Prof. Dra. Adriana Cibele de Mesquita DantasUERGS – Bento Gonçalves

IntroduçãoOs microorganismos sào pequenos demais a

serem vistos a olho nuPara tanto, utiliza-se um microscópioAlguns microorganismos são mais visíveis que

outros, devido ao tamanho ou a características mais facilmente observáveis

Procedimentos de coloraçao na parede celular, membranas e outras estruturas

Unidades de medidasUnidades de microorganismos:

micrometro (µm) = 0,000001mMicro indica dividida por 1 milhão (10-6)Nanômetro (nm) = 0,000000001 (10-9)

Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)

Ao segurar seu microscopio proximo a fonte Ao segurar seu microscopio proximo a fonte de luz, conseguiu observar organismos de luz, conseguiu observar organismos vivos que eram muito pequenos a serem vivos que eram muito pequenos a serem visto a olho nuvisto a olho nu

A amostra foi colocada na exremidade de A amostra foi colocada na exremidade de um ponto ajustavel e visualizada do outro um ponto ajustavel e visualizada do outro lado atraves de uma lente minuscula, lado atraves de uma lente minuscula, quase esférica.quase esférica.

Maior ampliaçao possivel com esse Maior ampliaçao possivel com esse microscopio foi de 300xmicroscopio foi de 300x

Louis Pasteur (1822 - 1895)Louis Pasteur (1822 - 1895)Louis Pasteur (1822 - 1895)Louis Pasteur (1822 - 1895)

• Inexistência da geração espontâneaInexistência da geração espontânea

• Teoria microbiana das doençasTeoria microbiana das doenças

• Fermentação, decomposição de Fermentação, decomposição de alimentosalimentos

• PasteurizaçãoPasteurização

• Descrição de bactérias associadas às doenças Descrição de bactérias associadas às doenças ((StaphylococcusStaphylococcus, , StreptococcusStreptococcus))

• Vacina anti-rábicaVacina anti-rábica

• Inexistência da geração espontâneaInexistência da geração espontânea

• Teoria microbiana das doençasTeoria microbiana das doenças

• Fermentação, decomposição de Fermentação, decomposição de alimentosalimentos

• PasteurizaçãoPasteurização

• Descrição de bactérias associadas às doenças Descrição de bactérias associadas às doenças ((StaphylococcusStaphylococcus, , StreptococcusStreptococcus))

• Vacina anti-rábicaVacina anti-rábica

Robert Koch (1843 - 1910)Robert Koch (1843 - 1910)Robert Koch (1843 - 1910)Robert Koch (1843 - 1910)

•Estudo do antraz - Postulados de KochEstudo do antraz - Postulados de Koch

•Técnicas para obtenção de culturas purasTécnicas para obtenção de culturas puras

•Placas de PetriPlacas de Petri

•Técnicas de coloraçãoTécnicas de coloração

•Estudos com Estudos com Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

•Descrição de Descrição de Vibrio cholerae,Vibrio cholerae,

TrypanosomaTrypanosoma

•1905 - Prêmio Nobel de Medicina 1905 - Prêmio Nobel de Medicina

•Estudo do antraz - Postulados de KochEstudo do antraz - Postulados de Koch

•Técnicas para obtenção de culturas purasTécnicas para obtenção de culturas puras

•Placas de PetriPlacas de Petri

•Técnicas de coloraçãoTécnicas de coloração

•Estudos com Estudos com Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

•Descrição de Descrição de Vibrio cholerae,Vibrio cholerae,

TrypanosomaTrypanosoma

•1905 - Prêmio Nobel de Medicina 1905 - Prêmio Nobel de Medicina

Processamento dos espécimesProcessamento dos espécimesProcessamento dos espécimesProcessamento dos espécimes

• Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadequalidade

• Coleta - Sem contaminaçãoColeta - Sem contaminação• Transporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, Identificação• Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos

ou Diferenciaisou Diferenciais• Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com

incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose• Exame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horas• Análise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimento• Análise microscópicaAnálise microscópica• Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,

sorológicas, molecularessorológicas, moleculares• Análise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos

• Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e Adequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadequalidade

• Coleta - Sem contaminaçãoColeta - Sem contaminação• Transporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, Identificação• Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos

ou Diferenciaisou Diferenciais• Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com

incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobiose• Exame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horas• Análise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimento• Análise microscópicaAnálise microscópica• Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,

sorológicas, molecularessorológicas, moleculares• Análise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos

Culturas purasDistribuição uniforme de bactérias é essencial para

visualização das colôniasMétodo mais comum; semeadura por esgotamentoCom alça de inoculação estéril mergulhada na cultura

mista, posteriormente cultivada em meio solidoIsoladas com alça obtém-se culturas puras, contendo

somente um tipo de bactérias.

