Post on 03-Dec-2018
Cntia Alves de Matos Silva
CONTRIBUIO AO ESTUDO QUMICO E
BIOLGICO DE Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.)
Baehni (Sapotaceae)
Universidade de Braslia Braslia
2007
Dissertao apresentada Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia, como requisito parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias da Sade.
Cntia Alves de Matos Silva
CONTRIBUIO AO ESTUDO QUMICO E
BIOLGICO DE Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.)
Baehni (Sapotaceae)
Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-graduao da
Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia, como requisito
parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias da Sade.
Universidade de Braslia Braslia
2007
CURSO DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA SADE FACULDADE DE CINCIAS DA SADE
UNIVERSIDADE DE BRASLIA
Termo de Aprovao
CONTRIBUIO AO ESTUDO QUMICO E BIOLGICO DE
Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni (Sapotaceae)
Cntia Alves de Matos Silva
Dissertao aprovada pelos membros da Banca Examinadora constituda pelos
professores:
___________________________________________________ Dra. Dmaris Silveira (Orientadora)
Faculdade de Cincias da Sade da Universidade de Braslia
___________________________________________________ Dra. Maria Luclia dos Santos
Instituto de Qumica da Universidade de Braslia
___________________________________________________ Dr. Carlos Frederico de Souza Castro
Curso de Qumica da Universidade Catlica de Braslia
___________________________________________________ Dra. Ins Sabioni Resck
Instituto de Qumica da Universidade de Braslia
Braslia, 05 de junho de 2007
.
O trabalho descrito nesta dissertao
foi realizado sob orientao da Professora
Dmaris Silveira.
Dedico este trabalho aos meus
pais, aos meus irmos e ao meu noivo
por tudo o que eles representam na
minha vida.
preciso reviver o sonho e a certeza de que tudo vai mudar. necessrio abrir os olhos e perceber
que as coisas boas esto dentro de ns: onde os sentimentos no precisam de motivos,
nem os desejos de razo. O importante aproveitar o momento e aprender sua durao.
(Gabriel Garcia Mrquez)
AGRADECIMENTOS
Foram longos momentos de desafios e provaes, porm momentos de intenso
aprendizado e de prazer. Pude compartilhar esses momentos com vrias pessoas e para
algumas delas apresento meus agradecimentos e carinho:
Aos meus pais Antnio Alves da Silva e Madalena Alves de Matos Silva, por
todo amor, por todos ensinamentos, por toda dedicao, por estarem comigo sempre,
por serem a minha base e minha fora em todos os momentos da minha vida.
Aos meus irmos, Hugo e Igor pelos momentos de alegria, compreenso, apoio e
por todos os momentos que foram compartilhados em famlia.
Meu agradecimento e respeito Professora Dmaris Silveira, pela excelente
orientao e por todos os momentos de aprendizado que passamos juntas.
Ao meu noivo Wendel Ribeiro, pelo seu companheirismo, por sua amizade
intensa e verdadeira, por todos os momentos, difceis ou no, em que passamos juntos
durante esse desafio e por tudo o que ele representa na minha vida.
Aos meus eternos amigos Karine Figueiredo e Jonatas Gomes, que nunca
mediram esforos para me ajudar, me acolher e me ouvir. Por tudo o que vivemos
juntos desde a graduao at hoje, amigos verdadeiros que quero pra sempre em minha
vida.
Ao meu grande amigo e Professor Carlos Frederico de Souza Castro, que me
ajudou a dar o primeiro passo para que esse sonho virasse realidade. Pela amizade e
compreenso, por seus ensinamentos e por todos os momentos que eu precisei e que ele
sempre me ajudou.
Aos meus amigos que conquistei nessa caminhada: Andressa, Anelise, Letcia,
Ceclia, Jaqueline, Rilva, Jlia, Cristina Simeoni, Tatiane e todos os outros que conheci
durante esse estgio da minha vida e que me deram apoio e alegria.
minha amiga Marta Soares que foi o meu apoio psicolgico nesse momento
to importante da minha vida.
Aos professores da ps-graduao: Luiz Simeoni, Ins Resck, Maria Lucilia
Santos e Damaris Silveira por todo apoio, amizade e dedicao.
Aos funcionrios que de alguma forma contriburam para a realizao deste
projeto, com destaque para Carlos Antnio Ribeiro (tcnico de laboratrio) que em
diversos momentos me socorreu em meus experimentos e para Edigrs Alves
(Secretria da Ps-graduao) pela constante ajuda administrativa.
Aos meus colegas de ps-graduao, Ismael e Ivelone por vrios momentos que
passamos juntos e que compartilhamos aprendizados e experincias.
E principalmente a Deus, por me capacitar, me dar foras, ser o meu refgio, por
me dar sade, pela minha famlia e por ter me possibilitado conhecer pessoas to
incrveis que estaro pra sempre em meu corao.
Muito Obrigado a todos.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Aos meus pais por tudo o que representam na minha vida, minha famlia e ao
meu noivo.
Universidade de Braslia (UnB).
Faculdade de Cincias da Sade e Coordenao da Ps-graduao.
Ao CNPq, FINEP, FINATEC e CAPES pelo suporte financeiro.
professora Maria Luclia dos Santos, Instituto de Qumica (UnB), cuja
orientao foi essencial para a concluso deste trabalho.
professora Ins Sabioni Resck, Instituto de Qumica, pelas anlises
espectromtricas.
Aos Professores Carlos Frederico, Luiz Kanzaki, Luiz Simeoni e aos colegas, Ana
Lcia, Amabel pelos ensaios biolgicos.
Cludia pelas anlises de espectrometria de massas.
Ao professor Jos Elias de Paula, Instituto de biologia, pela coleta e identificao
da espcie.
Aos alunos de PIBIC e estgio: Ricardo de Oliveira, Viviane Lima, Sofia Feres,
Carolina Perdigo, Juliana Camilo e Sthephanie que contriburam diretamente
para a realizao deste trabalho.
Aos Professores Luiz Alberto Simeoni e Francisco de Assis da Rocha Neves, do
Laboratrio de Farmacologia Molecular (FARMOL/UnB), por permitir a
utilizao do laboratrio.
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS i
LISTA DE TABELAS iii
LISTA DE FLUXOGRAMA v
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS vi
RESUMO ix
ABSTRACT x
CAPTULO 1: INTRODUO 1
1.2 Constituintes qumicos e atividades biolgicas do gnero Pouteria 10
1.3 Compostos isoprnicos de esqueleto C30 e seus derivados: ocorrncia e
atividade biolgica 17
RELEVNCIA E OBJETIVOS 28
CAPTULO 2: MATERIAIS E MTODOS 30
2.1 MTODOS GERAIS 31
2.1.1 Cromatografia em Camada Delgada 31
2.1.1.1 Fase estacionria 31
2.1.1.2 Eluentes 31
2.1.1.3 Reveladores 31
2.1.2 Cromatografia em Coluna 33
2.1.2.1 Cromatografia lquida 33
2.1.2.2 Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas 33
2.1.3 Anlises Espectromtricas 34
2.1.3.1 Espectrometria no Infravermelho 34
2.1.3.2 Ressonncia Magntica Nuclear 34
2.1.4 Testes biolgicos 34
2.1.4.1 Toxicidade em larvas de Artemia salina 34
2.1.4.2 Atividade fotoprotetora 35
2.1.4.3 Atividade Antioxidante 35
2.1.4.3.1 Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio 35
2.1.4.3.2 Atividade seqestradora do radical DPPH 36
2.1.4.4 Atividade antimicrobiana 37
2.1.4.4.1 Atividade antibacteriana 37
2.1.4.4.1.1 Mtodo de difuso em gar 37
2.1.4.4.2 Atividade antifngica 38
2.1.4.4.2.1 Mtodo de difuso em gar 38
2.1.4.5 Teste de inibio de proliferao celular 39
2.1.4.5.1 Ensaio de proliferao celular MTT 39
2.2 PARTE EXPERIMENTAL 41
2.2.1 Descrio botnica 41
2.2.2 Obteno do material botnico 41
2.2.3 Obteno dos extratos brutos 41
2.2.3.1 Extrato hexnico (EH) e extrato etanlico (EE) 41
2.2.3.2 Extrato aquoso (EA) 41
2.2.4 Isolamento e identificao de constituintes qumicos das folhas de
Pouteria gardnerii 43
2.2.4.1 Fitoqumica do extrato hexnico de Pouteria gardnerii (EH) 43
2.2.4.1.1 Elaborao da frao hexnica EHH 43
2.2.4.1.1.1 Estudo farmacognstico da frao hexnica EHH 44
2.2.4.1.2 Elaborao da frao Hexano: AcOEt 1:1 (EHHA) 45
2.2.4.1.2.1 Estudo farmacognstico da frao Hex: AcOEt (1:1) EHHA 46
2.2.4.2 Fitoqumica do extrato etanlico (EE) das folhas de P. gardnerii 47
2.2.4.2.1 Elaborao da frao Hex: AcOEt 1:1EEHA 48
2.2.4.2.1.1 Estudo farmacognstico da frao EEHA 49
2.2.4.2.2. Partio trifsica do extrato etanlico (EE) de folhas de Pouteria
gardnerii 49
2.2.4.2.2.1 Elaborao da frao MeCN:CHCl3 (ETMC): Primeira Coluna 50
2.2.4.2.2.2 Elaborao da frao MeCN:CHCl3 (ETMC) : Segunda Coluna 51
CAPTULO 3: RESULTADOS E DISCUSSO 53
3.1 Identificao de substncias presentes no extrato hexnico 54
3.1.1 Mistura de hidrocarbonetos (PG01) 54
3.1.2 Mistura de triterpenos e steres graxos (PG02) 57
3.1.2.1 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 48,89 min 61
3.1.2.2 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 49,19 min 62
3.1.2.3 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 50,26 min 63
3.1.2.4 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 49,36 min 66
3.1.2.5 Anlise do CG-EM no tempo de reteno 50,45 min e 52,77 min 67
3.2 Identificao de substncias presentes no extrato etanlico 75
3.2.1 Mistura de steres de cadeia longa (PG3) 79
3.2.2 acetato de -amirina (PG4) 78
3.2.3 Mistura de lcoois de cadeia longa (PG5) 78
3.2.4 Mistura de triterpenos (PG6) 80
CAPTULO 4: ATIVIDADE BIOLGICA DOS TRITERPENOS
PRESENTES NAS FOLHAS DE Pouteria gardnerii 85
CAPTULO 5: ENSAIOS BIOLGICOS 106
5 Avaliao da atividade biolgica de Pouteria gardnerii 107
5.1 Atividade citotxica 107
5.1.1 Modelo da toxicidade em larvas de Artemia salina 107
5.1.2. Teste de inibio de proliferao celular 109
5.2 Atividade fotoprotetora 111
5.3 Atividade Antioxidante 113
5.3.1 Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio 114
5.3.2 Mtodo do seqestro do radical livre DPPH 115
5.4 Atividade antimicrobiana 116
5.4.1 Mtodo do disco 116
5.4.1.1 Atividade antibacteriana 117
5.4.1.2 Atividade antifngica 118
CAPTULO 6: DADOS ESPECTROMTRICOS 119
6.1 Mistura de hidrocarbonetos (PG1) 120
6.2 Mistura de triterpenos: -e -amirina, acetatos de -amirina e lupela
(PG2) 120
6.3 Mistura de steres de cadeia longa (PG3) 121
6.4 Acetato de -amirina (PG4) 122
6.5 Mistura de lcoois de cadeia longa (PG5) 122
