value for the detection of subclinically infected animals, most present
drawbacks, including low sensitivity, poor specificity, and an inability to distinguish
between previously-exposed animals and those still harboring the pathogen. Thus, it is
questionable whether such techniques should be employed to orient culling programs (6,
36).
Accurate CLA diagnosis is primarily based upon clinical observations (external
abscesses) and identification of C. pseudotuberculosis by phenotypic and biochemical tests;
this is important to differentiate this bacterium from other abscess-inducing pathogenic
agents, such as Arcanobacterium pyogenes or Pasteurella multocida (8, 10, 36).
A 16S rDNA-based polymerase chain reaction assay has been developed to identify
C. pseudotuberculosis isolates (6). Although the assay was useful to estimate the
prevalence of CLA in the animals studied, it presented some limitations: (i) it was
dependent on bacterial culture; and (ii) it was not specific enough to distinguish C.
pseudotuberculosis from Corynebacterium ulcerans (6).
In order to improve C. pseudotuberculosis detection by PCR, we developed a
multiplex PCR (mPCR) assay and adapted a protocol to extract bacterial genomic DNA
directly from clinical samples. Amplification of multiple loci in a single reaction through
mPCR is a powerful and widely-used tool for the rapid and specific identification of
pathogenic bacteria (11, 22, 26, 35). Our mPCR targets three C. pseudotuberculosis genes:
16S rDNA, the gene of choice for most microbial taxonomy studies (6, 16); rpoB, a gene
currently used to study phylogenetic relationships in the genera Corynebacterium and
Mycobacterium (10, 15, 16); and pld, which encodes the exotoxin PLD, a
sphingomyelinase implicated in the virulence of C. pseudotuberculosis, C. ulcerans and A.
haemolyiticum (19). This mPCR enabled specific identification of C. pseudotuberculosis
isolates in culture and its direct detection in pus samples from CLA affected animals.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains and culture conditions. The bacterial strains used in this study
are listed in Table 1. A total of 40 caprine isolates of C. pseudotuberculosis were obtained
from different sources. One type strain of C. pseudotuberculosis biovar ovis, (strain CIP
102968T - Institute Pasteur Collection), and 13 strains of genetically or morphologically
related-bacteria were also used in the experiments.
Bacteria were routinely grown in Brain Heart Infusion broth (BHI: Oxoid,
Hampshire, England) or in BHI 1.5% bacteriological agar plates, at 37ºC for 48-72 hours.
Tween 80 was added to the medium at a final concentration of 1% for the C. bovis strain.
Clinical specimens. Fifty-six pus samples were aseptically collected from
abscessed lymph nodes of naturally-infected sheep (n = 12) and goats (n = 44) found in two
CLA-endemic areas of Brazil. Microbiological examination, followed by biochemical
identification, was used as a gold standard to confirm infection with C. pseudotuberculosis.
In brief, bacteriological culture was made of pus specimens, and the resultant C.
pseudotuberculosis-resembling colonies that stained Gram positive were further tested for
biochemical properties (glucose fermentation, urease and catalase) (8, 31). Synergistic
hemolysis with Rhodococcus equi ATCC33701 and inhibition of β-hemolysis by
Staphylococcus aureus ATCC25923 were also evaluated (8, 31). Species identification was
confirmed using the API Coryne battery (bioMérieux SA, France).
Blood samples were taken from confirmed C. pseudotuberculosis-infected animals
(n = 19) and from healthy animals (n = 20), using the Vacutainer® blood collection system
(Becton Dickinson, USA).
DNA isolation. Two different protocols were adapted for extracting DNA from
pure bacterial cultures and clinical samples.
(i) Bacterial cultures. Chromosomal DNA-extraction was performed in the same
manner for all bacterial strains. A 20 ml 48-72 hour-culture was centrifuged at 4ºC and
2,000 X g for 20 min. Cell pellets were resuspended in 1 ml of Tris-EDTA-RNase (Tris-
HCl 10 mM pH 7.0; EDTA 10 mM pH 8.0; NaCl 300 mM; RNase A 50 µg/ml) and
centrifuged again under the same conditions. Supernatants were discarded and pellets
resuspended in 1 ml of TE-lysozyme (Tris-HCl 25 mM pH 8.0; EDTA 10 mM pH 8.0;
NaCl 10 mM; lysozyme 10 mg/ml). Samples were then incubated at 37ºC for 30 min; 30 µl
of 30% sodium-N-lauroylsarcosine (sarcosyl) was added and the mixture was incubated for
20 min. at 65ºC, followed by incubation for 5 min. at 4ºC. DNA was purified with the
phenol-chloroform-isoamyl alcohol method and precipitated with ethanol (29). DNA
concentrations were determined spectrophotometrically.
(ii) Clinical samples. A DNA extraction-protocol previously described for clinical
samples of tuberculosis patients (13) was adapted for use in this study. Briefly, 100 mg of
pus or the pellet of a 2 ml blood sample was resuspended in 1 ml of TE-lysozyme. Samples
were incubated for 1 h at 37ºC; 20 µl of proteinase K (20 mg/ml) (Invitrogen, Germany)
was added, followed by incubation for 2 h at 56ºC. Samples were divided into two aliquots
of 500 µl, and 25 µl of 30% sarcosyl was added to each; mixtures were incubated for 20
min. at 65ºC and then for 5 min. at 4ºC. DNA was purified and precipitated as described
above.