Obtenção de culturas purasOrigem de uma colonia visivel a partir de um

único esporo, de uma celula vegetativa ou de um grupo de microorganismos em grumos ou cadeias

Apresentam caracteristicas morfologicas diferentes, que permitem diferenciar as colonias

Incubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobioseIncubação em condições de anaerobiose

Com o contato com oxigênio pode causar morte das bactérias anaeróbicas

Crescimento com meio cultivo especiais denominados meios redutores

Tioglicolato de sódio, combina-se com o oxigênio do meio e elimina da cultura

Quantificar diretamente o crescimento microbianoDeterminar numero de células

No. Cels/ml em meio liquido ou gr em material solido

Determinar a massa total populacionalFormulas matematicas, ex.:70 cels = 10-6 mLX cels = 1 mLUtiliza-se procedimentos de diluições

Contagem em placaTécnica mais utilizada na determinação da

população bacterianaSomente as células viáveis são contadasEsperar 24 horas para células visíveisSomente em culturas puras, de uma única

bactériaA contagem em placas são chamadas Unidades

formadoras de colônias, unidades são os grumos ou cadeias das bactérias

Diluição em série10 mil bactérias / mL1 mL mostrará 10 mil colônias em placa – difícil

de contarTransfere-se 1 mL para um tubo de 9 mL de

caldo de cultura = 1000 bactérias / mLTransfere-se 1 mL = 100 bactérias / mLTransfere-se 1 mL – 10 bactérias

Metodo de pour plateInoculo = 1,0 mL ou 0,1 mL da diluição

bacteriana colocada diretamente na placa de petri

Adiciona-se inoculo em placa sem meio e após o agar, mistura-se suavemente

Crescimento das colônias na superfície como dentro do meio

Espalhamento na placaAdição de inoculo em placa 0,1 mL contendo

meio solidoEspalhamento por uma alçaCrescimento na superfície do meio

Contagem direta no microscópioVolume conhecido de suspensào é delimitada

em uma área definida em um lâmina ‘Petroff-Hausser’

Contadores eletronicos de celulas = contadores Coulter

Análise microscópicaAnálise microscópicaAnálise microscópicaAnálise microscópica

Coloração de GramColoração de GramColoração de GramColoração de Gram

Coloração álcool-ácido resistente

Se liga apenas a bactérias que possuem material céreo em suas paredes .

Identificação do gênero Mycobacterium:M. tuberculosis, M. leprae e linhagens patogênicas de Nocardia.

O corante carbolfucsina é aplicado aum esfregaço fixado e a lâmina é aquecida por vários minutos

A seguir a lâmina es esfriada, secada e lavada com água.

O esfregaço é tratado com o descolorante álcool –ácido (remove o colorante vermelho das bactérias que nâo são álcool-ácido (al-ác) resistêntes.

Os microorganismos al-ác resistêntes retêm a cor vermelha pois a carbolfucsina é mais solúvel nos lipídeos da parede celular que no al-ác.

Coloração de Ziehl-NielsenColoração de Ziehl-NielsenColoração de Ziehl-NielsenColoração de Ziehl-Nielsen

Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa (presença de cápsula), coloração de flagelos, coloração de endósporos.(presença de cápsula), coloração de flagelos, coloração de endósporos.

Coloração NegativaColoração Negativa: Permite demonstrar a presencia de cápsula (revestimento gelatinoso). Mistura-se as bactérias com tinta nanquim ou nigrosina para criar um fundo escuro e cora-se as bactérias com coloração simples com safranina.

Coloração de EndósporosColoração de Endósporos (Técnica de Schaeffer-Fulton): Utiliza-se verde malaquita para a coloração primaria.

A safranina utiliza-se como contracorante para corar as poções da cálula que não os endósporos.

Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa (presença de cápsula), coloração de flagelos.(presença de cápsula), coloração de flagelos.Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa Outras técnicas de coloração: Coloração Negativa (presença de cápsula), coloração de flagelos.(presença de cápsula), coloração de flagelos.