6.6 Mistura de triterpenos: cido urslico e cido oleanlico (PG6) 122
CAPTULO 7: CONCLUSES E PERSPECTIVAS 124
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 127
ANEXO I 159
ANEXO II 161
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.1: Esquema da rota biossinttica para formao dos terpenides 18
FIGURA 1.2: Formao do esqualeno por meio do acoplamento cauda-cauda
de duas unidades de pirofosfato de farnesila 19
FIGURA 1.3: Esquema da ciclizao do esqualeno 21
FIGURA 1.4: Ciclizao do 2,3-xido de esqualeno e alguns exemplos de
triterpenos e saponinas de plantas 23
FIGURA 1.5: Exemplo de ciclizao do ction damarenil para a formao de
alguns triterpenos pentacclicos 24
FIGURA 1.6: Exemplo de ciclizao do ction protosteril para a formao de
alguns triterpenos pentacclicos 24
FIGURA 1.7: Exemplo de ciclizao do esqualeno e do xido de esqualeno
pela enzima tetraimanolsintase 25
FIGURA 1.8: Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni. 27
FIGURA 3.1: Espectro na regio do Infravermelho de PG1 (KBr, cm-1) 55
FIGURA 3.2: Espectro de RMN de 1H de PG1 (300 MHz, CDCl3) 55
FIGURA 3.3: Espectro de RMN de 1H de PG1 Expanso da regio
entre 0,5- 1,0 (300 MHz, CDCl3) 56
FIGURA 3.4: Espectro de RMN de 13C de PG1 ( 75 MHz, CDCl3) 56
FIGURA 3.5: Espectro na regio do Infravermelho de PG2 (KBr, cm-1) 57
FIGURA 3.6: Cromatograma obtido por cromatografia gasosa acoplada
espectrometria de massa de PG02 (IE, 70 eV). 60
FIGURA 3.7: Espectro de massas correspondente (IE, 70eV) ao TR =48,89min. 61
FIGURA 3.8: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =49,19min. 62
FIGURA 3.9: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =50,26min. 63
FIGURA 3.10: Comparao entre os espectros de massas dos derivados de
ursanos e devivados de oleanos. 64
FIGURA 3.11: Fragmentao caracterstica de triterpenos pentacclicos com
dupla ligao na posio C12, via Retro-Diels-Alder (RDA) 65
FIGURA 3.12: Proposta de fragmentao de -amirina (srie ursano) por
mecanismo envolvendo reao Retro-Diels-Alder (RDA) 65
FIGURA 3.13: Proposta de fragmentao de -amirina (srie oleano) por
mecanismo envolvendo reao Retro-Diels-Alder (RDA) 66
FIGURA 3.14: Espectro de massas correspondente (IE, 70eV) ao TR=49,36min 67
FIGURA 3.15: Proposta de fragmentao do germanicol (srie oleano) por
mecanismo envolvendo reao Retro-Diels-Alder (RDA) 67
FIGURA 3.15: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =50,26min 68
FIGURA 3.16: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR =50,45min 68
FIGURA 3.17: Espectro de massa correspondente (IE, 70eV) ao TR=52,77min. 68
FIGURA 3.18: Proposta de fragmentao de acetato de lupela (srie lupano)
por mecanismo envolvendo clivagem sigma e rearranjos 69
FIGURA 3.19: Espectro de RMN de 1H de PG2 Expanso da regio entre
4,0- 5,5 (300 MHz, CDCl3) 71
FIGURA 3.20: Espectro de RMN de 1H de PG2 Expanso da regio entre
0,8- 2,4 (300 MHz, CDCl3) 71
FIGURA 3.21: Espectro de RMN de 13C de PG2 (75 MHz, CDCl3) 72
FIGURA 3.22: Espectro na regio do Infravermelho de PG3 (KBr, cm-1) 76
FIGURA 3.23: Espectro de RMN de 1H de PG3 (300MHz, CDCl3) 76
FIGURA 3.24: Espectro de RMN de 1H de PG3 - Expanso da regio entre
1,0 4,5 (300MHz, CDCl3) 77
FIGURA 3.25: Espectro de RMN de 13C de PG3 ( 75 MHz, CDCl3) 77
FIGURA 3.26.: Espectro na regio do Infravermelho de PG5. (KBr, cm-1) 78
FIGURA 3.27: Espectro de RMN de 1H de PG5 (300 MHZ, CDCl3) 79
FIGURA 3.28: Espectros de RMN de 13C de PG5 ( 75 MHz, CDCl3) 80
FIGURA 3.29: Espectro na regio do Infravermelho de PG6 (KBr, cm-1) 81
FIGURA 3.30: Espectro de RMN de 1H de PG6 (300 MHZ, CDCl3) 82
FIGURA 3.31: Espectro de RMN de 1H de PG6 - Expanso da regio entre
2,4 - 5,6 (300MHz, CDCl3). 82
FIGURA 3.32: Espectros de RMN de 13C de PG6 ( 75MHz, CDCl3) 83
FIGURA 5.1: Efeito dos extratos aquoso e etanlico de folhas de Pouteria
gardnerii clulas CALU 109
FIGURA 5.2: Efeito dos extratos aquoso e etanlico de folhas de Pouteria
gardnerii em clulas A427 110
FIGURA 5.3: Absorbncia mdia na faixa de 290-320 nm (UVB) de PABA
em diferentes concentraes 112
FIGURA 5.4: Comparao entre a absorbncia, na faixa de comprimento de
onda de 200 a 400 nm, dos extratos aquoso e etanlico de folhas de P.
gardinerii e PABA 113
LISTA DE TABELAS
TABELA 2.1: Fraes obtidas na elaborao da frao hexnica (EHH) do
extrato hexnico (EH) das folhas de Pouteria gardnerii 44
TABELA 2.2: Estudo farmacognstico da frao hexnica (EHH). 44
TABELA 2.3: Fraes obtidas na elaborao da frao Hex:AcOEt (EHHA)
do extrato hexnico (EH) das folhas de Pouteria gardnerii 46
TABELA 2.4: Estudo farmacognstico da frao Hex:ACOEt (EHHA) 47
TABELA 2.5: Fraes obtidas na elaborao da frao Hex:AcOEt (EEHA)
do extrato etanlico (EE) das folhas de Pouteria gardnerii 48
TABELA 2.6: Estudo farmacognstico da frao Hex:AcOEt (EEHA) 49
TABELA 2.7: Fraes obtidas na elaborao da frao MeCN:CHCl3
(ETMC1) do extrato etanlico (EE) das folhas Pouteria gardnerii 51
TABELA 2.8: Fraes obtidas na elaborao da frao MeCN:CHCl3
(ETMC2) do extrato etanlico (EE) das folhas Pouteria gardnerii 52
TABELA 3.1: Dados da cromatografia em fase gasosa acoplada
espectrometria de massas de PG2 59
TABELA 3.2: Fragmentaes mais relevantes em alguns triterpenos. 69
TABELA 3.3: Atribuio dos deslocamentos qumicos (, CDCl3, 75MHz)
dos carbonos de PG2, em comparao com dados da literatura (,
CDCl3, 75MHz) (SOLICHIN, 1980; MAHATO & KUNDU, 1994). 73
TABELA 3.4: Atribuio dos deslocamentos qumicos (, CDCl3, 75MHz)
dos carbonos de PG2, em comparao com dados da literatura (,
CDCl3, 75MHz) 74
TABELA 3.5: Deslocamentos qumicos (, CDCl3, 75MHz) dos carbonos de
PG6, em comparao com dados da literatura (, CDCl3, 75MHz) 84
TABELA 4.1: Espcies vegetais dos quais os triterpenos - e - amirina,
acetato de lupela, cidos urslico e oleanlico foram isolados 99
TABELA 5.1 Avaliao citotxica frente s larvas de Artemia salina. 108
TABELA 5.2 Atividade Antioxidante, pelo mtodo de varredura pelo
perxido de hidrognio, dos extratos etanlico e aquoso de Pouteria
gardnerii. 115
TABELA 5.3 Atividade antioxidante pelo mtodo do seqestro do radical
livre DPPH de extratos brutos de Pouteria gardnerii 116
TABELA 5.4: Atividade antibacteriana de folhas de Pouteria gardnerii 117
LISTA DE FLUXOGRAMAS
FLUXOGRAMA 2.1: Obteno do extrato hexnico (EH) e etanlico (EE)
de folhas de Pouteria gardnerii 42
FLUXOGRAMA 2.2: Obteno do extrato aquoso bruto (EA) de folhas de
Pouteria gardnerii 42
FLUXOGRAMA 2.3: Fracionamento do extrato hexnico bruto (EH) das
folhas de Pouteria gardnerii 43
FLUXOGRAMA 2.4: Fracionamento do extrato etanlico bruto (EE) de
folhas de Pouteria gardnerii 47
FLUXOGRAMA 2.5: Partio trifsica do extrato etanlico bruto (EE) de
folhas de Pouteria gardnerii 50
LISTA DE ABREVIATURAS E ACRNIMOS
AAS cido acetil saliclico
AcOEt Acetato de Etila
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
APT Approach Proton Test
ATCC American type culture collection
BHT Butil hidroxi toluento
CC Cromatografia em Coluna
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CCP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa
CE50 Concentrao Efetiva Mediana
CG-EM Cromatografia gasosa acoplado ao espectrmetro de massas
CIM Concentrao Inibitria Mnima
CL 50 Concentrao Letal Mediana
cm Centmetro
d dupleto
dd dupleto duplo
DL 50 Dose mnima letal para 50% dos indivduos
DMSO Dimetilsulfxido
DOU Dirio Oficial da Unio
DPPH 2,2-difenil-1-picrilidrazila
EA Extrato aquoso
EE Extrato Etanlico
EEA Frao acetato de etila do extrato etanlico
EEAM Frao acetato de etilametanol (11) do extrato etanlico
EEH Frao hexnica do extrato etanlico
EEHA Frao hexanoacetato de etila (11) do extrato etanlico
EEM Frao metanlica do extrato etanlico
EH Extrato Hexnico
EHA Frao acetato de etila do extrato hexnico
EHAM Frao acetato de etilametanol (11) do extrato hexnico
EHH Frao hexnica do extrato hexnico
EHHA Frao hexanoacetato de etila (11) do extrato hexnico
EHM Frao metanlica do extrato hexnico
ER Estrogen receptor (Receptor de estrognio)
ERO Espcie Reativa de Oxignio
ETMC Frao acetonitrilaclorofrmio do extrato etanlico
EtOH Etanol
EUA Estados Unidos da Amrica
eV eletronVolt
FDA Food and Drug Administration
FE Fase estacionria
FM Fase Mvel
Glc Glicose
Hex Hexano
HFA Hospital das Foras Armadas
HIV Human immunodeficiency vrus
Hz Hertz
IE Impacto eletrnico
INCA Instituto Nacional do Cncer
i.p Intraperitoneal
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento de 1H
m/z relao massa/carga
MeCN Acetonitrila
MeOH Metanol
MHz MegaHertz
min. minuto
mL Mililitro
mRNA cido ribonuclico mensageiro
MTT brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio]
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
NIST National Institute of Standards and Technology
nm Nanmetro
NSCLC Non-small cell lung cncer/ Clulas de Cncer no Pequenas
OD Densidade ptica
ODC Ornitinadecarboxilase
OMS Organizao Mundial de Sade
P&D Pesquisa e Desenvolvimento
PABA cido p-aminobenzico
PEG Polietilenoglicol
PGC Pouteria gardnerii
PN Produtos Naturais
p.o per oral
ppm Partes por milho
QPN Qumica de Produtos Naturais
RDA Retro-Diels-Alder
RDC Resoluo de Diretoria Colegiada
RMN Ressonncia Magntica Nuclear
RMN 13C Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono
RMN 1H Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio
s Simpleto
TMS Tetrametilsilano
tR Tempo de reteno
UANL Universidad Autonoma de Nueva Leon
UCDB Universidade Catlica Dom Bosco
UFC Unidades formadoras de Colnias
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
USP Universidade de So Paulo
UV Ultravioleta
Deslocamento qumico
s.c. Subcutnea
TPA Tetradecanoilforbol
g Micrograma
RESUMO
A presente dissertao descreve o estudo qumico e a atividade biolgica das
folhas de Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni, espcie pertencente famlia
Sapotaceae, comum no bioma do Cerrado do Distrito Federal e conhecida popularmente
como frutinha-de-veado, cabrito, sapotinha, leiteiro-da-folha-mida, aguai-guac ou
marmelinho.
