Seminários da Disciplina Ensaios Pré-clinicos

Professor Carlos Tagliati

Cristiano Cota Bandeira

Ensaios in vitro e in vivo Para Avaliação Da Atividade De Drogas Contra Leishmania spp.

Universidade Federal De Minas Gerais - UFMGFaculdade de Farmácia

Departamento de Análises Clínicas e ToxicológicasMestrado em Inovação Biofarmacêutica

SUMÁRIO

L.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

• Artigo 01: Ensaios in vitro realizados em Leishmanias ssp.Artigo 02: Ensaio in vivo, realizado com pacientes portadores de HIV e Leishmaniose Visceral

ARTIGO ORIGINAL 1

L.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Introdução

• As Leishmanioses são doenças parasitárias, com uma vasta gama de sintomas clínicos:

• Forma cutânea , cutâneo-mucosa, mucosa.(Leishmaniose Tegumentar)

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• Forma visceral (Leishmaniose Visceral)

(Leishmaniose Tegumentar)

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(Leishmaniose Visceral)

Classificação Clínica das Leishmanioses

Fonte: Ana Rabello Maio/2007

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Dados Epidemiológicos

A leishmaniose tegumentar constitui um problema de saúde pública em 88 países;

12 milhões de pessoas infectadas (1 a 1,5 milhões de casos/ano);

90% dos casos: Brasil, Peru, Arábia Saudita, Afeganistão, Irã e Síria.

http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/index2.html

Gontijo & Carvalho 2003, WHO 2007, González 2009

WHO 2010

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Dados Epidemiológicos

WHO 2010:http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_949_eng.pdf

Flebotomíneo

• Elas são causadas por diferentes espécies de protozoários pertencentes ao gênero Leishmania transmitidos ao homem pela picada de uma pequeno inseto vetor de 2 a 3 mm de comprimento.

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Fonte:Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana / Ministério da Saúde

Ciclo do ParasitoL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Impacto social

• Por muitos anos, o impacto na saúde pública de leishmaniose tem sido subestimada.

• Falta de consciência dos seus efeitos graves sobre a saúde.

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1,5 e 2.000.000 novos casos ocorridos anualmente, apenas 600 000 são oficialmente declarados

Impacto social• Uma vez que as vacinas contra a leishmaniose

ainda estão em desenvolvimento

• O controle da doença depende de um diagnóstico imediato e quimioterapia em humanos e animais infectados, bem como em cachorros, que são o principal reservatório da Leishmania infantum nos países do Mediterrâneo.

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DiagnósticoL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

• Hoje, novas ferramentas de diagnóstico sorológico rápido adequado para triagem em larga escala já estão disponíveis.

QuimioterapiaL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

• Estibogluconato de sódio (Pentostam)• Antimoniato de meglumina (Glucantime)• Anfotericina B lipossomal (Ambisome)• Miltefosine (Leishmaniose Visceral)

Quimioterapia – Dados AtuaisL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Fonte: WHO 2010

QuimioterapiaL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

• Fracasso Terapêutico

Mecanismos de Resistência

Justificativa

• Com base nestas considerações, o estudo de novos moléculas para o tratamento da leishmaniose é estritamente necessário.

• Embora os modelos animais estão bem estabelecidos para o teste de drogas, eles não são apropriados para grandes triagens de drogas primárias.

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Justificativa

• Por isso, diversos ensaios para testar novos medicamentos in vitro têm sido desenvolvidos usando dois estágios das Leishmanias:– Promastigotas– Amastigotas

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Fonte:Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana / Ministério da Saúde

Justificativa

• No Presente trabalho, métodos in vitro para avaliar a atividade leishmanicida atividade de drogas contra promastigotas, amastigotas e amastigotas axênicas são revistos.