Colorante: Nigrosina

Colorante: Carbolfucsina:Aumentar diâmetro dos falgelos.

Difusão em ágar – Difusão em ágar – Método de Kirby & Método de Kirby & BauerBauer

Difusão em ágar – Difusão em ágar – Método de Kirby & Método de Kirby & BauerBauer

Microdiluições: Em placas ElisaMicrodiluições: Em placas ElisaMicrodiluições: Em placas ElisaMicrodiluições: Em placas Elisa

“ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay)Se baseia reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações

enzimáticas.A enzima mais comumente utilizada nestas provas é a peroxidase, que catalisa

a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2 ) em H2O mais O2 .Existem vários modelos de testes de ELISA; Forma mais simples, chamada ELISA indireto, um antígeno aderido a um

suporte sólido (placa de ELISA) é preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antígeno.

Se houver anticorpos no soro em teste ocorrerá a formação da ligação antígeno-anticorpo, que posteriormente é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual é ligada à peroxidase.

Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto é, H 2 O 2 dissolvida em uma substancia química que dá uma

reação colorida quando H 2 O 2 é desdobrada). Os orifícios onde ocorreu a reação antígeno-anticorpo apresentam uma

coloração (variável dependendo do substrato).

Outro método é o chamado ELISA de bloqueio ou competição, em que apresença de anticorpos em determinado soro é revelada pela competição com um anticorpo específico (mono ou policlonal) dirigido contra o antígeno.

Igualmente, o resultado é dado pela adição de um conjugado, porém a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia anticorpos.

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.

O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).

A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro.

Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.

Fosfatase alcalinaPeroxidase

B-galactosidase

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

DIRETO OU SANDUÍCHE

INDIRETO PLACA UTILIZADA

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

ELISA Competitivo

Afinidade = Forças de atração e de repulsão

Ab

Ag

Alta afinidade

Ab

Ag

Baixa Afinidade

AFINIDADE DE INTERAÇÃO• Força da interação entre um único epitopoantigênico e um único sítio de combinação com

o antígeno

[Ag] + [Ac ] [Ag-Ac]

KA= [Ag-Ac] ([Ag] + [Ac])

KA

KA= Constante intrínseca de associação

Reatividade Cruzada

• Quando os antígenos são estruturalmenterelacionados podendo ocorrer a reatividade de um anticorpo com outro epitopo antigênico.

Anti-A Ab

Ag A

Anti-A Ab

Ag B

Epitopo compartilhado

Anti-A Ab

Ag C

Epitopo similar

Reações Cruzadas

FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES FORÇAS QUE ATUAM NAS INTERAÇÕES ANTÍGENO/ANTICORPOANTÍGENO/ANTICORPO

Atua em moléculas não polares facilitando a aproximação, os choques moleculares e as ligações.

Moléculas que apresentam grupos laterais iônicos de cargas opostas que se atraem fortalecendo a interação Ag-Ac.

Forças fracas que ocorrem devido à proximidade física entre as moléculas.

A mais fraca das ligações. Ocorrem entre o núcleo de um átomo e a nuvem de elétrons de outro formando dipolos que se atraem.

Avidez• São as forças totais de interação entre um

antígeno com o anticorpo

Keq = 104

Afinidade

106

Avidez

1010

Avidez

RESPOSTA DE ANTICORPOS EspecificidadeEspecificidadeHabilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. QuantidadeQuantidadeN° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. IsotipoIsotipoDetermina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. AfinidadeAfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez:Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

INTERAÇÕES Reações reversíveisReações reversíveis.

Ligações não covalentes:Ligações não covalentes:-Pontes de hidrogênio-Interações hidrofóbicas-Interações de Van der Waals-Ligações iônicas

MÉTODOS

1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blotting

MÉTODOS

PRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - ImunoeletroforeseAGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de CoombsIMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting

APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

- - Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO

Precipitação:Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.

Aglutinação:Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.

As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃOInteração entre Ac e Ag solúvel Ac precisa ser bivalenteAg precisa ser bi ou polivalenteA reação pode ser afetada pelo n° de sítios de

ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADPRECIPITADOO

É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe

abaixo:

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalência

Zona de excesso de antígeno

+ - -+- -

Anticorpo livre

Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado

Quantidade de antígeno adicionado

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

Imunodifusão Dupla:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

IMUNODIFUSÃO DUPLA

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

46

Ac

Ag Ag

Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose

As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:

Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.