Do extrato hexnico foram obtidos uma mistura de hidrocarbonetos e uma
mistura de -e -amirina, acetatos de -amirina e de lupela. Do extrato etanlico foram
obtidos: uma mistura de steres de cadeia longa, acetato de -amirina, mistura de
lcoois de cadeia longa e uma mistura dos cidos urslico e oleanlico.
Os extratos e fraes de P. gardnerii foram submetidos a ensaios para avaliar
sua atividade biolgica. Em teste de citotoxicidade, utilizando como modelo a
toxicidade s larvas de Artemia salina, o extrato aquoso (DL50 = 491,64 ppm), a frao
acetato de etila do extrato hexnico (DL50 = 528,28 ppm) e a frao Hex:AcOEt (1:1)
do extrato etanlico (DL50 = 320,48 ppm) apresentaram atividade. Esse resultado foi
corroborado por ensaio, no qual os extratos etanlico e aquoso inibiram a atividade
mitocondrial das clulas de cncer pulmonar no pequenas (NSCLC) da linhagem
CALU (2 mg/mL). O extrato etanlico tambm diminuiu a viabilidade celular de outra
linhagem, a A427.
No teste da atividade fotoprotetora, o extrato etanlico apresentou absoro da
radiao ultravioleta na faixa de UVB e UVA, nas concentraes de 50 mg/mL, 150
mg/mL e 300 mg/mL sendo esta ltima sendo mais evidenciada.
No teste da atividade antioxidante pelo mtodo de varredura do perxido de
hidrognio, o extrato etanlico (CE50 = 44.88 g/mL) e o extrato aquoso (CE50= 28,39
g/mL) apresentaram uma atividade antioxidante superior quela apresentada pelo
controle positivo (cido ascrbico, CE50 = 84,87 g/mL).
Por fim, no teste de atividade antibacteriana, utilizando a tcnica das
microdiluies, o extrato aquoso apresentou atividade contra Staphylococcus aureus.
a primeira vez que essa espcie investigada quanto sua composio
qumica e sua atividade biolgica. E o primeiro relato da presena de cido oleanico
no gnero Pouteria.
Palavras-chave: Pouteria gardnerii; plantas medicinais; Cerrado; triterpenos
ABSTRACT
The present dissertation describes the chemical study and the biological
activities of leaves of Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni, Sapotaceae, usually
found at biome Cerrado around Distrito Federal and popularly called frutinha-de-veado,
cabrito, sapotinha, leiteiro-da-folha-mida, aguai-guac or marmelinho.
From the hexane crude extract were isolated mixtures of hydrocarbons and a
mixture of - and -amyrin, -amyrin acetate and lupeol acetate. From the ethanol
crude extract were obtained a mixture of fatty esters, -amyrin acetate, mixture of
alcohols, as well as a mixture of ursolic and oleanolic acids.
Extracts and fractions of P. gardnerii were evaluated for biological activities.
Crude aqueous extract and fractions of ethanol extract presented cytotoxicity on BST
model. This result was corroborated by another assay in which the ethanol and aqueous
extract inhibited the mitochondrial activity of non-small cell lung cancer (NSCLC) of
the CALU (2mg/mL) cell lines. The ethanol extract also diminished the cell viability of
another cell lines, A427.
On a model assay to evaluate photo protection activity, the ethanol extract
showed dose dependent absorption of the ultraviolet radiation in the UVB and UVA
range with 50 mg/mL, 150 mg/mL and 300 mg/mL concentracions, respectively. In
addition, ethanol extract as well as aqueous extract were able to scavenging hydrogen
peroxide free radicals in a higher degree than ascorbic acid.
Finally, the ethanol extract from leaves of P. gardnerii presented activity against
Staphylococcus aureus.
As far we know it is the first time that the chemistry and biological activity of
Pouteria gardnerii are investigated. In addition, it is the first report about the
occurrence of oleanolic acid in the Pouteria genus.
Keywords: Pouteria gardnerii; medicinal plants; Cerrado; triterpenes
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 1 ______________________________________________________________________
CAPTULO I CAPTULO I CAPTULO I CAPTULO I ---- INTRODUO INTRODUO INTRODUO INTRODUO
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 2 ______________________________________________________________________
1. Introduo
A evoluo do homem, entre outras coisas, tem sido acompanhada por um
valioso conhecimento sobre as plantas. Nos primrdios, as civilizaes transmitiam aos
seus descendentes um discernimento emprico que ia desde as plantas que podiam ser
comestveis at aquelas que apresentavam toxicidade ou mesmo um potencial curativo.
Tal informao no incio foi passada oralmente para as geraes posteriores e, depois
com o surgimento da escrita, foi armazenada em papiros ou escrituras (CUNHA, 2007).
As evidncias da utilizao de plantas medicinais, tanto no Ocidente quanto no
Oriente, remontam a cerca de 60.000 anos.
Um dos primeiros documentos escritos que se tem
informao, refere-se farmacopia do imperador chins Shen
Nung. Escrita por volta dos anos 2730-3000 a.C, que descreve
o uso medicinal de vrias espcies tais como a efedra, (Ephedra
sinica Stapf, ou Ma Huang, pela medicina chinesa), que tem
como composto ativo o alcalide efedrina (1) e conhecida por
promover perda de peso, aumentar energia, tratar problemas
respiratrios e como antitussgeno. (BRIAN et. al., 2003).
O papiro de Ebers, decifrado em 1873 pelo egiptlogo alemo Georg Ebers,
representa o primeiro tratado mdico egpcio conhecido e foi escrito em torno de 1500
a.C.. Parte de seu texto se destina a tratamento de doenas e indicaes sobre os
medicamentos a serem empregados para tal (GOSSEL-WILLIAMS et al., 2006).
Uma das mais importantes contribuies para o conhecimento atual sobre
medicina natural partiu de Hipcrates, que nasceu na ilha de Cs e viveu at a segunda
metade do sculo V a.C. (RIBEIRO, 2003). Ele considerado como o pai da
medicina, graas s suas pesquisas e a uma vasta obra composta por 53 livros que
foram reunidos em Alexandria por Baccheio no sculo III a.C., denominados Corpus
Hippocraticum. Esta obra considerada a mais clara e completa da antiguidade j que
faz referncia no s a plantas medicinais, mas, tambm as bases das cincias mdicas
em sua totalidade (DIAS, 2007).
Por volta de 1800, os qumicos e os mdicos que estudavam plantas medicinais,
cujos recursos experimentais eram extremamente limitados, se dedicaram
especialmente, a isolar e determinar a estrutura de compostos ativos de plantas
OHN
1
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 3 ______________________________________________________________________
conhecidas e experimentadas pelo uso popular ao longo do tempo, e geralmente,
incorporadas nas farmacopias da poca. (YUNES & CALIXTO, 2001).
Apesar disso. alguns frmacos potentes, foram descobertos e muitos deles ainda
so usados na teraputica atual. Apenas para citar alguns exemplos, pode ser
mencionada a Atropa belladona L., espcie conhecida desde o incio do sculo XVI,
mas acredita-se que seu uso com finalidades teraputicas iniciou-se muito antes
(YUNES & CALIXTO, 2001). Um dos seus constituintes ativos foi determinado como
sendo o alcalide atropina (2) isolado pela primeira vez por Mein em 1831. e seus
efeitos foram estudados principalmente durante a segunda metade do sculo XIX
(CANAES, 2006).
N
N
MeO
NH
H
H
HMeO
OMe
H
R R3a OMe emetina3b OH cefaelina
O Hyoscyamus niger L., conhecido popularmente como meimendro, j era
utilizado pelos povos antigos. A espcie era empregada contra dores do trato
gastrintestinal na antiga Babilnia e figura no papiro de Ebers. Foi utilizado na
Inglaterra, na Idade Mdia e depois de um perodo de esquecimento, no sculo XVIII a
espcie foi reintroduzida na London Pharmacopia, de 1809 (SIMES et al., 2000).
A Cephaelis ipecacuanha A. Richard, descrita por G. Le Pois em sua obra De
Medicina Brasiliensis em 1648, foi introduzida na Europa em 1672, sendo que desta
espcie foram isolados os alcalides emetina (3a) e cefaelina (3b) (YUNES &
CALIXTO, 2001). A espcie utilizada desde o sculo XVII como emtico e
expectorante (ATSUKO et al., 1999).
Por fim, pode ser salientado o caso da Salix alba L., cujas cascas foram usadas
durante milnios na Europa, sia e frica para combater dor e febre, mas que somente
em 1763 foi estudada cientificamente pelo reverendo E. Stone, da Inglaterra, que
N
OO
OH
2
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 4 ______________________________________________________________________
publicou seu trabalho de observao clnica, mostrando o efeito analgsico das cascas
dessa planta (YUNES & CALIXTO, 2001).