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Métodos in vitroL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Contagem DiretaMicroscopia

Citometria de FluxoFluorocromos: CFSE, SYBR-14, PI

Promastigotas TransgênicasNucleotídeos Radioativos

Promastigotas

Atividade acido fosfatase Alamar Blue

MTTColorimétrico

Métodos in vitroL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Contagem DiretaMicroscopia

Citometria de FluxoFluorocromos: BCECF-Am, SYTO 17

FITC-mAbs e digitonina

Nucleotídeos Radioativos

Amastigotas Intracelulares

Ensaios de LuminescênciaAmastigotas transgênicas

Métodos in vitroL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Contagem DiretaMicroscopia

Nucleotídeos Radioativos

Amastigotas Axênicas

Ensaios de LuminescênciaAmastigotas transgênicas

MTTColorimétrico

Contagem DiretaL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Fonte:http://2.bp.blogspot.com/microscopio.jpg

Colorimétrico com Alamar BlueL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Azul vermelho

Células Vivas

Atividade da ácido fosfatase L.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Culturas de Promastigotas

Incubação com variasDiluições das

drogas

Células lisadas

Medição da atividade da ácido fosfatasePela adição de fosfato de p-nitrofenila

Leitura 405nm

Ensaio MTT L.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Placa de 96 poços

24h

50000 cel/poço

cel /poço

Aplicação das drogas 48hAplicação do MTT

4h

Formação do formazan

Leitura da absorvância

570 nm570 nm

Diluição com isopropanol Dodecil sulfato de sódio

Citometria de Fluxo L.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Citometria de Fluxo L.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Promastigotas TransgênicasL.Fumarola et al. /Research in Microbiology 155 (2004) 224-230

Amastigotas Transgênicas

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Nucleotídeos Radioativos

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[3H]-timidina é incorporada ao DNA durante a divisão celular.

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CONCLUSÕES

• A triagem de drogas de diversos patógenos intracelulares in vitro é muito complicada por dificuldades de avaliar o número de patógenos remanescentes após tratamento medicamentoso.

• Para a triagem in vitro de novas farmacos leishmanicidas é necessário que seja um método confiável, reprodutível e simples.

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CONCLUSÕES

• De fato, os ensaios existentes apresentam desvantagens: contagem direta é demorado e difícil de executar, outras técnicas como FACS, e parasitas transgênicos necessitam de ferramentas e experiência específica, além disso, métodos espectrofotométricos validados não são suficientes.

• Os ensaios in vitro realizados com procedimentos padronizados representam a base para posteriores modelos de ensaios com animais, mas são necessários mais estudos para encontrar um método de assegurar resultados confiáveis, com os reagentes que não são tóxicos para culturas celulares e não são perigosos para o pessoal de laboratório.

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CONCLUSÕES

• Novas técnicas moleculares para a detecção e caracterização de genes ou mutações associadas a resistência do parasita são necessárias para melhorar os ensaios in vitro e também identificação e avaliação de novas drogas.

• Direções futuras podem incluir a aplicaçãodessas novas técnicas moleculares assim comtambém em um ambiente clínico.

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ARTIGO ORIGINAL 2

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

Introdução

• A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença comum em áreas endêmicas de pacientes portadores de HIV

• Estima-se que no sul da Europa 2-9% dos pacientes com AIDS irão sofrer casos novos ou reincidentes de LV.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

Introdução

• Tratamento com Sais de antimônio Pentavalentes (Sb5)

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

Antimoniato de meglumina(Glucantime)

Stibogluconato de sódio(Pentostam)

Introdução

• Tratamento com Sais de antimônio Pentavalentes (Sb5)

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

Antimoniato de meglumina(Glucantime)

Stibogluconato de sódio(Pentostam)

Uso de Amfotericina B deoxicolato (alternativo)

Alguns efeitos tóxicos restringem o seu uso

Efeitos equivalentes e melhores que os pentavalentes

IntroduçãoJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

• No entanto, não foi encontrado nenhum registro de avaliação de eficácia e toxicidade de diferentes formulações Anfotericina B lipossomais em pacientes com HIV com LV.

• Novas formulações lipídicas de Anfotericina B tem demonstrado boa eficácia anti-leishmanicida, mostrando menor toxicidade em outros modelos experimentais

Objetivos do EstudoJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

• Determinar e investigar a eficácia e tolerabilidade de duas doses sincronizadas do complexo lipídico de Anfotericina B, comparado com o tratamento de referência (antimoniato de meglumina) em pacientes com HIV durante a primeira fase da LV

Pacientes e MétodosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

• 15 maiores Hospitais da Espanha fizeram parte do estudo.

• O estudo foi autorizado pelo comitê de ética, aprovado pelas autoridades de saúde espanhola.

• Foi conduzido de acordo com o guia de boas práticas clínicas.

• Um termo de consentimento foi assinado por todos os participantes.

