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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTACÂMPUS DE JABOTICABAL
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE
unesp
Ecotoxicologia dos Agrotóxicos e Saúde Ocupacional
7a. Aula - Dinâmica ambiental dos agrotóxicos:
contaminação dos componentes abiótico
Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto
Prof. Titular - Responsável pela Disciplina – Set/2017
7ª. AULA – ECOTOXICOLOGIA DOS AGROTÓXICOS
Dinâmica ambiental dos agrotóxicos: contaminação dos
componentes abióticos.
1 – Introdução
2 – Dinâmica ambiental dos agrotóxicos: entrada, distribuição e destino
3 - Contaminação do componentes físicos: solo e água
4 – Testes de avaliação da toxicidade aguda de agrotóxicos para minhocas
PRÁTICA: Instalação de testes de avaliação de toxicidade aguda de agrotóxicos para organismos
do solo – minhocas e microrganismos do solo.
USO DE AGROTÓXICOS
- AMBIENTAL
RISCOS - OCUPACIONAL
- ALIMENTAR
UTILIZAÇÃO DE AGROTÓXICOS
APLICAÇÃO INTENCIONAL (DIRETA)
Planta e Solo
UTILIZAÇÃO DE AGROTÓXICOS
APLICAÇÃO INTENCIONAL (DIRETA)
Uso Domissanitário
Água
FONTES DE ENTRADA DE AGROTÓXICOS NA
ATMOSFERA
A – Prática de pulverização
- Mecanismos de aplicação das gotas
- Deriva
B – Volatização das plantas e dos solos
C – Erosão eólica
D – Evaporação da água na aplicação ou dos alvos
E – Processos de formulação e manufatura (fábrica)
F – Comercialização
G – Homem (urina, fezes, etc)
FONTES DE ENTRADA DE AGROTÓXICOS NO AMBIENTE
AQUÁTICO
A – Junto com poeiras ou na chuva
B – Junto com partículas de solo erodidas
C – Diretamente da aplicação D – Efluentes industriais
E – Água de esgotos F – Carreado com animais
1- PROCESSOS DE TRANSPORTE / PERSISTÊNCIA:
A. Transporte: 1. Coeficiente de Adsorção (Kd/Koc)
2. Coeficiente de Partição (Kow) 3. Pressão de Vapor
4. Solubilidade em Água (S)
B. Persistência: 1. Biodegradação 2. Fotólise 3. Hidrólise 4. Redox 5. Coeficiente
de Adsorção (Kd/Koc) : Kd = [solo] / [água] Koc = [C. org.] / {água]
2 – TOXICIDADE:
A - Organismos aquáticos C - Organismos do solo
B - Organismos aéreos - aves D - Mamíferos
Dados necessários à avaliação da ação de produtos
químicos no ambiente
PROCESSOS DE DISSIPAÇÃO DOS AGROTÓXICOS
NO SOLO
1. FÍSICOS: Volatilização Lixiviação pela água
Erosão junto com o solo por vento e água Deriva
2. QUÍMICO: Fotodecomposição
Adsorção nos colóides do solo
Reações químicas com os constituintes
dos solos
Retirada por plantas e microrganismos
3. MICROBIOLÓGICOS: Decomposição microbiana
PROCESSOS DE DISSIPAÇÃO DE AGROTÓXICOS NO
AMBIENTE
AGROTÓXICO:
Estrutura molecular
Solubilidade em água
Polarização
Fotodecomposição
Aditivos
Grau de ionização
Lipossolubilidade
Volatilização
Formulação
Dose aplicada
FATORES ENVOLVIDOS NA DISSIPAÇÃO NO SOLO
SOLO:
Textura
Extrutura
pH
Temperatura
Composição mineral
m.o.