A substncia ativa e bastante conhecida desta espcie a salicilina (4) isolada
pela primeira em 1829 pelo farmacutico francs H. Leurox. Em 1838 o qumico
italiano Raffaele Piria obteve o cido saliclico (5) semi-sinttico, atravs da hidrlise
oxidativa da salicilina e, posteriormente, Kolbe e Dresden em 1859, sintetizaram os
salicilatos. E em 1897, incentivado pelo caso de seu pai que sofria de reumatismo
crnico e no tolerava o efeito colateral dos salicilatos, o qumico alemo Felix Hofman
concluiu a sntese do cido acetilsalicilico (AAS) (6), um composto de carter menos
cido e que ainda hoje o analgsico mais consumido e vendido no mundo
(MENEGATTI et al., 2001).
Assim, na busca por substncias ativas em plantas, um dos principais aspectos a
serem observados consiste nas informaes oriundas da medicina popular. A seleo de
espcies vegetais para pesquisa, baseada na alegao de um dado efeito teraputico em
humanos, pode se constituir num valioso atalho para a descoberta de novos frmacos, j
que seu uso tradicional pode ser encarado como uma pr-triagem quanto utilidade
teraputica humana, mesmo que posteriormente atravs das pesquisas essa atividade no
seja comprovada (ELIZABETSKY, 2000).
Diversos registros da OMS (Organizao Mundial de Sade) revelam que,
aproximadamente 80% da populao mundial faz uso de algum tipo de planta com
finalidade teraputica. Dentro dessa porcentagem, no mnimo 30% dessas pessoas
utilizam plantas medicinais por indicao mdica (CAMPOS et al., 2005).
A OMS estima que as vendas totais de ervas medicinais alcanaram a cifra de
US$ 400 milhes no Brasil em 2001 (SOYAMA, 2007). Estima-se que 40% dos
medicamentos disponveis na teraputica atual foram desenvolvidos a partir de modelos
ou diretamente de fontes naturais, sendo as plantas responsveis por 25% desse total
(CALIXTO, 2003; SOYAMA, 2007). Somente no perodo entre 1983 e 1994, dos 520
OH
O OOH
OH
OH
OH
(4)
OH
COOH
(5)
O
COOH
O
(6)
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 5 ______________________________________________________________________
novos frmacos aprovados pela agncia americana de controle de medicamentos e
alimentos (FDA), 220 (39%) foram desenvolvidos a partir de produtos naturais
(CRAGG et al., 1997; SHU et al., 1998). E ainda, quando se fala de cncer ou doenas
infecciosas, entre 60% e 75% dos medicamentos disponveis so de origem natural
(NEWMAN et al., 2003)
Porm muito ainda est para ser pesquisado. Das 365.000 espcies catalogadas,
apenas 1.100 foram estudadas em suas propriedades medicinais (FERREIRA, 2006) e o
Brasil, que possui cerca de 30% de toda a flora mundial conhecida, tem pouco mais que
1% dessas estudadas qumica e/ou farmacologicamente. (YUNES & CALIXTO, 2001).
O Brasil poderia contribuir para o desenvolvimento de novos medicamentos
oriundos de espcies dos seus vrios biomas. Porm, entre 2003 e 2004, por exemplo,
foram desmatados 26.130 km2 de floresta na Amaznia Brasileira, que hoje representa
5% do espao terrestre da Amrica Latina (AMAZNIA, 2007). Com isso, vrias
espcies desapareceram sem que o homem tenha sequer sido capaz de conhecer toda a
sua magnificncia, principalmente a relacionada s caractersticas medicinais.
Por outro lado, existem problemas que dificultam o aproveitamento de produtos
naturais para o desenvolvimento de novos medicamentos, como por exemplo, a grande
complexidade das molculas naturais isoladas, que s vezes dificulta sua utilizao
como modelo para sntese; o tempo necessrio para a descoberta de molculas lderes,
que usualmente longo; freqentemente, molculas j conhecidas de pouco interesse,
so isoladas de fontes naturais; e, por fim, a relutncia de muitos qumicos, especialistas
em sntese, em trabalhar com produtos naturais (CALIXTO, 2003).
Alm disso, no Brasil, as pesquisas com plantas ainda esto muito inseridas no
contexto de Universidades e Institutos de Pesquisa. Mesmo assim, j existem vrios
grupos nacionais envolvidos com a busca de princpios bioativos de plantas
(MONTANARI & BOLJANI, 2001).
A pesquisa por novas entidades qumicas bioativas pelos laboratrios de
pesquisa industriais tem adotado novas tcnicas, como o uso da qumica combinatria
para se obter maior nmero de substncias com atividades farmacolgicas em um menor
tempo. Essa tcnica teve seu tempo ureo na indstria farmacutica na dcada de 90
(MULLIN, 2007), quando foram sintetizadas e avaliadas farmacologicamente milhares
de compostos, e alguns estimam que milhes, como uma forma de obteno de novos
frmacos.
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 6 ______________________________________________________________________
A idia de que a avaliao rpida de um grande nmero de candidatos a
frmacos seria mais fcil e mais eficiente que o processo clssico e usualmente
demorado de obteno e teste de compostos um a um envolveu o investimento de
grande capital e de recurso humano especializado. Entretanto, o uso da qumica
combinatria mostrou-se desapontador, pois alm da produo de uma grande
quantidade de fragmentos sem qualquer utilidade, a constatao de que nem sempre tais
compostos projetados eram compatveis com sistemas biolgicos levou a poucos
resultados tangveis (BORMAN, 2006).
Uma estratgia para busca de novos frmacos chamada Diversity-oriented
synthesis DOS foi desenvolvida para tentar resolver o problema da
biocompatibilidade. uma tcnica para criar um banco de compostos de estrutura
semelhante a produtos naturais compartilhado entre diversos centros de pesquisa. Uma
vez identificado o prottipo, este ser melhorado e posteriormente submetido a
ensaios clnicos (BORMAN, 2006) .
A introduo de novas tecnologias tornou a qumica medicinal mais ampla em
sua concepo, ampliando seu carter interdisciplinar (HILEMAN, 2006). Em uma
viso moderna, a qumica medicinal dedica-se compreenso das razes moleculares da
ao dos frmacos, da relao entre estrutura qumica e atividade farmacolgica dos
mesmos, considerando fatores farmacodinmicos e farmacocinticos que se traduzam
em propriedades farmacoterapeuticamente teis e, portanto, representem um novo
composto-prottipo, candidato efetivo a novo frmaco (VIEGAS et al., 2006)
Assim, apesar dos avanos tecnolgicos observados nesse perodo para a
pesquisa de novas entidades qumicas, a quantidade de novos frmacos lanados no
mercado no tem aumentado proporcionalmente. Efetivamente, a indstria farmacutica
que pesquisa novos frmacos afirma que o montante gasto em pesquisa e
desenvolvimento no setor, em 2004, atingiu valores de 33 bilhes de dlares
americanos, representando um crescimento real nos investimentos feitos, ano a ano, no
correspondendo, entretanto, um aumento proporcional nas descobertas inovadoras.
(VIEGAS et al., 2006).
Define-se como fitofrmaco a substncia isolada de extratos de plantas
(FERREIRA, 2006) como a rutina (7) extensamente encontrada na natureza e a
pilocarpina (8), extrada das folhas do jaborandi (Pilocarpus pennatifolius), e utilizada
para o tratamento do glaucoma (SIMES et al., 2000). A ANVISA (Agncia Nacional
de Vigilncia Sanitria), por sua vez, define fitofrmaco como princpio ativo, que
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 7 ______________________________________________________________________
corresponde a uma substncia ou grupo dessas, quimicamente caracterizadas, cuja ao
farmacolgica conhecida e responsvel, total ou parcialmente, pelos efeitos
teraputicos do produto fitoterpico.
E o medicamento fitoterpico, tambm segundo a ANVISA, caracteriza-se pelo
emprego exclusivo de matrias-primas vegetais ativas, cuja eficcia e riscos de seu uso
sejam conhecidos, assim como a reprodutibilidade e constncia de sua qualidade.
O
OH
OH
O
Oram-gli
OH
OH
7
O
NCH3
N
O
8
O desenvolvimento de fitoterpicos inclui vrias etapas e um processo
interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional. As reas de conhecimento
envolvidas vo desde a botnica, a etnobotncia, agronomia, ecologia, qumica,
fitoqumica, farmacologia, toxicologia, biotecnologia at a tecnologia farmacutica
(TOLEDO et al., 2003)
A pesquisa tem incio no levantamento bibliogrfico em literatura cientfica e
catlogos internacionais nas reas especficas do referido conhecimento, seguindo em
paralelo a pesquisa etnobotncia, que pode ser definida como a disciplina que abrange
do estudo e conceituaes desenvolvidas por qualquer sociedade a respeito do mundo
vegetal engloba a maneira como um grupo social classifica as plantas (MACIEL et
al.,2002).
Uma outra abordagem de seleo de uma espcie a ser utilizada como medicinal
a pesquisa quimiotaxonmica, onde o aspecto morfolgico pode revelar a presena de
determinados grupos qumicos que tenham atividade farmacolgica (SHORT, 2007).
Por fim, a busca de novas espcies farmacologicamente teis pode se dar de
forma aleatria, onde amostras das espcies presentes em determinada rea geogrfica
so coletadas e avaliadas qumica e biologicamente.
Os estudos fitoqumicos compreendem as etapas de isolamento, elucidao
estrutural e identificao dos constituintes mais importantes da planta, principalmente
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 8 ______________________________________________________________________
de substncias originrias do metabolismo secundrio responsveis, ou no, pela ao
biolgica (MACIEL et al.,2002).
A avaliao da atividade biolgica constitui a prxima etapa para o
desenvolvimento de um medicamento fitoterpico. Essa etapa inclui a avaliao
farmacolgica e toxicolgica da substncia isolada. O conhecimento dos aspectos de
atividade biolgica do vegetal requisito essencial para a transformao da planta
medicinal em produto fitoterpico.
Vrios fatores devem ser considerados por ocasio da seleo do modelo
biolgico adequado ao estudo de uma determinada planta. Alguns desses parmetros
devem ser analisados criteriosamente antes de fazer tal escolha, como por exemplo, a
seletividade e a reprodutibilidade do teste; ou a quantidade de material vegetal
disponvel para a realizao do estudo, que pode ser um fator limitante quando se trata
de compostos puros (YUNES & CALIXTO, 2001). Por exemplo, para serem obtidos 50
mg de um composto puro, encontrado em um percentual de rendimento de 0,001 %,
necessria a utilizao de 5 Kg de planta seca, em mdia; e para a obteno de 1 Kg de
planta seca so necessrios at 10 Kg de planta fresca (GOTTLIEB et al., 1997).
Quanto aos testes biolgicos, a escolha do modelo deve levar em considerao o
alvo a ser atingido no estudo e as informaes etnofarmacolgicas (YUNES &
CALIXTO, 2001).