O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Poços onde são colocados padrões e amostras a

serem dosados Agarose contendo anticorposanti-IgG humana

Halo de precipitação IgG – anti-IgG

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.

Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

Ag e Ac formam arcos de precipitação.

IMUNOELETROFORESE

48

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃOAc + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa

aglutinação (semi-quantitativo)Pó-zona: excesso de AcPotencial Zeta: alguns Ag podem apresentar

carga elétrica (repulsão)Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex

50

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

51

3) Controle negativo:

4) Mistura-se:

AGLUTINAÇÃO DIRETA

52

5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

negativo positivo

AGLUTINAÇÃO DIRETA

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.Aglutinação

Positiva

Negativa

Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

55

Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

+Soro anti - hCGUrina

São incubados e colocados numa placa

Adicionam-sePartículas

revestidas com hCG

Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial

Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

IMUNOENSAIOS

Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)

Tipos:- RIA- ELISA- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO- WESTERN BLOTTING

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)

Princípio da técnica:

Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.

Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.

A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.

Microscópio de fluorescência com epiluminação

luz UV atinge o ma- terial examinado

fluorescência emitida chega ao observador

TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

IFA direta:Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas

fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

IFA indireta:Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a

Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.

É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade

(fluorescência é mais intensa) e especificidade.

APLICAÇÃO DA TÉCNICA

IMAGENS

CITOMETRIA DE FLUXO Ferramenta que detecta e quantifica células individuais

passando em uma corrente através de um feixe de Laser.Separa as células por fluorescência ativada.Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo

diferente.É um teste qualitativo e quantitativo.

APLICAÇÕESTipo de linfócitos;Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares;HIV

RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações:

I125: emite raios gama H3: raios beta

Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)

Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações:

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,

proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

Metodologias que utilizam reagentes não marcados:

•Precipitação

•Aglutinação

•Hemólise (Fixação de Complemento)

Metodologias que utilizam reagentes marcados

•Radioimunoensaios

•ELISA

•Imunofluorescência

•Western Blotting

•Citometria de Fluxo

Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente formando uma rede estável.

Excesso de antígeno: Os complexos podem ser dissolvidos quando há excesso de Ag pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados diminuindo a formação de complexos insolúveis.

Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos pois todo o Ag está precipitado e fica Ac livre no sobrenadante.

Pró-Zona

Imunodifusão radial (Mancini)

InterpretaçãoDiâmetro do anel é

proporcional à concentração do Ag

QuantitativoNíveis de Ig

• Método– Anticorpo no gel– Antígeno no poço

Ag Concentração

Dia

mete

r2

AgAgAgAg

Ac no gel

Imunoeletroforese/Precipitação• Método

– Antígenos são separados por eletroforese

• Interpretação– Arco de precipitina representa a interação Ag-AC

Ag-+

Ag

Ab

Ag

Ab

– Anticorpo é colocado num corte no ágar

Imunoeletroforese/Precipitação

WESTERN BLOTTINGEletroforese de

proteínas.Identifica

antígenos ou anticorpos.

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

CaracterizaçCaracterização sorológicaão sorológica

Atividades Atividades desempenhadasdesempenhadaspelo Microbiologista pelo Microbiologista ClClínicoínico

Atividades Atividades desempenhadasdesempenhadaspelo Microbiologista pelo Microbiologista ClClínicoínico

Processamento dos espProcessamento dos espécimesécimesProcessamento dos espProcessamento dos espécimesécimes

AdequaçAdequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeão da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeColeta - Sem contaminaçColeta - Sem contaminaçãoãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoInoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou

DiferenciaisDiferenciaisIsolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com

incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseExame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horasAnálise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimentoAnálise microscópicaAnálise microscópicaCaracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,

sorológicas, molecularessorológicas, molecularesAnálise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos

AdequaçAdequação da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeão da amostra - sítio de coleta, quantidade e qualidadeColeta - Sem contaminaçColeta - Sem contaminaçãoãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoTransporte - Acondicionamento, IdentificaçãoInoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou Inoculação em meios de cultura - Enriquecimento, Seletivos ou

DiferenciaisDiferenciaisIsolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com Isolamento do patógeno - Semeadura por esgotamento, com

incubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseincubação a 35ºC, em aerobiose ou anaerobioseExame inicial após 24 horasExame inicial após 24 horasAnálise macroscópica do crescimentoAnálise macroscópica do crescimentoAnálise microscópicaAnálise microscópicaCaracterização do microrganismo - análises bioquímicas, Caracterização do microrganismo - análises bioquímicas,

sorológicas, molecularessorológicas, molecularesAnálise do perfil de resistência a antimicrobianosAnálise do perfil de resistência a antimicrobianos

Semeadura por esgotamentoSemeadura por esgotamentoSemeadura por esgotamentoSemeadura por esgotamento

Meios ricos, seletivos, diferenciaisMeios ricos, seletivos, diferenciaisMeios ricos, seletivos, diferenciaisMeios ricos, seletivos, diferenciais

IncubaçIncubação em condições de anaerobioseão em condições de anaerobioseIncubaçIncubação em condições de anaerobioseão em condições de anaerobiose

AnAnálise macroscópica do crescimentoálise macroscópica do crescimentoAnAnálise macroscópica do crescimentoálise macroscópica do crescimento

AnAnálise microscópicaálise microscópicaAnAnálise microscópicaálise microscópica

ColoraçColoração de Gramão de GramColoraçColoração de Gramão de Gram

ColoraçColoração de Ziehl-Nielsenão de Ziehl-NielsenColoraçColoração de Ziehl-Nielsenão de Ziehl-Nielsen

Outras tOutras técnicas de coloraçãoécnicas de coloraçãoOutras tOutras técnicas de coloraçãoécnicas de coloração

CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica

CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica CaracterizaçCaracterização bioquímica ão bioquímica

DifusDifusão em ágar - ão em ágar - Kirby & BauerKirby & BauerDifusDifusão em ágar - ão em ágar - Kirby & BauerKirby & Bauer

MacrodiluiçMacrodiluiçõesõesMacrodiluiçMacrodiluiçõesões

MicrodiluiçMicrodiluiçõesõesMicrodiluiçMicrodiluiçõesões

ELISAELISAELISAELISA

Western blotWestern blotWestern blotWestern blot

AnAnálises molecularesálises molecularesAnAnálises molecularesálises molecularesPCRPCRPCRPCR

GeometricGeometric AmplificationAmplification

GeometricGeometric AmplificationAmplification

22002200

22112211

22222222

22nn22nn

11stst cycle cycle11stst cycle cycle

22ndnd cycle cycle22ndnd cycle cycle

nnthth cycle cyclennthth cycle cycle

ELISAELISA

Western blotWestern blotWestern blotWestern blot

Análises molecularesAnálises molecularesAnálises molecularesAnálises molecularesPCRPCRPCRPCR

GeometricGeometric AmplificationAmplification

GeometricGeometric AmplificationAmplification

22002200

22112211

22222222

22nn22nn

11stst cycle cycle11stst cycle cycle

22ndnd cycle cycle22ndnd cycle cycle

nnthth cycle cyclennthth cycle cycle

Enxergando os microrganismos:Microscópio

Ampliação: jogo de lentes, campo magnético

Resolução: depende do comprimento de onda utilizado para enxergar

Há dois tipos:Óptico:

Fase, campo escuro, fluorescênciaJogo de lentes (20-2000x)Luz visível (300-700nm)

Eletrônico:Transmissão, varreduraCampo magnético (até 40000x)Feixe de elétrons

Figura microscópio

Figura resolução

www.bmb.psu.edu/courses/ micro107/microscopy/

Esterilização de meios e equipamentos

Escolha entre esterilizar (morte de microrganismos vegetativos e esporos)

UV Vapor úmido (mínimo 20 minutos – 120 °C ) Vapor seco (acima de 150 °C ) O aumento da temperatura e do tempo aumenta a perda de nutrientes

(vitaminas) Melhor aumentar a temperatura e diminuir o tempo (UHT)

Pasteurização (morte de patogênicos) 62 °C em 30 minutos, resfriamento brando

Tindalização (70-100 °C ) 1 h, após 24 h repete Desinfecção (desinfetantes, antissépticos) Agentes quimioterápicos (Sulfa, Cloranfenicol, antibióticos) Filtro de lã de vidro