Primers and mPCR conditions. The oligonucleotide primers used in this study are
listed in Table 2. Primers targeting the 16S rRNA and rpoB genes of C. pseudotuberculosis
were obtained from previously-published works (6, 15). Primers targeting the pld gene
were designed by aligning the pld nucleotide sequences of C. pseudotuberculosis and C.
ulcerans (GenBank accession numbers L16586 and L16585); the reverse primer PLD-R1
can be used, in association with the forward primer PLD-F, to amplify the pld genes of both
bacteria, while primer PLD-R2 excludes C. ulcerans (see Fig. 1B). A primer pair targeting
the mitochondrial 12S rRNA genes of Capra hircus and Ovis aries (GenBank accession
numbers AJ490504 and AJ490503) was designed in order to function as an internal
amplification control for the mPCR reactions performed with DNA extracted directly from
clinical samples of caseous lymphadenitis. This amplification control allows identification
of samples that possess inhibitory factors for the mPCR assay (14).
Multiplex PCRs were performed in a final reaction volume of 10 µl containing 1.5
U AccuPrime™ Taq DNA polymerase (Invitrogen), 1X PCR Buffer II (200 mM Tris-HCl,
500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, AccuPrimeTM protein, 10% glycerol), and 2
µM of each of the primers: 16S-F/ 16S-R, C2700F/ C3130R and PLD-F/ PLD-R2. For
mPCRs performed with DNA extracted from clinical samples, primers 12S-F/ 12S-R were
added to the reaction mixture at 0.2 µM each. The template concentration was
approximately 10 ng of DNA extracted from cultured C. pseudotuberculosis or from
clinical specimens. When necessary, serial twofold dilutions (1/2, 1/4, and 1/8) were
performed on samples to dilute inhibitory components (13). Reactions were carried out in a
thermal cycler (PTC-100, MJ Research Inc.) under the following conditions: initial
denaturation at 95ºC for 3 min.; 40 cycles of 95ºC for 1 min., 58ºC for 40 sec., and 68ºC for
1 min. 30 sec.; final extension was at 68ºC for 7 min. The amplified products were resolved
by electrophoresis on 1.0 % agarose gels and visualized by ethidium bromide staining.
Sequencing of singleplex PCR products. In order to confirm the mPCR results, 10
randomly-chosen isolates were further tested in singleplex PCR assays with the three C.
pseudotuberculosis-specific primer pairs; PCR products were precipitated with 15%
polyethylene glycol (18) and sequenced by using the DYEnamic ET Dye Terminator Kit
(Amersham Biosciences), according to the manufacturer’s instructions. The sequences were
compared with previously-published 16S rRNA (GenBank accession numbers X81916,
X81907 and X84255), rpoB (GenBank accession number AY492239) and pld (GenBank
accession numbers L16586 and L16587) C. pseudotuberculosis gene sequences, through
search for similarity using the Basic Local Alignment Search Tool - N (BLAST-N) (1).
Analytical specificity and sensitivity. To evaluate the specificity of the mPCR
assay, reactions were performed with genomic DNA extracted from bacterial strains
taxonomically similar to C. pseudotuberculosis biovar ovis (Table 1). Serial 10-fold
dilutions of DNA from C. pseudotuberculosis type strain CIP 102968T, ranging from 10 ng
to 0.0001 ng DNA/reaction, were used to test the sensitivity of the method.
To evaluate the assay’s detection limit, blood samples from goats that did not
present clinical symptoms of CLA, and which were negative in ELISA tests (performed
according to ref. 24), were seeded with 106 to 101 colony-forming units (CFU) of C.
pseudotuberculosis.
Statistical analysis. An analysis to evaluate differences in the sensitivity of the
mPCR assay between samples from sheep versus goats was performed with the chi-square
test, using the STATISTICA software package (StatSoft, Inc.).
RESULTS
Specificity and sensitivity of the mPCR assay. Purified genomic DNAs were used
to evaluate the sensitivity and specificity of the mPCR assay. When tested with DNA from
bacterial strains taxonomically related to C. pseudotuberculosis biovar ovis (see Tab. 1),
only C. pseudotuberculosis biovar equi CIP 5297 yielded a similar mPCR profile, with the
816 bp, 446 bp and 203 bp amplicons, corresponding to genes 16S rRNA, rpoB and pld,
respectively (Fig. 1A). As in a previous study (15), all of the Corynebacteria species that
we tested generated an amplicon of ca. 446 bp, corresponding to the rpoB gene (Fig. 1A).
As expected, the pld gene product was not detected in any of the four C. ulcerans strains
(Fig. 1A, lanes 4-7), illustrating the ability of the mPCR assay to differentiate this
bacterium from C. pseudotuberculosis. Moreover, two other pathogenic bacteria associated
with the formation of abscesses in small ruminants, A. pyogenes and P. multocida, were
clearly distinguished (Fig. 1A). The ca. 300 bp product generated by amplification of A.
pyogenes genomic DNA was sequenced and assigned to be the rpoB gene through search
for homology in GenBank using BLAST-N (data not shown). The sequence was deposited
under accession number DQ680032.
To determine the sensitivity of the assay, reactions were performed with serial 10-
fold dilutions of purified C. pseudotuberculosis CIP 102968T DNA. The mPCR method
was able to detect bacterial DNA at concentrations ranging from 10 ng – 0.001 ng per
reaction (Fig. 2).
To assess the detection limit of the assay in clinical specimens, blood samples of
healthy animals were spiked with 10-fold dilutions of a pure culture of C.
pseudotuberculosis CIP 102968T; the mixtures were processed with the entire DNA
extraction protocol. Amplification products were detected in reactions containing 106 – 103
CFU of C. pseudotuberculosis per ml of sample (data not shown).
Identification of bacterial isolates. The characteristic mPCR amplification profile
was obtained for all 40 C. pseudotuberculosis biovar ovis field isolates tested (Table 1).
Figure 3A shows the mPCR profiles of 10 randomly-chosen C. pseudotuberculosis biovar
ovis field isolates.