Os testes clnicos constituem uma das ltimas etapas antes da produo de um
medicamento fitoterpico. Nessa etapa verificada a validade da proposta de ao
farmacolgica em organismos humanos (ELIZABETSKY, 2000).
A ANVISA disponibiliza uma lista com 34 plantas para as quais so
dispensveis comprovaes adicionais de eficcia e segurana, no ato de protocolo do
registro do medicamento fitoterpico, devido existncia de dados clnicos e
etnofarmacolgicos satisfatrios que validam o emprego destas plantas (ANVISA,
2004).
Como exemplo, a espcie Peumus boldus Molina, conhecido popularmente
como boldo, usada no tratamento de distrbios hepticos e gastrointestinais. O
princpio ativo responsvel por essa ao farmacolgica a boldina (9) (FERREIRA,
2006).
O Allium sativum L., mais conhecido como alho e utilizado como tempero na
culinria, tem como princpio ativo a alina (10). Suas aes teraputicas conhecidas
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 9 ______________________________________________________________________
so, coadjuvante no tratamento da hiperlipidemia e hipertenso arterial leve, e
preveno da arteriosclerose (FERREIRA, 2006).
Como um ltimo exemplo, pode ser citado o confrei (Symphytum officinale L.),
cujo princpio ativo, a alantona (11), responsvel pela conhecida ao cicatrizante da
planta (FERREIRA, 2006).
N
OH
OH
MeO
MeO
CH39
O
S
NH2
OH
O
10
N
N
O
ONH
NH2O
11
Dessa forma, a busca de produtos naturais bioativos de origem vegetal ainda se
constitui uma via interessante sob o ponto de vista cientfico, tecnolgico e econmico.
A famlia Sapotaceae possui aproximadamente 75 gneros e 800 espcies.
Alguns gneros conhecidos so: Butyrospermum, Chrysophyllum, Madhuca, Manilkara,
Mimusops, Pouteria (Lucuma) e Sideroxylon (WATSON & DALLWITZ , 1992).
Poucas referncias quanto s atividades farmacolgicas ou aos metablitos
secundrios do gnero Pouteria (Sapotaceae) so encontradas, apesar de vrias espcies
produzirem frutos comestveis, como por exemplo, P. caimito (abiu), P. macrocarpa
(cutito), P. macrophyla (caimo), P. sapota (sapota)
Uma classe de substncias muito comum na famlia Sapotaceae so os
triterpenos para os quais vrias atividades biolgicas so relatadas, tais como
antiinflamatria, anti-helmntica, antitumoral e estrognica, inibio enzimtica (-
glicosidase, transcriptase reversa do HIV). Desta forma, considerando as atividades
biolgicas que espcies do gnero Pouteria presentes no bioma Cerrado podem
apresentar, o estudo dessas espcies torna-se relevante para incremento do arsenal
teraputico.
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 10 ______________________________________________________________________
Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni (FIGURA 1.8, pgina 27) foi
selecionada a partir do projeto Estudo qumico e atividades biolgicas de espcies do
gnero Pouteria, atualmente desenvolvido na Faculdade de Cincias da Sade, por
pesquisadores do grupo Desenvolvimento e Controle de Qualidade de Frmacos e
Medicamentos. Essa espcie conhecida popularmente por frutinha-de-veado, cabrito,
sapotinha, leiteiro-da-folha-mida, aguai-guac ou marmelinho (COLHO, 2006;
MESQUITA et al.,2005; CENTURION et al., 1996). Relatos encontrados na literatura
mostram que a espcie em questo, foi testada apenas contra as formas amastigota do
Trypanosoma cruzi e contra as larvas de Aedes aegypti, porm no apresentou atividade
(COLHO, 2006 e MESQUITA et al.,2005). Entretanto, no foi encontrado relato
quanto sua composio micromolecular.
Como outras espcies do gnero apresentam atividades biolgicas relevantes,
torna-se interessante buscar informaes sobre P. gardnerii.
1.2 Constituintes qumicos e atividades biolgicas do gnero Pouteria
No planalto central brasileiro encontra-se parte do bioma cerrado, considerado o
segundo maior do Brasil, com uma flora vegetal estimada em, aproximadamente, sete
mil espcies (VILA VERDE et al., 2003). A utilizao popular de plantas medicinais
faz parte da tradio e costume das comunidades que vivem nessa regio. No entanto, as
plantas utilizadas na medicina popular pelos habitantes locais no tm ainda despertado
de forma significativa, o interesse da comunidade cientfica, se comparadas com aquelas
das demais regies, o que pode ser observado a partir da falta de dados disponveis
sobre as caractersticas biolgicas de plantas medicinais do Cerrado, que possibilitem a
sua utilizao sustentvel (LOPEZ et al., 2005).
Espcies do gnero Pouteria Sapotaceae, so encontradas nesse bioma e
embora corresponda a 435 ou mais espcies, a informao quanto fitoqumica e
quanto atividade biolgica correspondentes a este txon relativamente limitada
(CHE et al., 1980).
Estudos fitoqumicos realizados com o extrato metanlico das ramas de P. torta
mostraram a presena de triterpenos como acetato de -amirina (12b), acetato de -
amirina (12c), cido betulnico (13) e cido urslico (14) (CHE et al., 1980). Dos
extratos hexnico e diclorometilnico de flores e frutos foram isolados cidos graxos,
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 11 ______________________________________________________________________
poliisoprenides, triglicerdeos, hidrocarbonetos normais e ramificados, esterides e
triterpenos penta- e tetracclicos (DAVID, 1993).
RO
R2R1
R R1 R212a H Me H -amirina12b Ac Me H12c H H Me -amirina 12d Ac H Me
COOH
OH
13
OH
COOH
14
RO
R 15a H lupeol 15b Ac
Ainda do extrato hexnico das folhas desta planta foram isolados
hidrocarbonetos, lcoois de cadeia longa e acetato de lupela (15b), e da frao
acetonitrila:clorofrmio, do extrato etanlico bruto, foram obtidas misturas de
triterpenos contendo - e -friedelinol (16a e 16b) e - e -amirina (12a e 12c), alm
do cido 12,13-dihidropomlico (17) (LOPEZ et al., 2005). E da frao aquosa do
extrato etanlico desta planta foi obtido o flavonide miricitrina (18) (SILVA et al.,
2006).
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 12 ______________________________________________________________________
OH
16a 3 OH -friedelinol 16b 3 OH -friedelinol
OH
COOH
OH
17
OOH
OH O
Oram
OH
OH
OH
18
OH
OH
19
Pouterina, uma protena semelhante lecitina, foi extrada de sementes de P.
torta e apresentou atividade antifngica contra Fusarium oxysporum, Colletotrichum
lindemuthianum e Saccharomyces cerevisiae. Apresentou ainda atividade inseticida
contra larvas de Callosobruchus maculatus F., uma praga de gros. Essa protena
tambm mostrou capacidade de aglutinao de eritrcitos humanos, de coelhos e de
ratos (BOLETI et al., 2007).
A pesquisa fitoqumica do extrato benznico da fruta de Pouteria caimito
revelou a presena de - amirina (12a), lupeol (15a), eritrodiol (19), e o damarendiol II
(20); e das cascas, taraxerol (21a) e seu acetato (21b), taraxenona (22) e -sitosterol
(23) (PELLICCIARI et al., 1972). E do extrato hexnico desta planta foi extrado o
triterpeno pentacclico espinasterol (24) (FRANA et al., 2006), tambm presente nas
folhas de P. venosa (MONTENEGRO et al., 2006).
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 13 ______________________________________________________________________
OH
20
RO
R 21a H taraxasterol 21b Ac
O
22 OH
23
OH24
Do crtex de Pouteria tomentosa (Roxb.) Baehni foi obtido o acetato de -
amirina (12d) (CHE et al., 1980). As folhas de Pouteria amygdalicarpa, P.
campechiana, P. subrotata e P. torta apresentaram compostos cianognicos diversos
(THOMSEN & BRIMER, 1997)
O estudo do leo voltil responsvel pelo aroma dos frutos de P. sapota revelou
a presena de 24 compostos, dos quais benzaldedo (25), hexanal (26) e cido palmtico
(27) esto em maior concentrao (PINO et al, 2006). A amndoa dessa espcie
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 14 ______________________________________________________________________
forneceu cidos graxos dos quais os mais abundantes foram os cidos palmtico (27),
esterico (28), olico (29) e linolico (30) (SOLIS-FUENTES & DURAN-DE-BAZA,
2003).
CHO
25
CHO
26
CH3-(CH2)14-COOH
27
CH3-(CH2)16-COOH
28
CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH
29
CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH
30
A anlise do leo concentrado dos frutos de P. pariry, apresentou como
componente mais abundante o butanoato de metila (31); em P. caimito, cido palmtico
(27), acetato de hexadecila (32), -copaeno, (33) foram os mais abundantes (MAIA et
al., 2003). No leo das folhas de P. splendens foram identificados 34 compostos dos
quais cidos graxos foram os mais abundantes (SOTES et al., 2006).
CH3-(CH2)2COOCH3
31
CH3-COO-(CH2)5CH3
32 33
De Pouteria campechiana, P. sapota e P. viridis foram identificados cido e
miricitrina (18), glico (34), galocatequina (35a), catequina (35b), epicatequina (35c),
galatocatequina (35d), e dihidromiricetina (36), responsveis pela atividade
antioxidante in vitro apresentada por seus extratos (MA et al., 2004;
MAHATTANATAWEE et al., 2006).
COOH
OH OH
OH
34
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 15 ______________________________________________________________________
O
OH
OH
R2
OH
OH
R1
R1 R235a OH -OH galocatequina35b H -OH catequina35c H -OH epicatequina35d H -O-galato
De extratos de Pouteria venosa foram isolados cido urslico (14); taraxerol
(21a) e os cidos mirintico (37a) e 19,23-diidroxiurslico (37b), sendo que esses dois
ltimos foram ativos frente ao radical DPPH. Os extratos clorofrmico das folhas,
diclorometnico da casca do caule e hexano:acetato de etila do caule, apresentaram
resultados positivos em ensaios larvicida e/ou antiradicalar (MONTENEGRO et al.,
2006).
Em estudos preliminares, os extratos de P. torta, P. ramiflora e P. gardnerii
apresentaram atividades de inibio de -amilase em saliva humana (ALBUQUERQUE
et al., 2002). O extrato etanlico de P. ramiflora apresentou atividade antiinflamatria e
antinociceptiva in vivo (NUNES, 2004; FONTES JUNIOR, 2004; CHAGAS et al.,
2003). Pouteria torta e P. ramiflora apresentaram atividade antimicrobiana (ALVES et
al., 2000; RAMALHO et al., 2004).
O extrato bruto etanlico de P. caimito, extratos brutos etanlico e aquoso de P.
torta e o extrato bruto etanlico de P. ramiflora apresentam atividade antioxidante
(CASTRO et al., 2006).