Umidade, etc
CLIMA:
Chuvas
Temperatura
Ventos Luminosidade
Umidade relativa do ar
HOMEM
Qualidade da aplicação
Escolha certa – produto /dosagem
Conhecimento técnico
MICRORGANISMOS NO SOLO:
Bactérias - milhões/g solo
Actinomicetos – centenas de
milhões a alguns milhões
Fungos - ± 600 mil/g solo
Protozoários - ± 10 mil/g
Algas – 1 mil a 10 mil/g
PROCESSOS MICROBIOLÓGICOS NO SOLO
DECOMPOSIÇÃO MICROBIANA
Depende da ação catalítica de
enzimas específicas produzidas
pelo microrganismos
CONDIÇÕES ÓTIMAS:
Umid. solo: 50 – 100% cc
Boa aeração do solo
Tempertura: 27 ° – 32° C
pH: 6,5 – 8,0
m.o. > teor > atividade
ALTERAÇÕES MOLECULARES
Desalquilação
Desalogenação
Hidrólise
Hidrólise do anel aromático
Beta oxidação
Redução
Herbicida Persistência no solo Decomposição
Monuron 4-12 meses
Pseudomonas
Achromobacter
Flavobacterium
2,4-D 2-8 meses
Achromobacter
Corynebacterium
Flavobacterium
Dapalon 2-4 semanas Agrobacterium
Pseudomomas
MCPA 3-12 semanas Achromobacter
Mycoplana
TCA 2-9 semanas Pseudomonas
DECOMPOSIÇÃO MICROBIANA E PERSISTÊNCIA DE
HERBICIDAS NO SOLO
Valores gerais de persistência de agrotóxicos no solo (HURTING, 1972)
Agrotóxicos Persistência no solo
Inseticida hidrocarbonetos clorados + 18 meses
Herbicidas, ureia, triazinase picloran 18 meses
Herbicidas ácido benzóico e amida 12 meses
Herbicida fenoxix, toluidinas e nitridos 6 meses
Herbicidas carbamatos e alifáticos 3 meses
Inseticidas fosfatos 3 meses
Clordane + 5 anos
DDT + 4 anos
BHC, Dieldrin + 3 anos
Heptacloro, Aldrin + 2 anos
Diazinon + 12 semanas
Disulfoton 4 semanas
Forate 2 semanas
Malation, Paration - 1 semana
Propazine, Picloran 18 meses
Simazine 12 meses
Atrazine, monuron 10 meses
Linuron 3 meses
Difluamide 10 meses
2,4-D - 1mês
C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA
CARACTERÍSTICAS INICIAIS INDICATIVAS DE RISCOS E DA
NECESSIDADE DA AVALIAÇÃO DE RISCO DOS COMPOSTOS QUÍMICOS .
- Alto potencial tóxico
- Grande facilidade de dispersão
- Persistência no meio ambiente
- Tendência de bioacumulação
- Produção e lançamento em grande
volumes no ambiente
2 – TOXICIDADE:
A – Organismos aquáticos: peixe, Daphnia, organismos inferiores
B- Organismos aéreos – aves: patos, cordonizes
C- Organismos dos solo: microrganismos, minhocas
D – Mamíferos: ratos, camundongos, cães, outros
Dados necessários à avaliação da ação de produtos
químicos no ambiente
C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA
TOXICOLOGIA
É o estudo dos efeitos adversos dos produtos químicos sobre
os organismos vivos mediante o exame da natureza desses efeitos e
a determinação da probabilidade de sua ocorrência.
AREAS DA TOXICOLOGIA
- DESCRITIVA
- MECANÍSTICA
- REGULAMENTADORA
C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA
TOXICOLOGIA DESCRITIVA – (Testes agudos/crônicos)
Trata diretamente dos testes de toxicologia, nos quais se
designam organismos experimentais para gerar informações que
possam ser utilizadas na avaliação de riscos, aos quais os seres
humanos e outras espécies de organismos ficariam expostos em um
meio ambiente com determinado produto .
TOXICOLOGIA MECANÍSTICA – (MECANISMO DE AÇÃO)
Busca elucidar os mecanismos pelos quais os produtos
químicos exercem seus efeitos tóxicos sobre os organismos. Os
resultados de seus estudos auxiliam a desenvolver testes com
prognósticos mais úteis na obtenção de informações para
determinar riscos.
C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA
TOXICOLOGIA REGULAMENTADORA – (Registro )
É responsável pelas decisões sobre um produto químico, se
ele oferece ou não riscos ao ser comercializado dentro de fins espe-
cíficos, com base em dados obtidos em testes realizados pela
toxicologia descritiva.
Praticada por agências regulamentadoras nacionais e internacionais.
Remédios, cosméticos, aditivos em alimentos, agrotóxicos, etc.
Normas sobre o total permitido no ambiente, nas águas, no solo.
C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS AGRONÔMICAS TOXICOLÓGICAS
E ECOTOXICOLÓGICAS DOS COMPOSTOS QUÍMICOS E SEUS EFEITOS
REGISTRO DE AGROTÓXICOS NO BRASIL –
MODELO TRIPARTITE
MAPA
Avaliação da
eficiência
Agronômica IBAMA
Avaliação da
Ecotoxicidade - PPA
ANVISA
Avaliação da
Toxicidade
REGISTRO
SISTEMA DO IBAMA PARA A CLASSIFICAÇÃO DOS AGROTÓXICOS PELO PPA
Tabela IBAMA
PPA - IBAMA
• Termo “Ecotoxicologia” – criado em 1969 pelo Dr. Rene Truhaut;
• Ecotoxicologia: estudo dos efeitos adversos de substâncias
químicas com o objetivo de proteger espécies naturais e
populações (TRUHAUT, 1977).
