Post on 17-Aug-2020
Criopreservação de embriões
Vicente J.F. Freitas Biotecnologia da Reprodução Animal Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução www.uece.br/lfcr
Aula ministrada por: M.Sc. Ribrio Ivan T. P. Batista
1. PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO
1. Danos causados pela criopreservação
2. Proteção contra danos
2. TÉCNICAS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES
3. FATORES QUE AFETAM O SUCESSO DA TÉCNICA
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos biológicos
(movimentos moleculares, reações químicas e atividades
enzimáticas), as temperaturas inferiores a - 150 °C.
Conceito
– Embrião de camundongo (Whittingham et al., 1972)
– Embrião de bovino (Wilmut e Rowson, 1973)
– Embrião de ovino (Willadsen et al., 1976)
– Embrião de caprino (Bilton e Moore, 1976)
Histórico
1. Otimização das biotecnologias reprodutivas.
2. Conservação de material genético – extinção/produção.
a. Preservação de raças em vias de extinção.
3. Prevenção de perdas de animais vivos durante o
transporte.
4. Adequação a época de parições.
Vantagens
O p r o t o c o l o e m p r e g a d o n a
criopreservação de uma célula deve ser
suficientemente lento para prevenir a
cristal ização da água intracelular e
suficientemente rápido para prevenir a
expos ição das cé lu las a e levadas
concentrações de eletrólitos antes da
congelação.
Princípio da criopreservação
Lesões nas membranas
Danos
Desnaturação proteíca
Danos
Desnaturação do citoesqueleto
Danos
Ø Crioprotetores
ü Proteção celular
ü Reduzem a formação de cristais de gelo
ü Reduzem do ponto crioscópico da água
ü Maior estabilidade a membrana celular
Proteção
¨ Crioprotetores
¨ Substituem e/ou removem a água intracelular
¨ Intracelulares (penetrantes)
¨ Et i lenogl icol , d imet i l sufóx ido, gl icerol ,
propanodiol, butanodiol e metanol
¨ Extracelulares (não penetrantes)
¨ Lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona,
manitol, trealose e albumina sérica bovina
(BSA)
Proteção
¨ Crioprotetores
¨ Moléculas protetoras do citoesqueleto
¨ Citocalasina B
Proteção
� Toxicidade de Crioprotetores
¨ Concentração
¨ Entre 1 e 2 M
¨ Tempo de exposição 10 a 20 min.
¨ Nível de toxicidade
¨ Etilenoglicol
¨ Glicerol
¨ Propilenoglicol
Proteção
¨ Métodos de criopreservação
¨ Congelamento lento
¨ Convencional
¨ One-Step
¨ Vitrificação
¨ OPS
¨ Em grade de microscopia eletrônica de transmissão
¨ Cryollop
¨ Micropipetas de vidro – GMP
¨ Em superfície sólida de vitrificação – SSV
¨ Microgotas
¨ Hemi-palhetas (“Hemi Straw”)
Métodos
São utilizados taxas de resfriamento que permitem a
troca de água intracelular por crioprotetor, sem
grandes efeitos osmóticos ou mudanças na forma
celular, prejudiciais á funcionalidade das células.
Congelação lenta
1. Lavar embriões em PBS com 0,4% de BSA
2. Equilíbrio com 1,5 M de etileno glicol em PBS com 0,4% de BSA
por pelo menos 5’;
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
3. Envase durante o equilíbrio (mínimo de três colunas, separadas por
bolhas de ar; embrião na coluna do meio)
4. Levar palhetas ao congelador de embriões (já estabilizado entre -5
e -7ºC);
5. Deixar por 5 minutos a -5/-7ºC;
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
6. Realizar o seeding;
7. Confirmar formação do gelo nas palhetas;
8. Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
8. Deixar mais 5 min. a -5/-7ºC;
9. Iniciar curva de congelação (-0,3 a -0,6ºC/min);
10. Após atingir 32ºC, mergulhar palheta em N2 liquido (não tocar
palheta com as mãos).
Etapas de congelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
1. Descongelação: 5” no ar e 30” em banho-Maria a 35-37ºC
2. Palheta é montada diretamente no inovulador ;
3. Recomendado não levar mais do que 20’ entre a
descongelação e a inovulação;
4. Não existe avaliação prévia do embrião.
Etapas de descongelação lenta com etilenoglicol
Congelação lenta
Ø Estado líquido estado vítreo (amorfo)
Ø Crioprotetores com alto grau de viscosidade
Ø Crioprotetores: etilenoglicol e DMSO
Ø Alta velocidade na congelação (imersão direta
no N2)
Vitrificação
Vitrificação por OPS (Vajta, 1998).
Ø Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno)
Ø Crioprotetores:
Ø Meios
Ø Solução I (VS1):
Ø TCM Hepes + SFB (20%)
Ø Etilenoglicol (7,5%) e DMSO (7,5%)
Ø Solução II (VS2):
Ø TCM Hepes + SFB (20%)
Ø Etilenoglicol (16,5%) e DMSO (16,5%) + sacarose (0,5 M)
Vitrificação
VS1: 7,5% EG + 7,5% DMSO - 1 min
VS2: 16,5% EG + 16,5% DMSO - 20 seg
Vitrificação
Vitrificação
ü Reaquecimento:
ü Meios:
ü SM (sacarose 0,5 M): PBS+5%SFB
ü Poço 1: 800 μl HM, 400 μl SM
ü Poço 2: 800 μl HM, 400 μl SM – 5 min
ü Poço 3: 800 μl HM, 200 μl SM – 5 min
ü Poço 4: 800 μl HM
P-1 P-2
P-3 P-4
Vitrificação
Ø Vitrificação X Congelamento lento
Ø Inconvenientes:
Ø Estresse osmótico
Ø Toxicidade químico de crioprotetor
Ø Vantagens:
Ø Não precisa de um congelador programável
Ø Técnica muito rápida
Vitrificação
q Qualidade do embrião
Fatores influenciando o sucesso da técnica
q Estádio de desenvolvimento embrionário
Fatores influenciando o sucesso da técnica
q Raça – Bos taurus x Bos indicus
q Espécies zebuínas – menor taxa de sobrevivência
embrionária
Fatores influenciando o sucesso da técnica
q Origem do embrião
Fatores influenciando o sucesso da técnica
Tabela 1. Taxa de fertilidade ao parto e sobrevivência embrionária após
inovulação de embriões vitrificados obtidos pela produção in vivo ou in vitro
(COGNIÉ e BARIL, 2002).
Parâmetro observado
Ovinos In vivo In vitro
Caprinos In vivo In vitro
Número de receptoras 33 34 27 20
Parto (%) 70a 15ª 52 45
Sobrevivência embrionária (%) 49b 9b 37 30
Letras diferentes na mesma coluna: P < 0,001
Fatores influenciando o sucesso da técnica
Ø Ambas as técnicas (congelação lenta e vitrificação)
podem ser utilizadas para criopreservação de embriões.
Ø A eficiência das duas técnicas podem variar de acordo
com diversos fatores.
Considerações Finais