Identification of the 10 isolates was confirmed by sequencing each of the three
amplicons generated, followed by a search for similar sequences using BLAST-N (data not
shown).
Direct detection of C. pseudotuberculosis in clinical samples by mPCR. Pus
samples were collected from the lymph nodes of CLA-affected sheep and goats, and DNA
was extracted directly from these specimens using our protocol (see Materials and
Methods). Bacteriological culture was made from the samples, as a gold standard to
confirm infection by C. pseudotuberculosis. The mPCR protocol was performed as
described for purified bacterial DNA; however, a noncompetitive internal amplification
control (12S rDNA; see Materials and Methods) was included in these reactions in order to
allow differentiation between inhibited reactions, i.e. those in which there was no
amplification of the internal control, versus reactions in which the mPCR yielded a negative
result (14). Typical mPCR profiles of clinical samples are shown in Figure 3B.
Most of the undiluted samples were inhibitory for the mPCR assay, but more than
52% yielded evaluable results at a 1:2 dilution; around 45% showed amplification at a 1:4
dilution and only 3% at a 1:8 dilution. The proportions of samples positive in the mPCR
assay were not significantly different when comparing samples of sheep versus goats (P
value = 0.60). Table 3 summarizes the results obtained for pus samples.
The ability of the mPCR assay to detect C. pseudotuberculosis in blood samples
from confirmed CLA-infected animals was also evaluated, however none of the 19 blood
samples that we tested yielded a positive result (data not shown).
DISCUSSION
Caseous lymphadenitis remains a cause of concern for sheep and goat producers
worldwide (2, 10, 23, 36). Due to the high transmission rate of its etiological agent, C.
pseudotuberculosis, within a herd or flock, some authors suggest culling of any animal
from which this bacterium has been cultured as a means to control the spread of the disease
(2, 36). Since microbiological and biochemical methods are not always straightforward, the
development of a rapid and specific diagnostic tool is imperative for the control of CLA
(6).
The only previously-reported molecular method employed to specifically identify
C. pseudotuberculosis isolated from pus samples of CLA-affected animals, which is based
on the amplification of a 16S rRNA gene fragment (6), has two major drawbacks: (i)
dependence on bacterial culture; and (ii) inability to distinguish the bacterium C. ulcerans.
Our mPCR assay was specific enough to differentiate C. pseudotuberculosis from
C. ulcerans (Fig. 1A). These two bacteria have been reported to possess 99.7% similarity
between their 16S rRNA genes and 93.6% between their rpoB genes (15, 28); most of their
biochemical properties are similar and both may eventually produce diphtheric toxin (9,
28). The high genomic similarity may explain the inability of a previously published work
to differentiate these two bacteria by PCR (6). Since C. ulcerans is also a PLD producer,
the reverse primer used to amplify the pld gene in our study was designed so that it
possessed a mismatch in its 3’-end (two Gs instead of two Cs) (Fig. 1B), allowing
differentiation from C. pseudotuberculosis due to the absence of the 203 bp amplicon.
Although C. ulcerans is primarily recognized as a veterinary pathogen, there has
been a marked increase in the number of human infections (7, 9); it appears that domestic
cats and dogs can be potential reservoirs (7). In this context, our mPCR would be able to
identify bacteria collected from the nasal discharges of domestic animals and could
differentiate bacteria cultured from samples of diphtheria patients, by using the primer pair
PLD-F/ PLD-R1, which allows amplification of the pld gene of C. ulcerans (see Fig. 1B).
Çetinkaya et al. (6) reported a weaker amplification of the 816 bp 16S rRNA gene
amplicon in biovar equi of C. pseudotuberculosis, when compared to that of biovar ovis.
This result was attributed to a mismatch (an A instead of a G), five bases from the 5’-end of
the forward primer used (16S-F; Table 2). However, this result was not reproducible with
the conditions used in our study; we propose that amplification of the 16S rRNA gene using
primers 16S-F/ 16S-R is not sufficient to differentiate the two biovars of C.
pseudotuberculosis. It is interesting that infection of small ruminants with biovar equi is not
known to occur (33).
The mPCR assay was able to confirm identification of 40 C. pseudotuberculosis
field isolates and reliably detected this bacterium in a reaction mixture containing as little
as 0.001 ng of genomic DNA, illustrating its reproducibility and high sensitivity.
A DNA extraction-protocol was adapted to recover bacterial genomic DNA directly
from clinical samples of CLA-affected animals. This strategy offers advantages over
bacteriological culture, including reduced time of analysis and ability to detect unviable
bacteria. The detection limit of the goat blood spiking experiment was 103 CFU of C.
pseudotuberculosis/ml of sample. However, this value may underestimate the number of
viable organisms, since intracellular bacteria such as C. pseudotuberculosis and
Rhodococcus equi have a tendency to clump when cultured (12). A detection limit above
103 CFU per ml of sample would help explain the inability of the mPCR assay to detect C.
pseudotuberculosis in blood samples of infected sheep and goats.
On the other hand, the mPCR efficiently detected this bacterium in a high
proportion (94.6%) of confirmed CLA-infected pus samples. In contrast to serological CLA
testing (8, 20), the mPCR sensitivity was the same for both sheep and goats (Table 3).
Since our mPCR assay provides an efficient, accurate, rapid and reproducible
method for the identification of cultured C. pseudotuberculosis and its direct detection in
pus samples, we propose that it may be used instead of bacteriological culture as a
confirmatory CLA test.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de Minas Gerais, Brasil), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico, Brasil), and FINEP # 01.04.0760.00 (Financiadora de Estudos e Projetos –
Ministério da Ciência e Tecnologia, Brasil).