Pacientes e MétodosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

Incluídos no estudo• Pacientes HIV que tiveram o primeiro epsódio de LV

durante o período de Agosto de 1997 e Setembro de 1999.

• Homens e Mulheres com idade maiores de18 anos ou mais velhos, incluidos por validação de seu diagnóstico de HIV (confirmado por Western Blot) e um primeiro episódio de LV parasitologicamente confirmado.

• LV foi diagnosticado avaliando os sintomas clínicos e esfregasso com corante GIEMSA positivo ou por culturas de Leishmanias tiradas da medula óssea, baço e fígado

Pacientes e MétodosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

DESENHO DO ESTUDO E PROTOCOLOS• Multicentrico, clínico aberto, cego, randomizado de maneira

central, experimental em paralelo

Grupo 1

PACIENTES (LV e HIV+)

Antimoniato de meglumina(Glucantime 20mg deSb5 /kg

por 28 dias como controle )

Complexo lipídido de Anfotericina Bduas dosagens:

ABLC 3mg/kg (i.v.) por 5 diasABLC 3mg/kg (i.v.) por 10 dias

Grupo 2

PACIENTES (LV e HIV+)

Pacientes e MétodosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

DESENHO DO ESTUDO E PROTOCOLOS• Avaliações iniciais do estudo eram a confirmação do HIV, Sintomas

aparentes de Leishmaniose Visceral e exames físicos• Também foi feito a contagem de Linfócitos T CD4+, hemograma

completo e parametros bioquímicos foram feitos.• Durante o período de tratamento, a evolução clínica foi avaliada

diariamente, e todos os testes sanguíneos e bioquímicos eram feitos duas vezes por semana. Essa evolução foi também acompanhada após 1 e 5 meses de tratamento

• Eletrocardiograma foi feito no início, durante o tratamento, no final e 5 meses depois.

• O nível de toxicidade foi medido usando a escala da Organização Mundial de Saúde (WHO) - Grau 2 ou superior foi classificado como evento adverso.

Pacientes e MétodosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

DESENHO DO ESTUDO E PROTOCOLOS• O primeiro ponto final do estudo era a cura parasitológica ( presença do

parasito Leishmania em esfregaço ou cultura da amostra de biópsia retirada dos orgão-alvo (medula-óssea, fígado e baço) entre 1 a 7 semananas após ter completado a terapia).

• Foi definido como falha terapêutica a presença do parasito em alguma amostra após o completo curso da terapia.

Ensaios Parasitológicos

Pacientes e MétodosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

Análises Estatísticas• 20 pacientes por grupo foram considerados suficientes para

estimar os efeitos da terapia• A proporção de pacientes com sucesso no tratamento foi

comparado entre os grupos de tratamento (Fisher´s Exact Test)

• IC 95% foi estimado usando a distribuição binominal.• Análise de segurança incluiu todos os pacientes que tinham

tomado pelo menos uma dose da droga.

• A proporção de pacientes que mostraram reações adversas foi comparado pelo método de Fisher.

ResultadosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

ResultadosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

ResultadosJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

ConclusãoJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

• Até o momento, não há um consenso geral sobre o tratamento em VL de pacientes HIV na Espanha.

• No entanto, antimoniais pentavalentes permanecem terapia de primeira escolha para os novos casos de LV na maioria dos hospitais Espanhois, porque a anfotericina B lipossomal é cara.

• Se o paciente desenvolve falha de intolerância, toxicidade ou tratamento grave, então anfotericina B lipossomal é administrada. Da mesma forma, anfotericina B lipossomal é a droga preferida em recaídas VL.

ConclusãoJournal of Antimicrobial Chemotherapy (2003) 52, 464–468

• Em Resumo, embora todos os tratamentos – antimôniato de meglumina (28 dias) e Anfotericina B lipossomal (5 ou 10 dias) terem mostrado um resultado inicial de cura, a anfotericina B lipossomal uma taxa menor de efeitos adversos mais graves e não ocorreram óbitos durante o tratamento.

• Acredita-se que a Anfotericina B lipossomais, podem ser uma alternativa ao antimoniato de meglumina na terapia do HV-HIV.

• No entanto, mais ensaios clínicos com doses mais elevadas e estudos de farmacoeconomia são necessários para apoiar essa proposta.

MUITOOBRIGADO