• Ensaios ecotoxicológicos: São testes que utilizam
diferentes tipos de organismos vivos representativos do ambiente
para analisar os efeitos que substâncias podem ter sobre eles.
(RUBINGER, 2009).
ECOTOXICOLOGIA
Parte da toxicologia que estuda os efeitos adversos de
produtos químicos selecionados sobre a TOTALIDADE DO
ECOSSISTEMA, mediante a determinação dos riscos que os
produtos representam, tanto para a saúde humana quanto para
outros organismos.
C0NCEITOS EM TOXICOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA
ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS, também chamados
de BIOENSAIOS, são realizados para detectar a
toxicidade de efluentes, determinar o grau, ou o efeito
biológico, de novos produtos químicos (Ex.: Agrotóxicos,
farmacêuticos, etc.), a cada dia mais lançados no meio
ambiente, que podem causar nos indivíduos, nas comunidades
e populações, para se evitar as crises epidemiológicas e afins.
ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS: São realizados por métodos de
comparação entre uma substância "genérica" já conhecida e a nova
substância desconhecida, para identificar os efeitos que as mesmas
causam quando inseridas no meio de cultura de células vivas.
Na atualidade, substâncias químicas desconhecidas são produzidas
de forma intencional ou como subprodutos de determinadas atividades
produtivas e necessitam de análise.
OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.
Agudos: São "estudos experimentais feitos com
organismos-teste que determinam se um efeito adverso
observado ocorre em um CURTO PERÍODO DE TEMPO
(em geral até 14 dias) após administração de UMA ÚNICA
DOSE da substância testada ou após múltiplas dosagem
ADMINISTRADAS EM ATÉ 24 HORAS“
OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.
Crônicos São "os estudos em que os organismos-teste
sofrem EXPOSIÇÕES MÚLTIPLAS A DOSES
SUBLETAIS e são expostos observados durante uma
GRANDE PARTE DO TEMPO DE VIDA, e os EFEITOS
CRÔNICOS PERSISTEM POR UM LONGO PERÍODO DE
TEMPO, e podem ser evidentes imediatamente após a
exposição ou não“ .
RESOLUÇÃO Nº 420, DE 28 DE DEZEMBRO DE 2009
Dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à
presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento
ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de
atividades antrópicas.
PORTARIA Nº 84, de 1996 – IBAMA
PPA - 1- PROCESSOS DE TRANSPORTE / PERSISTÊNCIA
2 – TOXICIDADE: C- Organismos dos solo: microrganismos, minhocas
Tabela Classes Ensaios
Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA
Art. 3. A classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental (PPA)
baseia-se nos parâmetros biocumulação, persistência, transporte, toxicidade
a diversos organismos, POTENCIAL MUTAGÊNICO, TERATOGÊNICO, CARCI-
NOGÊNICO, obedecendo a seguinte graduação:
Classe I – Produto altamente perigoso
Classe II – Produto Muito perigoso
Classe III – Produto Perigoso
Classe IV – Produto Pouco Perigoso
ANEXO IV
PARTE C – CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS
PARTE D – TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO
PARTE E – COMPORTAMENTO NO SOLO
PARTE F – TOXICIDADE PARA ANIMAIS SUPERIORES
PARTE G – POTENCIAL GENOTÓXICO, EMBRIOFETOTÓXICO E
CARCINOGÊNICO
Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA.
Art. 4. Para efeito de classificação quanto ao PPA de agrotóxicos, seus
componentes e afins o interessado deverá apresentar a documentação
completa conforme estabelecida nos anexos I, III, IV, V e X.
D.1 – Microorganismos.
D.2 – Algas.
D.3 – Organismos do solo (minhocas)
D.4 – Abelhas.
D.5 – Microcrustáceos. D.5.1 – Agudo. D.5.2 – Crônico
D.6 -- Peixes. D.6.1 – Agudo. D.6.2 – Crônico.
D.7 – Bioconcentração em peixes.
D.8 – Aves. D.8.1 – Dose única.
D.8.2 – Dieta. D.8.3 – Reprodução.
IBAMA (1987) - PARTE D – TOXICIDADE PARA
ORGANISMOS NÃO-ALVO
IMPORTÂNCIA DAS MINHOCAS PARA O SOLO E VEGETAIS
RESTOS ORGÂNICOS NO SOLO
(ANIMAIS E VEGETAIS)
Nutrientes
Microrg.