We wish to thank Dr. Mario Vaneechoutte and Dr. Andreas Tauch for providing
bacterial strains, and Frances Bolt for critical revision of the manuscript. We also
acknowledge technical assistance provided by technician Kátia Morais and by the Centro
Nacional de Pesquisa de Caprinos (EMBRAPA Caprinos, Brasil).
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TABLE 1. Bacterial strains and field isolates of C. pseudotuberculosis used in this study
Species Source/ Strain designation
Arcanobacterium pyogenes GUHa HJ 26 BA224.11
A. pyogenes-like GUH HJ 51 B
Corynebacterium amycolatum GUH HJ 08 I4218 LV
C. bovis GUH DL BOV25
C. diphtheriae ATCCb 13812
C. jeikeium NCTCc K411
C. pseudotuberculosis biovar equi CIPd 5297
C. pseudotuberculosis biovar ovise
(n = 37)
VD21; VD23; VD27; VD28; VD33; VD36; VD37;
VD38; VD41; VD42; VD43; VD44; VD45; VD46;
VD48; VD50; VD52; VD53; VD54; VD55; VD56;
VD57; VD58; VD59; VD60; VD61; VD62; VD63;
VD99; 01; 05; 08; 09; 11; 12; 21; 217
C. pseudotuberculosis biovar ovis UFBAf T1
C. pseudotuberculosis biovar ovis UFBA 1002
C. pseudotuberculosis biovar ovis GUH HJ ULCC06.334,4
C. pseudotuberculosis biovar ovis CIP 102968T
C. renale CIP 103421T
C. ulcerans GUH HJ ULCA3.675,1
C. ulcerans GUH HJ 01 BM3796.3
C. ulcerans GUH HJ 02 MN 675.3
C. ulcerans GUH HJ ULCB12.735,2
Pasteurella multocida IOCg
a GUH: Ghent University Hospital, Belgium. DL, HJ and SL: initials of donators, Devrise
Luc, Hommez Joseph and Sabbe Luc.
b ATCC: American Type Culture Collection, United States.
c NCTC: National Collection of Type Cultures, United Kingdom.
d CIP: Collection of Institute Pasteur, France.
e Caprine field isolates: obtained from Universidade Federal da Bahia, Brazil.
f UFBA: Collection of microorganisms of Universidade Federal da Bahia, Brazil.
g IOC: Collection of microorganisms of Instituto Oswaldo Cruz, Brazil.
T Type strain.
TABLE 2. List of oligonucleotide primers used in this study
Target
gene
Primers Sequence (5’ – 3’) Length of
PCR products
Source or
Reference
16S rDNA 16S-F ACCGCACTTTAGTGTGTGTG 816 bp (6)
16S-R TCTCTACGCCGATCTTGTAT
rpoB C2700F CGTATGAACATCGGCCAGGT 446 bp (15)
C3130R TCCATTTCGCCGAAGCGCTG
pld PLD-F ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA 203 bp This work
PLD-R1 ATCAGCGGTGATTGTCTTCC
PLD-R2 ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG
12S rDNA 12S-F CCAGCCACCGCGGTCATACG 274 bp This work
12S-R TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG
TABLE 3. Results of direct detection of C. pseudotuberculosis in pus samples of caseous
lymphadenitis-infected animals using the mPCR assay
Status in the mPCR Pus Samplesa
Positive Negative
Sensitivity
(%)
Sheep
(n = 12)
11 1 91.7
Goats
(n = 44)
42 2 95.4
Total
(n = 56)
53 3 94.6
a Samples positive for C. pseudotuberculosis in bacteriological culture (gold standard).
FIG. 1. Analytical specificity of the mPCR assay. (A) Amplification profiles of bacteria
genetically or morphologically related to Corynebacterium pseudotuberculosis. MW, 1 Kb
Plus DNA Ladder (Invitrogen); lanes 1-15, reactions with DNAs of the following bacterial
strains: 1-2 C. pseudotuberculosis ovis strains CIP 102968T and 1002; 3- C.
pseudotuberculosis equi CIP 5297; 4-7 C. ulcerans strains ULCA3.675,1, HJ01 BM3796.3,
HJ02 MN 675.3, and ULCB12.735,2; 8- C. diphtheriae ATCC 13812; 9- C. amycolatum
HJ 08 I4218 LV; 10- C. renale CIP 103421T; 11- C. bovis DL BOV25; 12- C. jeikeium
K411; 13- Arcanobacterium pyogenes HJ 26 BA224.11; 14- A. pyogenes-like HJ 51 B; 15-
Pasteurella multocida. Lane 16, negative control (reaction without template DNA). (B)
Schematic representation of primer-annealing sites in the pld genes of C.
pseudotuberculosis (Cp) and C. ulcerans (Cu). The underlined nucleotides indicate
positions of mismatch between the two aligned gene sequences (see text for details).
FIG. 2. Analytical sensitivity of the mPCR assay. MW, 1 Kb Plus DNA Ladder
(Invitrogen); lanes 1-6, mPCR with serial 10-fold dilutions of C. pseudotuberculosis CIP
102968T genomic DNA, as follows: 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, and 0.0001 ng. Lane 7, negative
control (reaction without template DNA).
FIG. 3. Reproducibility of the mPCR assay. (A) MW, GeneRuler DNA Ladder Mix
(Fermentas); lanes 1-10, mPCR amplification profiles of 10 out of 40 field isolates of C.
pseudotuberculosis. (B) MW, 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); lanes 1-3, direct
detection of C. pseudotuberculosis in pus samples of CLA-animals.