A frao aquosa do extrato etanlico das folhas de P. ramiflora apresentou
toxicidade a larvas de Artemia salina (RAMALHO et al., 2004). Alm disso, o extrato
aquoso bruto de P. torta tambm apresentou toxicidade a larvas de Artemia salina
(LOPEZ, 2005).
Os extratos metanlico, acetnico e aquoso de galhos de P. cambodiana
apresentaram atividade imunomoduladora in vitro. Os extratos etanlico e aquoso
apresentaram atividade antioxidante que parece ser devida presena de cido 3,4-
diidroxibenzico (38) (MANOSROI et al., 2005; MANOSROI et al., 2006)
O
OH
OH
OHOH
OH
OH
O
36
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 16 ______________________________________________________________________
COOH
OH
OH
38
Os extratos hexnico e etanlico de folhas de P. torta e P. ramiflora foram
testados quanto a atividade agonista ou antagonista de receptores nucleares e o extrato
hexnico de Pouteria torta inibiu a ao do estrognio nos seus receptores
(FRANZOTTI et al., 2004). Os extratos hexnico e etanlico de P. torta apresentaram
atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e os extratos hexnico,
etanlico e aquoso desta mesma espcie foram ativos contra Pseudomonas aeruginosa.
Alm disso, o extrato aquoso apresentou atividade contra Escherichia coli (LOPEZ,
2005). Os extratos etanlicos de folhas de P. grandiflora e P. psamophila foram
inativos contra E. coli, S. aureus e Candida albicans. Pouteria grandiflora apresentou
atividade discreta contra Cladosporium sphaerospermum, P. psamophila e C.
cladosporioides (AGRIPINO et al., 2004).
Em estudos preliminares, os extratos aquoso e etanlico de folhas de P. torta, P.
caimito e P. ramiflora apresentaram atividade fotoprotetora contra os raios UVA e UVB
(FALEIROS et al., 2006).
1.3 Compostos isoprnicos de esqueleto C30 e seus derivados: ocorrncia e
atividade biolgica
Os terpenos compem diversas estruturas comumente encontradas na natureza e
so originados da via acetato-malonato, a partir do encadeamento cabea-cauda de
unidades isoprnicas (39) (DEWICK, 2001 e OLIVEIRA et al., 2003).
COOH
R2
R
R1
R3
R R1 R2 R337a -OH -OH OH OH cido mirintico37b -OH H OH OH
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 17 ______________________________________________________________________
39
OPP
40
OPP
41
O isopreno considerado um dos blocos de construo para os isoprenides.
As unidades bioqumicamente ativas do isoprenos so conhecidas como pirosfosfato de
dimetilalila - DMAPP (40) e pirofosfato de isopentenila - IPP (41) (DEWICK, 2001).
Os terpenos apresentam funes variadas nos vegetais e so de acordo com o
nmero de unidades de isopreno (Cn) encadeadas: hemiterpenos (C5), monoterpenos
(C10) sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterpenos (C25) triterpenos (C30) e
tetraterpenos (C40).
Os monoterpenos so constituintes dos leos volteis, atuando na atrao de
polinizadores. Os sesquiterpenos, em geral, apresentam funes protetoras contra
fungos e bactrias, enquanto muitos diterpenides do origem aos hormnios de
crescimento vegetal. Os triterpenides e seus derivados apresentam uma gama de
funes, como de proteo contra herbvoros, alguns so antimitticos e outros atuam
na germinao das sementes e na inibio do crescimento da raiz (OLIVEIRA et al.,
2003).
Alguns derivados C30 so de especial importncia, como por exemplo, o
colesterol (42), os hormnios sexuais estradiol (43) e testosterona (44) as vitaminas A
(45), D (46) e E (47). Biossinteticamente, estes metablitos so formados de uma forma
diferente daquela como cresce a maioria das cadeias isoprenides. Eles derivam da
unio cauda-cauda de duas unidades de pirofosfato de farnesila, formando o esqualeno
(FIGURA 1.2), que foi originalmente isolado do leo do fgado de tubaro (Squalus sp)
(DEWICK, 2001)
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 18 ______________________________________________________________________
FIGURA 1.1. Esquema da rota biossinttica para a formao dos terpenides
(DEWICK, 2001)..
C30
C40
O
OH OH
OH
cido mevalnico
O
OH
OH
OP
5-fosfato-1-desoxi-D-Xilulose
OPPPirofosfato de Isopentenila(IPP) (C5)
OPP Pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) (C5)
Hemiterpenos (C5)
C10 Pirofosfato de geranila
Monoterpenos (C10) Iridides
IPP
IPP
IPP
C25 Pirofosfato de geranilfarnesila
Sesterpenos (C25)
Triterpenos (C30)
Esterides (C18 C30)
Tetraterpenos (C40) Carotenides
C15 Pirofosfato de farnesila
Sesquiterpenos (C15)
x 2
C20 Pirofosfato de geranilgeranila
Diterpenos (C20)
x 2
cido Mevalnico 5-fosfato-1-desoxi-D-xilulose
DMAPP IPP
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 19 ______________________________________________________________________
Esqualeno
FIGURA 1.2: Formao do esqualeno por meio do acoplamento cauda-cauda de
duas unidades de pirofostato de farnesila.
H
H
P PO X - E n z
H H
X - En z
P P O
H PPO
H
Pirofostato de farnesila
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 20 ______________________________________________________________________
OH
42
OH
OH
43
OH
O
44
OH
45
O
OH
4747
Neste grupo esto includos os esterides, que possuem esqueleto C27-C29, no
sendo, portanto verdadeiros triterpenos. No entanto, todos derivam do mesmo precursor
- o esqualeno - que possui 30 tomos de carbono, pelo que se prefere manter esta
classificao. O esqualeno pode adotar vrias conformaes (pseudo-cadeira ou barco),
das quais resultam diferentes estruturas cclicas, o que explica a diversidade de
metablitos conhecidos (FCT/UNL, 2007).
A ciclizao do esqualeno est esquematizada na FIGURA 1.3. Praticamente
todos os triterpenides cclicos derivam do ction protosterila, e so organizados em
famlias de acordo com as estruturas formadas.
OH46
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 21 ______________________________________________________________________
Os triterpenos constituem talvez o grupo mais importante dos terpenides. So
conhecidos pelo menos 200 esqueletos diferentes desses compostos, advindos de
produtos naturais ou de reaes enzimticas caractersticas da ciclizao do esqualeno
ou do seu xido. Os triterpenos e outros compostos oriundos da mesma rota, incluindo
os esterides e as saponinas, so bem caracterizados quanto a suas atividades biolgicas
(XU et al., 2004).
Os grupos de triterpenos mais importantes so: esqualenos (linear); lanostanos
(48); damaranos (tetranortriterpenides e quassinides) (49); lupanos (50); oleanos (51);
ursanos (52) e hopanos (53) (LOPES, 2007 e DEWICK, 2001)
OOH
H
HH
OHH
H
OHH
H
H
H+
+
Ction Protosteril
Animaisfungos
Plantas
+
LanosterolCicloartenol
FIGURA 1.3: Esquema da ciclizao do esqualeno (LOPES, 2007).
Esqualeno
2,3 xido de esqualeno
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 22 ______________________________________________________________________
48 49
50 51
52 53
Os caminhos biossintticos que conduzem formao dos esterides e
triterpenos so completamente idnticos at a formao do 2,3-oxiesqualeno (FIGURA
1.4). A partir da a rota torna-se diversificada em sua etapa de ciclizao. A diversidade
estrutural dos triterpenos gerada nesta etapa e catalizada pelas enzimas
triterpenossintase e pode-se dizer que a diversidade dessas sintases reflete a diversidade
de espcies de plantas (FIGURA 1.4) (SHYBUYA et al., 1999)
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 23 ______________________________________________________________________
Os triterpenos pentacclicos derivam do epxido de esqualeno num arranjo
cadeira- cadeira-cadeira-barco, seguido de uma condensao. Esses tipos de compostos
so muito comuns e facilmente encontrados em vegetais. A estrutura policclica pode ter
cinco anis de seis membros (oleanos e ursanos) ou quatro anis de seis membros e um
de cinco membros (lupano) (MENDES, 2004).
Os compostos pentacclicos copreendem a classe mais numerosa de produtos
derivados do xido de esqualeno, que so catalizados pela enzima
oxidoesqualenosintase. A variedade estrutural desses compostos revelada pelos
diversos modos de ciclizao do oxido de esqualeno. Tanto o ction protosteril, quando
o ctio damarenil, por exemplo, podem se submeter expanso e ciclizao do quinto
anel (FIGURA 1.5 e 1.6, pgina 24). Variar a posio e o ataque facial para esta
ciclizao geram vrios ctions isomricos, que se rearranjam para dar formar a
numerosos produtos (XU et al., 2004).
Plantas ricas em triterpenides so usadas em chs e infuses desde os
primrdios da humanidade devido aos seus efeitos curativos. As plantas que os contm
so conhecidas tradicionalmente por possuir propriedades antiinflamatrias e protetoras
do sistema vascular, alm de atividades antialrgica, analgsica e antipirtica, que foram
comprovadas ao longo da metade do sculo XX (LOPES, 2007)
OH O
OHOH OH GlcA-GlcA-O
O
HOOC
OH
OH
OGlcOH
OGlcOH
OH
H
OH
H
Taraxasterol(3S)-2,3-Oxido de esqualeno
Lupeol-amirina -amirina
GlicirrizinaGlicirriza Glabra
28-COOH - cido oleanlico
Dammarenediol IIGinsenosdeo
Panax Ginseng
Cicloartenol -sitosterol
Outros esqueletos de Triterpeno
FIGURA 1.4 - Ciclizao do 2,3-xido de esqualeno e alguns exemplos de
triterpenos e saponinas de plantas (SHYBUYA, et al., 1999)
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 24 ______________________________________________________________________
FIGURA 1.5: Exemplo de ciclizao do ction damarenil para a formao de
alguns triterpenos pentacclicos (XU et al., 2004).