úteis
Penetração de
ar no solo
Penetração e
retenção de
água no solo
VEGETAIS
GALERIAS FEZES CADAVER DECOMPOSTO
FATORES LIMITANTES DO
CRESCIMENTO DAS MINHOCAS
- Umidade
- Matéria Orgânica em decomposição
POPULAÇÃO DE MINHOCAS NOS SOLOS
DE BOA PASTAGEM (MEINICKE, 1993)
- ADULTAS – 800/m2 , Peso = 400 g/m2
- JOVENS – 20.000/m2 , Peso = 26 g/m2
TESTE PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE
AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS
1. TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO
(OECD – Protocolo nº 207)
2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD – Protocolo nº 207)
3. TESTE DO ARTISOL: OECD – Protocolo nº 207 e IBAMA, 1987.
4. NORMA ABNT NBR 15.537:2014 – Ecotoxicologia terrestre —
Toxicidade aguda — Método de ensaio com minhocas
(Lumbricidae).
Solo Artificial Tropical –SAT - solo composto de areia industrial
peneirada, caulim e pó da fibra de casca de coco peneirada.
5. ENSAIOS DE CAMPO
2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD - Prot. nº 207)
SUBSTRATO TESTE: Substrato básico (10% de turfa (pH 6,0), finamente moída; 20%
de caolinita; 69% de areia de quartzo industrial, com + de 50% de part. de 0,05 - 0,2
mm ; e 1% CaCO3 pulverizado
UMIDADE: Água deionizada (25 - 42% peso. sub. básico).
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (20 2°C), CLARO.
ANIMAIS – Adulto e com Clitélo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo.
Aclimatados por 24 h no substrato básico.
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição.
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)
VANTAGEM – Resultados são usados para se estabelecer as dosagens no teste de
avaliação de toxicidade crônica
3. TESTE DO ARTISOL OECD – Protocolo nº 207 e IBAMA, 1987.
SUBSTRATO TESTE: ARTISOL
- 1.425 g bolas de vidro (1,5 - 2,0 cm )
- 90 g sílica gel, em pó impalpável
- 215 mL água deionizada, com as concentrações do agrotóxico
TESTE PRELIMINAR: Faixa que causa 0 - 100% mortalidade
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
RESULTADOS: % Mortalidade: CL50 (mg/kg de sílica)
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida
4. ORGANISMOS DO SOLO - OECD – Protocolo nº 207
IBAMA, 1987 – D. 5 - D.3.1. Toxicidade Aguda para Minhocas - Eisenia foetida)
FUNDAMENTO: Exposição de minhocas adultas por 14 dias, em substrato ARTISOL
SUBSTRATO ARTISOL: 1.425 g de bolas de vidro com 1 - 1,5 cm ; 90 g de sílica amorfa
- sílica gel em pó, impalpável; 215 ml de água destilada com a concentração da
substância dissolvida.
Misturar tudo em um cristalizador de vidro.
Colocar 10 Animais adultos, com clitélo, manter por 14 dias em sala climatizada, 20
2°C, ESCURO.
AVALIAÇÃO: CL(I)50, 14 dias – Conc. Letal Inicial Média.
CONTROLE DE QUALIDADE:
a. < 10% de Mortalidade na testemunha
b. CL(I)50, 14 dias para a CLOROACETAMIDA deve estar
entre: 35 a 160 mg/kg de sílica.
D.3.1. Toxicidade Aguda para Minhocas - Eisenia foetida
ABNT NBR 15537: 2014
ABNT NBR 15537: 2014
ABNT NBR 15537: 2014
ENSAIOS DE SENSIBILIDADE Eisenia foetida (cloroacetamida) - em substrato areia
1 2 3 4 5
CL50 10,24 10,03 10,57 10,47 8,43
Lim Sup 11,7 11,7 11,7 11,7 11,7
Lim Inf 8,2 8,2 8,2 8,2 8,2
Média 9,95 9,95 9,95 9,95 9,95
Ensaiosmg/kg
Areia
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0
11,5
12,0
1 2 3 4 5
Cloroacetamida
CL(I)50 = 110,06 mg/kg
Controle de Qualidade
IBAMA (Sílica)
35 < CL(I)50 < 160 mg/kg
ICHINOSE, 1992)
CL (I) 50 (mg/kg)Intervalo de confiança
(mg/kg)
110,06 95,48 - 126,95
RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E
RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL
Ensaio com
SUBSTANCIA DE
REFERÊNCIA
para avaliar as
condições de
SANIDADE E
SENSIBILIDADE
do organismo-
teste.