FIGURE 1
FIGURE 2
16S rDNA
MW 1 2 3 4 5 6 7
rpoB
pld
816 bp
446 bp
203 bp
FIGURE 3
A
B
16S rDNA
rpoB
pld
500 bp
200 bp
800 bp
MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
16S rDNA
rpoB
12S rDNA pld
850 bp
500 bp
300 bp 200 bp
MW 1 2 3
4.2. RESULTADOS ADICIONAIS
4.2.1. SENSIBILIDADE ANALÍTICA DO ENSAIO DE mPCR COM
DIFERENTES DNA POLIMERASES
Para comparar a sensibilidade do ensaio de mPCR quando duas enzimas
DNA polimerases diferentes foram utilizadas (vide Tab. 4), reações foram
realizadas contendo diluições seriadas de 10 vezes do DNA genômico de C.
pseudotuberculosis CIP 102968T, como descrito no item 3.4.4.1. A Figura 2
apresenta os resultados obtidos em uma das três séries de reações realizadas
com os dois sistemas de amplificação.
Figura 2. Testes de sensibilidade do ensaio de mPCR. Gel de agarose a 1%
mostrando reações realizadas com dois sistemas de amplificação diferentes. PM:
padrão de peso molecular GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas). Canaletas 1-
5: Reações utilizando o sistema AccuPrime™ (Invitrogen), com as seguintes
concentrações de DNA genômico da C. pseudotuberculosis: 10ng, 1ng, 100pg,
10pg e 1pg. Canaletas 6-10: Reações utilizando o sistema Taq DNA Polimerase
Recombinante (Invitrogen), com as seguintes concentrações de DNA genômico:
10ng, 1ng, 100pg, 10pg e 1pg.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Taq AccuPrimeTM Taq Recombinante
200 pb
500 pb 800 pb
É possível notar que a enzima Taq AccuPrime™ DNA polimerase
(Invitrogen) apresentou uma sensibilidade 1000 vezes superior à da Taq DNA
Polimerase Recombinante (Invitrogen), permitindo a amplificação dos três
fragmentos correspondestes aos genes 16S rRNA, rpoB e pld até a concentração
de 10 pg de DNA genômico da C. pseudotuberculosis por reação, enquanto que
produtos de amplificação com a segunda enzima foram visualizados somente até
a concentração de 10 ng de DNA genômico / reação (Figura 2).
Para avaliar se a sensibilidade de detecção dos produtos amplificados pela
reação de mPCR seria afetada pelo método de visualização utilizado, as reações
realizadas com o sistema Taq DNA Polimerase Recombinante (Invitrogen) foram
resolvidas em gel de poliacrilamida a 6% corado pela prata (Figura 3).
Figura 3. Teste de sensibilidade com o sistema Taq DNA Polimerase
Recombinante (Invitrogen), resolvido em gel de poliacrilamida a 6% corado
pela prata. PM: padrão de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen).
Canaletas 1-2: Resultados das reações de mPCR utilizando como molde 10 ng e 1
ng de DNA genômico da C. pseudotuberculosis, respectivamente.
PM 1 2
1018 pb
506 pb
201 pb
16S rDNA (816 pb)
rpoB (446 pb)
pld (203 pb)
A análise dos resultados permitiu constatar que não houve diferença na
sensibilidade do gel de poliacrilamida quando comparado ao gel de agarose a 1%,
uma vez que não foram observados produtos amplificados nas reações utilizando
1 ng de DNA genômico da C. pseudotuberculosis (Figuras 2 e 3).
Figura 4. Amplificação do gene 16S rRNA de C. pseudotuberculosis
utilizando o sistema AccuPrime™ (Invitrogen). PM: padrão de peso molecular
GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas). Canaletas 1-8: reações com diluições
seriadas de DNA genômico de 10ng a 10fg. CN(controle negativo): reação sem
DNA molde.
A reação de mPCR perde em sensibilidade mas é compensada pelo grande
ganho em especificidade. Quando o sistema AccuPrime™ (Invitrogen) foi utilizado
para amplificar os três loci de C. pseudotuberculosis separadamente, foi possível
visualizar produtos amplificados em gel de agarose até uma concentração de 10 fg
de DNA genômico / reação (Figura 4). Esse resultado indica que a amplificação
dos genes em formato multiplex diminui a sensibilidade de detecção da reação em
até 1000 vezes. Contudo, o limite obtido para a mPCR (10 pg) já é um valor
altamente sensível e condizente com a literatura (Cremonesi e cols., 2005; Scholz
PM 10ng 1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 50fg 10fg CN
16S rDNA (816 pb)
e cols., 2006). Em razão dos resultados descritos acima, o sistema AccuPrime™
foi o escolhido para a continuidade dos trabalhos.
4.2.2. EQUIVALÊNCIA GENÔMICA DO LIMITE DE DETECÇÃO DA
mPCR
Para estimar a quantidade em UFC de C. pseudotuberculosis que
equivalem ao valor encontrado para a sensibilidade analítica da mPCR (10 pg de
DNA genômico), foi feita cultura dessa bactéria em caldo BHI, plaqueamento,
contagem de UFC e extração de DNA genômico seguida por dosagem em
espectrofotômetro, como descrito no item 3.4.6.
O valor médio estimado para a equivalência genômica de C.
pseudotuberculosis foi de 24,04 ± 22,57 fg de DNA / UFC. De acordo com essa
estimativa, o limite de detecção da mPCR (10 pg) seria correspondente a
aproximadamente 4,16 X 102 UFC desta bactéria. No entanto, o valor encontrado
para a equivalência genômica pode ser considerado superestimado, uma vez que
bactérias intracelulares como C. pseudotuberculosis tendem a formar agregados
quando cultivadas e, portanto, a contagem do número de UFC após plaqueamento
não reflete de maneira acurada a quantidade de células viáveis em cultura (Jolly,
1965; Harrington e cols., 2005).