FIGURA 1.6: Exemplo de ciclizao do ction protosteril para a formao de
alguns triterpenos pentacclicos (XU et al., 2004).
importante notar que as estruturas atribudas ciclizao do xido de
esqualeno, podem alternativamente derivar do esqualeno seguido pela oxidao em C3;
inversamente aqueles atribudos aos produtos da ciclizao do esqualeno poderiam vir
da reduo do grupo 3-hidroxil aps a ciclizao. Alm disso, possvel que uma
enzima aceite mltiplos substratos. O xido de esqualeno mais protonado que o
Ction bacarenil OH
H
H
H Ction damarenil
13
18
17
14
16
+20
21
23
25
26
27
Expanso do anel
OH
H
H
H
13
1817
15 16
+
- H+
Ciclizao 18
OH
H
OH
H
OH
H
+
.1318
17
15 16
1929
30
24
25 26
27
28
23
. - H+13 18
17
15 16
1929
30
24
25 26
27
28
23
13 1817
15 16
1929
30
24
25 26
27
28
23hancolupenol
hancokinol
Ction germanicil
OH
H
H
H
OHH
H H
OHH
OHH
H
OH
Expanso do anel
20
21
Ciclizao - Formao do anel E
+17
17+
29
30
28.- H+
1317
15 1629
30
24
25 26
27
23
.13
17
15 16
24
25
27
23
. 2930
Ction arborinil boehmerol isoarborinol
+
Ction protosterill
13
14
17
2021
23
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 25 ______________________________________________________________________
esqualeno, e a esqualenosintase evolui ao protonado grupo funcional olefnico, que
menos bsico do que o grupo epxi. Conseqentemente, as esqualenosintases, podem
protonar com freqncia e ciclizar o xido de esqualeno tambm. Por exemplo, alm da
ciclizao normal do substrato do esqualeno para o tetraimanol, a trataimanolsintase
pode converter o 2,3-xido de esqualeno em 3,21-gamaceranediol (FIGURA 1.7) (XU
et al., 2004).
H
H
OH
OH
H
OH
OH
Tetraimanolsintase
. .
. .
Esqualeno
2,3-xido de esqualeno
Tetraimanolsintase
Tetraimanol
3,21-gamaceranediol
FIGURA 1.7: Exemplo da ciclizao do esqualeno e do xido de esqualeno pela
enzima tetraimanolsintase (XU et al., 2004).
Alguns triterpenos do tipo oleano, por exemplo, -amirina (12c), eritrodiol (19),
cido oleanlico (54), hederagenina (55), apresentam alguma atividade biolgica, tais
como antitumoral (MOREIRA et al., 2003, MENDES, 2004), nematicida (FERRAZ &
FREITAS, 2007), antiinflamatria, (CUNHA et al., 2003) e antinociceptiva (LIMA,
2005).
COOH
OH54
COOH
OHOH
55
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 26 ______________________________________________________________________
Fazem parte do grupo dos ursanos: -amirina (12a), cido urslico (14), cido
tormntico (56), uvaol (57a), faradiol (57b), amidiol (57c) (MENDES, 2004), etc.; e
algumas das atividades biolgicas atribudas a esses compostos que podem ser citadas
so: antimicrobiana (KATO et al., 2006; LOPES, 2007), antiinflamatria, antitumoral
(ES SAADY et al., 1995; LOPES, 2007), antiendematognica (ZITTERL-EGLSSER et
al., 1997) e citotoxidade (UKIYA et al., 2002).
COOH
OH
OH
56
R
OH
57
57a 12,3-OH,28CH2OH uvaol57b 16OH,20,28-CH3 faradiol57c 13-H, 16-OH, 28-CH3, 20-30 amidiol
Na famlia dos lupanos encontram-se os triterpenos: cido betulnico (13), lupeol
(15a), betulina (57a) e calenduladiol (58b) (LOPES, 2007), etc., dos quais foram
identificadas atividades biolgicas tais como antiinflamatria, anticancergena,
antibitica, e antimalrica (FREIRE et al., 2004; YASUKAWA et al., 1996; LOPES,
2007).
R1
R
58a 3-OH,28CH2OH betulina58b 13-H, 16-OH, 28-CH3 calenduladiol
Contribuio ao estudo qumico e biolgico de Pouteria gardnerii 27 ______________________________________________________________________
FIGURA 1.8: Pouteria gardnerii (Mart. & Miq.) Baehni: (1) rvore; (2) folhas; (3)
frutos; (4) caule. (FONTE: LORENZI, H. rvores Brasileiras: Manual de Identificao
e Cultivo de Plantas Arbreas Nativas do Brasil. vol. 2, 2 ed., 2002).
(1) (2)
(3) (4)
RELEVNCIA E OBJETIVOSRELEVNCIA E OBJETIVOSRELEVNCIA E OBJETIVOSRELEVNCIA E OBJETIVOS
Relevncia e Objetivos 29 ______________________________________________________________________
Considerando que:
Existe uma necessidade de conhecimento das caractersticas qumicas e
atividades biolgicas de espcies vegetais brasileiras.
Muitas espcies brasileiras so utilizadas como medicinais pela populao, sem
que haja comprovao das atividades farmacolgicas preconizadas ou estudos de
sua composio qumica.
Pouco se sabe da qumica e das atividades biolgicas da espcie Pouteria
gardnerii.
Os seguintes objetivos so propostos:
Objetivo Geral
Determinar a composio molecular de extratos das folhas de Pouteria gardnerii
- Sapotaceae.
Objetivos Especficos
Realizar o estudo fitoqumico dos extratos hexnico e etanlico de folhas de
Pouteria gardnerii.
Avaliar as possveis atividades biolgicas apresentadas pelos extratos brutos
hexnico, etanlico e aquoso, e fraes destes.
CAPTULO 2 MATERIAIS E
MTODOS
Captulo 2: Materiais e Mtodos 31 ______________________________________________________________________
2.1. MTODOS GERAIS
2.1.1- Cromatografia em camada delgada (CCD)
2.1.1.1- Fase Estacionria (FE):
- Placas de slica gel 60G (Merck), preparadas em suporte de vidro, com 0,25 mm de
espessura (analtica) ativadas a 105 C;
- Placas de slica gel 60G (Merck) preparadas em suporte de vidro, com 0,50 mm de
espessura (preparativa) ativadas a 105 C.
- Placas de slica gel 0,2 mm Kieselgel 60 ALUGRAM SIL G. (MACHEREY-
NAGEL).
2.1.1.2. - Eluentes (FM):
FM1: Hexano
FM2: Hexano:AcOEt (9:1)
FM3: Hexano:AcOEt (8:2)
FM4: CCl4:AcOEt (14:1)
FM5: Etanol
2.1.1.3 Reveladores (WAGNER et al., 1984)
R1 - Soluo cida de anisaldedo
Reagente para deteco de esterides, prostaglandinas, carboidratos, fenis,
glicosdeos, sapogeninas, terpenos de modo geral (leos essenciais), antibiticos,
micotoxinas.
Mecanismo: o mecanismo de reao com esterides ainda no bem elucidado. Vrias
reaes no-quantitativas correm simultaneamente. Ctions ciclopentenila tm sido
sugeridos como intermedirios que condensam com o anisaldedo para fornecer os
compostos corados. Provavelmente compostos do tipo trifenilmetano tambm sejam
formados com os compostos aromticos.
Soluo A: soluo de anisaldedo em cido actico a 2%
Soluo B: soluo etanlica de H2SO4 a 20%
Captulo 2: Materiais e Mtodos 32 ______________________________________________________________________
A cromatoplaca foi borrifada com soluo A e, em seguida, soluo B e foi
ento levada estufa por cerca de 10 min a 100C. Revelador geral.
R2 Reagente de Dragendorff
Soluo A: nitrato bsico de bismuto (1,7 g) foi dissolvido em 100 mL soluo de cido
actico:gua (1:4)
Soluo B: soluo aquosa de iodeto de potssio a 40%
Para borrifao da placa cromatogrfica foi preparada uma soluo composta de
5,0 mL de A; 5,0 mL de B; 20 mL de cido actico e 70,0 mL de gua. Deteco de
alcalides e peptdeos, pelo surgimento de mancha amarelo-alaranjada, imediatamente
aps a borrifao.
R3 Reagente NP/PEG
Soluo A: soluo metanlica de difenilboriloxietilamina a 2%
Soluo B: soluo etanlica de polietilenoglicol 400 a 5 %
A cromatoplaca foi borrifada com soluo A e, em seguida com soluo B e
observada sob luz ultravioleta. Deteco de flavonides e outras substncias fenlicas
pela intensificao da fluorescncia.
R4 Reagente de Verde de Bromocresol
Verde de bromocresol (0,100 g) foi dissolvido em 100 mL de metanol e
alcalinizado com soluo 1 mol/L de NaOH at que a soluo apresentasse cor azul
intenso. Deteco de cidos carboxlicos pelo surgimento de cor amarela sobre fundo
azul, imediatamente aps a borrifao.
R5 Radiao ultravioleta
A placa foi analisada sob luz ultravioleta (= 365 nm). Deteco de substncias
contendo grupos cromforos.
Captulo 2: Materiais e Mtodos 33 ______________________________________________________________________
2.1.2 Cromatografia em coluna (CC)
2.1.2.1 Cromatografia lquida
A slica (Slica gel 60 A (70-230 mesh) Merck) foi suspendida com o solvente
utilizado inicialmente como fase mvel (usualmente, hexano) e empacotada em coluna
de vidro at total decantao da slica. A amostra foi incorporada com quantidade
suficiente de slica e solvente e ento foi aplicada no topo da coluna, sendo
posteriormente procedida a eluio, com gradiente em ordem crescente de polaridade.
2.1.2.2 Cromatografia Gasosa acoplada Espectrometria de Massas (CG-EM)
Equipamento: CG: Cromatgrafo Varian, modelo Star 3400
CG-EM: Cromatgrafo Thermo Finnigan modelo TRACE GC
acoplado a a espectrmetro de massas Thermo Finnigan modelo Polaris Q (IE, 70eV).
Banco de dados: Catlogo de espectro de massas NIST - National Institute of
Standards and Technology.
Mtodo:
Coluna: HP5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 um (5% difenil, 95% dimetilpolisiloxano) -
marca Hewlett Packard
Injetor: 250C, modo splitless
Injeo: 2 L de amostra 1 mg/mL em clorofrmio
Hlio: 0,6 mL/min modo fluxo constante
Forno (2 rampas): 60C 1min, 40C/min at 140C, 4C/min at 300C em 10min
Linha de Transferncia: 280C
Espectrmetro de Massa: Fonte de ons: 250C;
Tempo de incio: 5min;
Polaridade: positivo;
Modo de scan: full scan;
Intervalo de massa: 50-600.
Captulo 2: Materiais e Mtodos 34 ______________________________________________________________________
2.1.3 - Anlises Espectromtricas
2.1.3.1 Espectrometria no Infravermelho (IV)
Os espectros foram obtidos no espectrofotmetro Bomem Hartmann & Braun
MB 100 (Alemanha), com valores expressos em cm-1. As amostras foram analisadas
em pastilhas preparadas com brometo de potssio (KBr) (Instituto de Qumica IQ
UnB).
2.1.3.2 Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)
Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram registrados no espectrmetro Varian
Mercury Plus (300MHz, 7,04T, E.U.A), utilizando sondas de deteco ATB e SW de 5
mm de dimetro interno. Os deslocamentos qumicos () foram expressos em ppm e os
solventes deuterados foram CDCl3 e MeOD4, com TMS (tetrametilsilano) como
referncia interna (Instituto de Qumica IQ UnB).