ABNT NBR 15537: 2014
ABNT NBR 15537: 2014
TESTE PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE
AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS
TESTE COM SUBSTRATOS DIVERSOS
AREIA
SOLOS COM DIFERENTES
TEXTURAS
Benomil
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 8,06 c 4,60 – 14,57
Areia 0,58 d 0,31 – 1,21
Latossolo Ver. Escuro 13,06 b 9,26 – 18,54
Latossolo Roxo 10,82 bc 6,42 – 18,67
Litossol 45,40 a 26,73 – 78,77
ICHINOSE, 1992)
Parathion methyl
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 73,61 b 52,15 – 109,65
Areia 8,81 d 7,10 – 10,94
Latossolo Ver. Escuro 86,69 b 64,14 – 117,79
Latossolo Roxo 53,59 c 40,54 -- 86,51
Litossol 191,73 a 132,25 – 269,73
ICHINOSE, 1992)
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 929,47 b 779,57 – 1.108,88
Areia 207,44 d 157,06 – 274,11
Latossolo Ver. Escuro 783,43 c 658,12 – 934,54
Latossolo Roxo 752,65 c 631,27 – 899,35
Litossol 1.458,80 a 1.316,01 – 1.618,26
ICHINOSE, 1992)
ICHINOSE, 1992)
AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE
AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)
TOXICIDADE AGUDA
CL50
Con. Ambiental Estimada
CAE
RELAÇÃO
CL50 : CAE
CL50< 10 x CAE
10 x CAE < CL50< 100 x CAE
CL50 > 100 x CAE
80 < 10 x 10
Testes subletais
Testes de campo
10 x 10 < 500 < 100 x 10
Estudos de efeitos
sobre o peso, etc
2.000 > 100 x 10
Provavelmente
baixo Risco
ABNT NBR lS8 17512-1 :2011
TESTES DE TOXICIDADE CRÔNICA
SOLO: ARTIFICIAL / ARTISOL / CAMPO
CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS
Avaliação de efeitos sobre
Crescimento (peso)
Reprodução - produção de jovens
- produção de casulos
Comportamento
Fisiologia, Morfologia
TESTES DE CAMPO
1. AMOSTRAGEM DE SOLO DA CAMADA SUPERFICIAL
Avaliação da população através da Coleta de amostras de solo com volumes de 60 x
60 x 15 cm, por exemplo, e coletar todas as minhocas.
2. USO DE FORMOL / FORMALINA
50 ml de formol / formalina (40%) em 9 L de água.
Marcar áreas de 0,25 a 1,0 m2 e distribuir uniformemente.
Coletar, identificar, classificar e contar os animais que saltarem do solo.
PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para
minhocas
1 - Pesar 1 kg de substrato: Areia / Solo Argiloso / Solo orgânico em sacos plásticos.
2 - Colocar caldas com agrotóxicos, volume suficiente para manter 80% de
umidade areia e solo orgânico - solo argiloso - * tratamentos
3 - Misturar a calda com o substrato dentro do saco plástico
4 - Colocar 10 minhocas, previamente pesadas, na superfície do substrato
5 - Fechar a “Boca” do saco plástico com arame plastificado
6 - Furar a parte de cima do saco plástico com estilete, para trocas de ar.
Tratamentos
METHYL PARATHION (Folisuper®)AREIA
1 – TESTEMUNHA2 – 6 mg/kg substrato3 – 12 mg/kg substrato4 – 18 mg/kg substrato5 – 24 mg/kg substrato
Tratamentos
METHYL PARATHION (Folisuper®)ARGILOSO6- TESTEMUNHA7 – 60 mg/kg substrato8 – 120 mg/kg substrato9 – 180 mg/kg substrato10 – 240 mg/kg substrato
Tratamentos
METHYL PARATHION (Folisuper®)SOLO ORGÂNICO10- TESTEMUNHA11 – 60 mg/kg substrato12 - 80 mg/kg substrato13 – 160 mg/kg substrato14 – 240 mg/kg substrato15 – 320 mg/kg substrato
PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos
para minhocas
AVALIAÇÃO - 14 DIAS DE EXPOSÇÃO
1 - Abrir os sacos plásticos e despejar o substrato sobre uma folha de
jornal
2 - Procurar e separar as minhocas vivas – contar
3 - Pesar as minhocas vivas encontradas em cada saco plástico.
4 - Calcular a CL(I)50 e a redução no peso médio dos animais.