4.2.3. ESPECIFICIDADE DO ENSAIO DE mPCR
A possibilidade de diferenciar C. pseudotuberculosis de C. ulcerans e A.
pyogenes representa uma grande vantagem do ensaio de mPCR desenvolvido.
Como já discutido no item 4.1., o único trabalho prévio que desenvolveu um
ensaio baseado em PCR para detectar C. pseudotuberculosis não conseguiu
diferenciar essa bactéria de C. ulcerans, devido à grande similaridade genética
entre estas duas espécies. Já a diferenciação de A. pyogenes também representa
um resultado importante, uma vez que esse patógeno está presente em
aproximadamente 5% das amostras de pus coletadas em abscessos de caprinos
(Gouveia, 1986; Jost & Billington, 2005).
Para testar a especificidade do ensaio de mPCR, foram feitas reações com
DNA genômico extraído de bactérias taxonomicamente próximas a C.
pseudotuberculosis (Tab. 1, Materiais e Métodos). A Figura 5 mostra o perfil de
amplificação obtido para cada uma das linhagens utilizadas.
Os resultados obtidos mostram que a utilização da PCR em formato
multiplex para detectar C. pseudotuberculosis faz com que a reação fique
altamente específica e torna desnecessário um passo mais trabalhoso de
detecção de produtos amplificados, como hibridização de sondas com marcação
radioativa (Edwards & Gibbs, 1995; Yang & Rothman, 2004).
Figura 5. Especificidade da reação de mPCR. Gel de agarose 1% mostrando os
perfis de amplificação do ensaio de mPCR com DNAs de diferentes espécies
bacterianas. PM: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
Canaletas 1-16: Reações de mPCR com as seguintes linhagens: (1) C.
pseudotuberculosis biovar ovis CIP102968T; (2) C. pseudotuberculosis biovar ovis
ULCC06.334,4; (3) C. pseudotuberculosis biovar equi CIP5297; (4) C. ulcerans
ULCA3.675,1; (5) C. ulcerans HJ01BM; (6) C. ulcerans ULCB12.735,2; (7) C. ulcerans
HJ02MN; (8) C. amycolatum HJ08; (9) C. renale CIP103421T; (10) C. renale CIP6937;
(11) C. bovis BOV25; (12) C. bovis BOV23; (13) A. haemolyticum SL2212; (14) A.
pyogenes HJ26; (15) A. pyogenes A93; (16) A. pseudopyogenes HJ51.
4.2.4. REPRODUTIBILIDADE DO ENSAIO DE mPCR
Como já descrito no item 4.1., a reprodutibilidade do ensaio de mPCR foi
testada com DNA extraído de 40 isolados de C. pseudotuberculosis, cuja
identificação foi confirmada previamente por testes bioquímicos. A Figura 6
apresenta os perfis de amplificação obtidos para 38 destes isolados.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 PM
16S rDNA (816 pb)
rpoB (446 pb)
pld (203 pb)
Figura 6. Perfis de amplificação de 38 isolados de C. pseudotuberculosis.
PM: padrão de peso molecular GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas).
Canaletas 1-19 e 20-38: mPCR com DNAs genômicos extraídos de isolados de
campo. CN (controles negativos): reações sem DNA molde.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 CN
16S rDNA (816 pb)
rpoB (446 pb)
pld (203 pb)
PM 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 CN
16S rDNA (816 pb)
rpoB (446 pb)
pld (203 pb)
4.2.5. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE C. pseudotuberculosis A
PARTIR DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE LINFADENITE CASEOSA
A detecção direta de C. pseudotuberculosis através da mPCR em amostras
clínicas de animais portadores de linfadenite caseosa representa uma
possibilidade extremamente atraente para o diagnóstico desta enfermidade, uma
vez que o método padrão de diagnóstico laboratorial (isolamento bacteriano e
identificação bioquímica de isolados) é extremamente trabalhoso e de alto custo.
Quatro protocolos diferentes foram testados para extrair DNA genômico de
C. pseudotuberculosis a partir de amostras de pus e sangue de animais
portadores de linfadenite caseosa (vide item 3.4.4.2). Foi possível extrair DNA das
amostras clínicas com três dos quatro protocolos testados, a exceção do protocolo
denominado de PK-Roche (Honoré-Bouakline e cols., 2003). No entanto, só foi
possível obter amplificação dos genes de C. pseudotuberculosis por mPCR
quando foram utilizados os DNAs extraídos com os protocolos CTAB-SDS e PK-
SARCOSIL. Em razão de ser mais prático esse último protocolo foi escolhido para
ser utilizado na continuidade dos trabalhos.
Os resultados da detecção direta de C. pseudotuberculosis em amostras
clínicas são apresentados no item 4.1.
4.2.6. LIMITE DE DETECÇÃO DA mPCR EM AMOSTRAS CLÍNICAS
Para calcular o limite de detecção da reação de mPCR em amostras
clínicas, foram realizadas misturas artificiais com sangue de caprinos, como
descrito no item 3.4.4.5. Não foi possível calcular o limite de detecção em
amostras de material purulento devido à dificuldade em se conseguir pus de
animais infectados com outro patógeno que não seja C. pseudotuberculosis. As
reações de mPCR foram realizadas com dois sistemas de amplificação diferentes:
(i) o sistema AccuPrime™ Taq DNA Polymerase, e (ii) o sistema Eppendorf®
MasterMix (2.5X) (Tab. 4). Esse último sistema possui acentuadores de PCR que,
teoricamente, são responsáveis por melhorar o rendimento da reação na presença
de inibidores tais como componentes do sangue. A Figura 7 mostra os resultados
obtidos com os dois sistemas utilizados.