2.1.4 Testes biolgicos
2.1.4.1 Toxicidade em larvas de Artemia salina (MEYER et al., 1982).
- Preparao da soluo salina: Uma soluo de sal marinho (36 g/L) foi
preparada e ajustada, com uma soluo 0,1 M de NaOH, at pH 8-9. Essa soluo foi
utilizada para a ecloso dos ovos de A. salina e para o preparo das diluies dos extratos
hexnico, etanlico e aquoso da Pouteria gardnerii.
- Ecloso dos ovos: Os ovos de A. salina foram postos em soluo salina aquosa
com aerao constante e expostos luz diurna por 48 horas para eclodir.
- Preparao das diluies seriadas: Os extratos foram solubilizados em 0,2
mL de DMSO e o volume foi completado para 20 mL com a soluo salina (1000 ppm).
Desta soluo foram preparadas diluies (500, 250 e 125 ppm) em triplicata. Em cada
tubo foram adicionadas 10 larvas de A. salina.
- Controle positivo: Uma amostra de 2,00 mg dicromato de potssio foi
submetida a condies da amostra a ser analisada.
- Controle negativo: Tubos contendo 0,2 mL de DMSO e 10 larvas de A.
salina, nas mesmas condies da amostra a ser analisada.
Captulo 2: Materiais e Mtodos 35 ______________________________________________________________________
- Bioensaio: Os tubos foram mantidos iluminados e, aps de 24 horas, as larvas
sobreviventes foram contadas. O clculo da DL50 foi feito utilizando o programa
PROBITOS (MEYER et al., 1982).
2.1.4.2 Atividade fotoprotetora (SOUZA et al., 2005).
O teste foi realizado no laboratrio de Farmacologia Molecular da Faculdade de
Cincias da Sade da Universidade de Braslia pela equipe do Prof. Luiz Alberto
Simeoni.
Preparo da amostra: a amostra e o controle positivo foram dissolvidos em
mistura etanol:gua (1:1) nas seguintes concentraes: 50, 150 e 300 g/mL.
Controles positivos: cido p-aminobenzico (PABA) Merck; naringina Sigma.
Controle negativo: soluo etanol:gua (1:1).
A atividade fotoprotetora foi avaliada in vitro por meio da medida da
absorbncia das solues na regio do ultravioleta (200 a 400 nm), utilizando
espectrofotmetro Shimadzu (UV1601) e cubetas de quartzo com caminho ptico de 1
cm.
2.1.4.3 Atividade Antioxidante
2.1.4.3.1 Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio (RUCH et al., 1989)
Este experimento foi realizado no laboratrio de Anlise Instrumental e
Laboratrio de Testes Biolgicos da Universidade Catlica Dom Bosco (UCDB), em
Campo Grande MS, pela equipe da Profa. Ana Lcia Alves de Arruda.
O Mtodo de Varredura pelo Perxido de Hidrognio baseia-se na investigao
da habilidade das amostras testadas seqestrarem os radicais livres de perxido de
hidrognio. Elevada habilidade em seqestrar o perxido de hidrognio est relacionada
presena de antioxidantes, nas amostras capazes de reagir com radicais livres
(RAYMUNDO et al, 2004).
Reagentes e solues:
Reagente: Soluo de perxido de hidrognio em que foi preparada em tampo fosfato
0,1 M pH 7,4 (40 mM).
Tampo fosfato: Soluo A: KH2PO4 (dihidrogenofosfato de potssio) 0,1 mol/L
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Soluo B: NaOH (Hidrxido de sdio) 0,2 mol/L
Colocar em um balo volumtrico 50 mL da soluo A e 2,8 mL da soluo B,
completar o volume para 100 mL. Ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH
As amostras foram solubilizadas em MeOH, de forma a serem obtidas
diferentes concentraes (250, 125, 50, 25, 10 e 5 g/mL). A cada amostra foram
adicionados 3,4 mL de tampo fosfato 0.1 M pH 7.4 e 0,6 mL de soluo de perxido
de hidrognio 40 mM.
Foi utilizado como padro o cido ascrbico nas mesmas condies das
amostras. As amostras foram incubadas por 10 minutos e foi feita a leitura a 230 nm em
espectrofotmetro Aqua Mate UV/Visvel (Thermo Spectronic AQA095109)
2.1.4.3.2. Atividade seqestradora do radical DPPH (YILDIRIM et al., 2001 e
HUANG et al., 2005).
Este experimento foi realizado no laboratrio do curso de Qumica da
Universidade Catlica de Braslia Braslia/DF, pela equipe do Prof. Carlos Frederico
de Souza Castro.
O mesmo se baseia na capacidade dos agentes antioxidantes presentes na
amostra em seqestrar o radical estvel DPPH. A elevada habilidade da amostra em
retirar o radical estvel do DPPH est relacionada com a atividade antioxidante da
amostra (DUARTE-ALMEIDA, 2007).
Preparo das Solues: Reagente: Foram dissolvidos 2,5 mg de 2,2-difenil-1-
picrilidrazila (DPPH) em 25 mL de etanol. A soluo foi mantida em frasco mbar
(soluo estoque).
Amostra: Foram dissolvidos 0,002 g da amostra em 10 mL de etanol.
Controle positivo: Foram dissolvidos 0,002 g de butilhidroxitolueno (BHT) em
10 mL de etanol.
Controle negativo (branco): etanol.
Da amostra, preparada conforme descrito acima, foram tomados 4 mL,
distribudos em 2 bqueres, um para o ensaio e outro para o controle negativo.
soluo inicial restante, foram adicionados 4 mL de etanol, para a obteno de uma
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soluo com 60% da concentrao da soluo original. O procedimento foi repetido por
mais seis vezes, para obteno de sete solues com diluies sucessivas em
concentraes decrescentes (200 a 10 ppm).
Para cada amostra do ensaio, foi adicionado 1 mL de soluo de DPPH. Para
cada controle negativo, foi adicionado 1 mL de etanol, de modo a manter a mesma
concentrao do extrato bruto na amostra e no controle negativo.
Aps a adio da soluo de DPPH, as solues foram mantidas em repouso por
30 min. A atividade antioxidante foi avaliada in vitro por meio da medida da
absorbncia das solues em 517 nm, utilizando um colormetro da Micronal, modelo
B-542. A porcentagem do DPPH final foi calculada pela seguinte Equao (1):
A concentrao de DPPH (% DPPH restante) proporcional concentrao de
substncia antioxidante presente na amostra, sendo que a concentrao de extrato que
causa uma diminuio para a metade da concentrao inicial de DPPH (50%) definida
como Concentrao Efetiva 50 (CE50), e a concentrao de extrato que causa uma
diminuio de 99% da concentrao inicial do DPPH definida como Concentrao
Efetiva 99 (CE99).
A CE50 e CE99 so calculadas por interpolao do grfico de regresso linear
obtido para os valores de %DPPH restante para cada concentrao.
2.1.4.4 Atividade antimicrobiana
2.1.4.4.1 Atividade antibacteriana
2.1.4.4.1.1. Mtodo de difuso em gar (NCCLS, 2003a):
Este experimento foi realizado no laboratrio do Hospital das Foras Armadas
(HFA), por Amabel Fernandes Correia
- Microrganismos: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli -
ATCC 25922 e Staphylococcus aureus - ATCC 29213
=
controle
amostracontroleteres Abs
AbsAbsDPPH 100% tan
Equao (1)
Captulo 2: Materiais e Mtodos 38 ______________________________________________________________________
- Inculo bacteriano inicial: igual a 1,8 x 107 unidades formadoras de
colnias/mL (UFC/mL). Quando analisado por espectrometria no comprimento de onda
de 600nm, forneceu uma leitura de densidade ptica (OD) igual a 0,5 (controle).
- Concentraes da amostra: entre 1400 g/mL a 500 g/mL.
- Meio de cultura:
-Agar Mller Hinton (Earle)
- Bioensaio: Discos de papel de filtro de seis milmetros de dimetro,
previamente autoclavados, foram impregnados com 20 L de uma soluo da amostra,
preparada em solvente adequado completa solubilizao (hexano, etanol ou gua),
para obteno de uma concentrao final de 100 mg/mL. Os discos impregnados foram
inseridos no meio de cultura contendo suspenses dos microrganismos supracitados.
As placas foram incubadas a 37C ( 1C) por 24 horas (para as bactrias).
Depois da inoculao, havendo zona de inibio ao redor do disco, esta foi medida.
Todas as determinaes foram feitas em triplicata. Foi realizada uma leitura em
espectrofotmetro a 600 nm. Foram consideradas ativas as amostras que apresentaram
OD
Captulo 2: Materiais e Mtodos 39 ______________________________________________________________________
Meio de Cultura: gar Sabouraud (VETEC).
Bioensaio: Discos de papel de filtro de seis milmetros de dimetro, previamente
autoclavados, foram impregnados com 20 L de uma soluo da amostra, preparada em
solvente adequado completa solubilizao (hexano, metanol, etanol ou gua), para
obteno de uma concentrao final de 100 mg/mL. Os discos impregnados foram
inseridos no meio de cultura contendo suspenses dos microrganismos supra-citados.
As placas foram incubadas a 37C ( 1C) por 24 horas (para as bactrias) e
28C por 48 horas (para leveduras). Depois da inoculao, havendo zona de inibio ao
redor do disco, que foi medida. Todas as determinaes foram feitas em triplicata.
Controles:
-positivo: discos comerciais de nistatina e anfotericina B (ambos da marca CECOM).
-negativo: solvente.
2.1.4.5 - Teste de inibio de proliferao celular
2.1.4.5.1 - Ensaio de proliferao celular MTT (JADA et al., 2007 e CULIOL et al.,
2004).
Este teste foi realizado no Laboratorio de Imunologia e Virologia da Faculdade
de Cincias Biolgicas da Universidad Autonoma de Nueva Leon (UANL), Mxico,
pela equipe do Prof. Pablo Zapata Benavides.
O princpio deste mtodo consiste na absoro do sal MTT {brometo de [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio]} (Sigma) pelas clulas sendo reduzido no
interior da mitocndria a um produto chamado Formazan. Este produto acumulado
dentro da clula e extrado atravs da adio de um solvente apropriado.
Linhagem celular: clulas de cncer pulmonar (NSCLC - non-small cell lung
cncer) das linhagens CALU e A427, ambas ATCC (American Type Culture
Collection).
Reagente: brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio], marca
Sigma.
Meio: Meio Mnimo Essencial (Eagle) com 2 mM de L-glutamina e Soluo
Salina balanceada (Eargle) ajustada para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sdio e 10 %
de Soro Fetal.Bovino.
Captulo 2: Materiais e Mtodos 40 ______________________________________________________________________
Bioensaio: Em placas de cultivo de 96 poos, foram colocadas 3000 clulas por
poo e aps 24 horas, as clulas que j estavam aderidas foram tratadas com o extrato
metanlico das amostras em quatro concentraes diferentes (0,25 mg/mL, 5 mg/mL, 1
mg/mL, e 2 mg/mL).
Aps 24 horas foi realizado o ensaio de proliferao celular com MTT {brometo
de 2,5-difenil-3-(4,5-dimetiltiazo-2-ila)