Como pode ser observado na Figura 7A, foi possível detectar C.
pseudotuberculosis numa mistura artificial utilizando o sistema AccuPrime™ até
uma concentração média dessa bactéria equivalente a 4,5 X 103 UFC. Já com o
sistema Eppendorf® MasterMix, não foi possível detectar o produto amplificado
equivalente ao 16S rDNA de C. pseudotuberculosis nem na reação contendo 106
UFC dessa bactéria (Figura 7B). Porém, como já discutido no item 4.1., o limite de
detecção de 103 UFC pode estar subestimado, uma vez que C.
pseudotuberculosis tende a formar agregados em cultura, o que dificulta a
contagem de células viáveis (Jolly, 1965; Harrington e cols., 2005). Isso ajuda a
explicar a inabilidade do ensaio de mPCR para detectar esta bactéria em amostras
de sangue de animais naturalmente infectados (item 4.1). Provavelmente, C.
pseudotuberculosis é encontrada no sangue destes animais em concentrações
muito menores do que as observadas para o limite de detecção.
Figura 7. Limite de detecção da mPCR em amostras clínicas utilizando dois
sistemas de amplificação diferentes. PM: padrão de peso molecular 1 Kb Plus
DNA Ladder (Invitrogen). (A) Reações de mPCR com o sistema AccuPrime™,
utilizando DNAs extraídos das misturas artificiais de sangue de caprino com
concentrações de C. pseudotuberculosis variando de 106 até 101 UFC. (B)
Reações com o sistema Eppendorf® MasterMix, de misturas artificiais contendo C.
pseudotuberculosis variando de 106 até 103 UFC.
4.2.7. DETECÇÃO DE C. pseudotuberculosis EM AMOSTRAS DE SORO
A idéia de detectar C. pseudotuberculosis diretamente no soro de animais
infectados surgiu a partir da observação de trabalhos recentes mostrando que a
utilização dessa amostra clínica em PCR é mais viável que o uso de amostras de
sangue total (Bougnoux e cols., 1999; Elfaki e cols., 2005). Tal estratégia seria
Taq AccuPrimeTM
Eppendorf® MasterMix
A B
PM 106 105 104 103 102 101 PM 106 105 104 103
16S rDNA
rpoB 12S rDNA
pld
16S rDNA
rpoB 12S rDNA
pld
diretamente aplicável na detecção de animais com infecções sub-clínicas
aparentemente sadios ou em casos de linfadenite caseosa visceral.
DNA foi extraído de amostras de soro de animais com linfadenite caseosa
(n = 9) e de animais que não apresentavam sintomas clínicos da doença (n = 5)
(vide item 3.4.2.2.4). Esses últimos animais pertenciam a rebanhos sem relatos de
infecção por C. pseudotuberculosis. Todas as amostras foram testadas em
reações de PCR utilizando os três pares de iniciadores específicos de C.
pseudotuberculosis, separadamente.
Nenhuma amostra rendeu amplificação dos genes 16S rRNA e rpoB,
embora o controle de amplificação (12S rDNA) tenha sido detectado em todas as
reações (Figura 8). Apresentamos somente os dados com o gene 16S rRNA
(figura 8).
Por outro lado, o gene pld de C. pseudotuberculosis foi detectado em todas
as amostras utilizadas, inclusive nas provenientes de animais aparentemente não
infectados (Figura 9). Em reações multiplex os fragmentos menores podem ser
mais facilmente detectados devido à competição por reagentes ou em razão da
degradação do DNA molde (Edwards & Gibbs, 1995; Yang & Rothman, 2004).
Três hipóteses foram propostas para explicar a amplificação do gene pld
em amostras de animais aparentemente sadios: (i) ocorreu contaminação das
amostras negativas com produtos de amplificações anteriores; (ii) por ser
altamente sensível, a reação de PCR rendeu resultados falso-positivos; ou (iii) os
animais dos quais as amostras foram coletadas eram portadores de infecções
sub-clínicas.
Figura 8. Reações de PCR para amplificação do 16S rDNA de C.
pseudotuberculosis e do controle positivo de amplificação 12S rDNA, em 8
amostras de soro de animais portadores de linfadenite caseosa. PM: padrão
de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas ímpares:
amplificações utilizando os iniciadores para o gene 16S rRNA. Canaletas pares:
amplificações utilizando os iniciadores para o gene 12S rRNA.
Figura 9. Amplificação do gene pld a partir de amostras de soro. PM: padrão
de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas 1-5: reações
com amostras de soro de animais que não apresentavam sinais clínicos de
linfadenite caseosa. Canaletas 6 e 7: reações com soro de animais infectados.
500 pb
300 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
12S rDNA (274 pb)
850 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7
pld (203 pb)
Para testar a primeira hipótese, novas extrações de DNA foram feitas para
todas as amostras testadas, dessa vez em laboratórios diferentes. As reações de
PCR foram repetidas e novamente renderam resultados positivos. Controles
negativos de reação (sem adição de DNA molde), foram sistematicamente
realizados. Estas medidas em conjunto descartaram a possibilidade de
contaminação das reações.
Para testar as duas outras possibilidades, novas amostras estão sendo
coletadas de outros animais aparentemente saudáveis na EMBRAPA Caprinos.
Será feito um acompanhamento destes animais até o momento do abate, a fim de
detectar qualquer sinal clínico de linfadenite caseosa que possa corresponder com
um resultado positivo na reação de PCR.
4.2.8. PERFIL ELETROFORÉTICO DAS DIGESTÕES ENZIMÁTICAS
DOS PRODUTOS DA MPCR
Devido à alta similaridade genética entre C. pseudotuberculosis e C.
ulcerans (Riegel e cols., 1995; Çetinkaya e cols., 2002; Khamis e cols., 2004),
inicialmente foi avaliada a possibilidade de diferenciar estas duas bactérias
através de digestão dos produtos amplificados pela mPCR. Para tal, nestas
reações foi utilizado o iniciador MPLD2 (5’-ATCAGCGGTGATTGTCTTCC-3’) ao
invés de MPLD2.1 (Tab. 3). Este iniciador permite que o gene pld de C. ulcerans
também seja amplificado (Figura 10). As enzimas Cla I e Bgl I foram selecionadas
após análise de restrição in silico das seqüências parciais dos genes 16S rRNA,
rpoB e pld.
Figura 10. Digestão enzimática das reações de mPCR com DNAs de C.
ulcerans e C. pseudotuberculosis. PM: padrão de peso molecular GeneRuler
DNA Ladder Mix (Fermentas). (A) Digestões com a enzima Cla I. Canaletas 1-4:
linhagens de C. ulcerans. Canaletas 5-8: linhagens de C. pseudotuberculosis. (B)
Digestões com a enzima Bgl I. Canaletas 1-4: linhagens de C. ulcerans. Canaletas
5-8: linhagens de C. pseudotuberculosis. (Veja Tabela 1 para as linhagens).
Como pode ser visto na Figura 10, foi possível digerir os produtos
amplificados da mPCR sem que um passo de precipitação anterior fosse
realizado. Nenhuma das quatro linhagens de C. pseudotuberculosis rendeu
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8 PM
A
B
816 pb
203 pb
16S rDNA
rpoB
pld
16S rDNA
rpoB
pld
446 pb
275 pb 203 pb
816 pb
381 pb 446 pb
produtos de digestão com as enzimas testadas (Figura 10). O gene rpoB de todas
as linhagens de C. ulcerans avaliadas foi digerido pela enzima Cla I, gerando dois
produtos: 381 pb (Figura 10A) e 65 pb (não visível). Quando os produtos de
mPCR das mesmas linhagens foram digeridos com a enzima Bgl I, foram gerados
produtos digeridos novamente do gene rpoB, nos tamanhos de 275 pb e 171 pb
(Figura 10B). Uma das linhagens de C. ulcerans testada não foi digerida pela
enzima Bgl I, indicando a existência de polimorfismo do gene rpoB nessa espécie.
Em conjunto, estes resultados indicam que é possível detectar
polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) a partir da
digestão direta dos produtos da mPCR, e portanto esta estratégia pode ser
aplicada para avaliar variabilidade genética de isolados de C. ulcerans ou C.
pseudotuberculosis. No entanto, outras enzimas de restrição devem ser testadas
para essa última espécie. As figuras 11, 12 e 13 apresentam as enzimas de
restrição que podem ser utilizadas para avaliar possíveis polimorfismos das
regiões amplificadas pela mPCR nos genes 16S rRNA, rpoB e pld, entre isolados
de C. pseudotuberculosis. Uma coleção de isolados dessa bactéria, provenientes
de diferentes regiões do Brasil, já está sendo criada com este objetivo.
Fig. 11 (continua)
Figura 11. Mapa de restrição da região amplificada do gene 16S rRNA da C.
pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em:
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da
seqüência amplificada do gene 16S rRNA na linhagem CIP 102968T da C.
pseudotuberculosis biovar ovis.
Figura 12. Mapa de restrição da região amplificada do gene rpoB da C. pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em: http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da seqüência amplificada do gene rpoB na linhagem CIP 102968T da C. pseudotuberculosis biovar ovis.
Figura 13. Mapa de restrição da região amplificada do gene pld da C.
pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em:
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da
seqüência amplificada do gene pld na linhagem CIP 102968T da C.
pseudotuberculosis biovar ovis.
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
5.1. CONCLUSÕES
Nas condições do presente estudo, é possível concluir que:
� Foi possível padronizar uma reação de PCR multiplex para amplificação
simultânea de três genes de C. pseudotuberculosis: 16S rDNA, rpoB e pld.
� O sistema de amplificação AccuPrime™ (Invitrogen) foi o mais eficiente
para utilização no formato multiplex.
� O ensaio de mPCR foi suficientemente específico para diferenciar C.
pseudotuberculosis de bactérias taxonomicamente próximas, incluindo C.
ulcerans.
� O ensaio é altamente sensível, permitindo a detecção de 10 pg de DNA
genômico de C. pseudotuberculosis por reação.
� Utilizando a reação de mPCR, foi possível confirmar a identificação de 40
isolados bacterianos.
� Foi padronizado um protocolo para extração de DNA de C.
pseudotuberculosis de amostras clínicas de animais portadores de
linfadenite caseosa.
� O ensaio de mPCR permitiu a detecção direta de C. pseudotuberculosis em
56 amostras de pus de caprinos e ovinos infectados, com alta sensibilidade
diagnóstica. Não foi possível detectar esta bactéria em amostras de
sangue.
� Através da amplificação individual do gene pld de C. pseudotuberculosis, é
possível detectar essa bactéria em amostras de soro de animais infectados.
5.2. PERSPECTIVAS
O presente trabalho abre perspectivas para:
� Empregar o ensaio de mPCR desenvolvido como ferramenta auxiliar em
estudos de prevalência de linfadenite caseosa em diferentes regiões do
Brasil.
� Avaliar a viabilidade do ensaio de mPCR na prática laboratorial, como
ferramenta para o diagnóstico da linfadenite caseosa.
� Montar uma coleção de isolados de C. pseudotuberculosis de diferentes
regiões do Brasil, para estudos posteriores de variabilidade genética.
� Montar um banco de soros de animais portadores de linfadenite
caseosa.
� Padronizar uma reação de PCR quantitativa em tempo real para
detecção do gene pld de C. pseudotuberculosis diretamente em
amostras de soro de animais infectados.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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