Post on 01-Jan-2016
Bioquímica
Experimental I
Docente: Carlos Farinha Discentes: André Nascimento, nº. 41842 Andreia Carvalho, nº. 41873 João Carréu, nº. 41843 Patrícia Patrão, nº. 41864 13 de Novembro de 2012
Caracterização de proteínas por técnicas electroforéticas (SDS-PAGE e focagem isoelectrónica)
Faculdade de Ciências da
Universidade de Lisboa
Índice Resumo .......................................................................................................................................... 3
Fluxograma do gel ......................................................................................................................... 4
Fluxograma da sandwich ............................................................................................................... 5
Materiais, reagentes e procedimento ........................................................................................... 6
Tratamento de dados .................................................................................................................... 7
SDS-PAGE................................................................................................................................... 7
a) Apresente um esquema da separação obtida na eletroforese SDS-PAGE. Represente
a curva de calibração do gel preparado e determine a massa molecular relativa das
subunidades da γ-globulina................................................................................................... 7
b) Discuta globalmente os resultados obtidos na técnica de SDS-PAGE em termos da
estrutura da γ-globulina. ..................................................................................................... 11
Focagem isoeléctrica ............................................................................................................... 13
a) Explique o número de bandas de proteína padrão que encontrou. ........................... 13
b) De acordo com os dados obtidos para os padrões, construa uma curva de calibração
do gel: pI da banda versus distância migrada em relação ao cátodo. ................................ 14
c) Determine o valor de pI das proteínas estudadas a partir da curva de calibração
anterior. ............................................................................................................................... 15
d) Discuta os resultados e compare os valores obtidos com os pI calculados para as
proteínas estudadas a partir da sua sequência de resíduos de aminoácidos (consulte uma
base de dados de proteínas (http://www.expasy.org/ )). Comente os possíveis desvios
observados. ......................................................................................................................... 16
Conclusão: ................................................................................................................................... 17
Bibliografia .................................................................................................................................. 19
Resumo
Este trabalho experimental teve como objectivo a realização de duas técnicas
eletroforéticas SDS-PAGE e focagem isoelétrica para caracterização de proteínas.
A primeira técnica foi usada para obter informação sobre a estrutura da -globulinas, no qual,
utlizou se dois tampões:
Tampão de aplicação da amostra preparado sem β-mercaptoetanol;
Tampão de aplicação da amostra preparado com β-mercaptoetanol.
Após a realização da electroforese determinamos a massa molecular relativas das
subunidades da γ- globulina e para a determinação destas traçou-se uma recta de calibração
baseada nos valores de Rf das proteínas padrão e nos seus valores de log10(Mr). Obteve-se
experimentalmente uma massa relativa de 66489,1 Da para a Albumina; 92879,1 Da para a
Xilanase U4; 51745,8 Da para a Fosfamanose isomerase e 26518 Da para a Esterase Fam 4 de
glúcidos.
A segunda técnica foi usada para determinação do ponto isoeléctrico de várias proteínas.
Determinamos estes valores por comparação da curva de caliberação e os pontos isoelétricos
conhecidos de vários marcadores e concluimos que os resultados estão praticamente todos de
acordo com o esperado.
Fluxograma do gel
Fluxograma do gel
Adicionar a solução do gel resolvente à “sandwich” com o auxílio de uma pipeta
de Pasteur, deitando-a por um dos cantos e inclinando
ligeiramente a base de polimerização, até
um pouco acima da altura do traço que foi
marcado.
Adicionar os agentes polimerizantes, TEMED e PSA, à
solução do gel resolvente e agitar (ter
preparada uma seringa com agulha
contendo água destilada).
Preparar as soluções do gel resolvente e do gel de concentração em erlenmeyers, sem
adicionar os agentes polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos
Quadros I e II. A solução de PSA deve ser preparada no próprio
dia.
Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize (45 min
a 1 h) - nessa altura notar-se-á mais distintamente a linha de interface gel-água. A solução não usada
também pode servir de auxiliar para seguir a polimerização
do gel.
Muito devagar, com o auxílio da seringa preparada anteriormente, introduzir um pouco de água
destilada sobre a superfície da solução de gel resolvente. É aconselhável introduzir a água pelos dois
cantos superiores da "sandwich" (para evitar a formação de uma superfície de
polimerização irregular, o que ocorreria caso a solução polimerizasse directamente exposta ao ar).
Guardar o monómero não usado ao
pé da “sandwich”.
Secar com cuidado a superfície
do gel com um pouco de
papel de filtro.
Após certificação de que o gel polimerizou, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer
totalmente toda a água da superfície do gel (não apenas a que foi adicionada com a seringa, mas
também a que resultou da reacção de polimerização da
acrilamida - água de exclusão do gel).
Quando a solução tiver polimerizado no erlenmeyer, deitá-la fora. Nessa altura, também o gel na “sandwich”
deverá ter polimerizado.
Introduzir o pente na “sandwich” e incliná-lo de modo a que os dentes façam um ângulo de cerca
de 10°. Este cuidado visa impedir que fiquem retidas
bolhas de ar nos dentes do pente quando se introduz a solução de monómeros.
Adicionar a solução do gel de concentração do lado do espaçador em que o pente está inclinado
até cobrir os seus dentes.
Adicionar os agentes
polimerizantes ao gel de
concentração num
erlenmeyer e agitar.
Deixar em repouso até polimerizar (30 - 45 min) (Notar que, neste caso, não é
necessário adicionar água para se obter uma superfície de polimerização lisa, uma vez que os
dentes do pente desempenham essa função).
Introduzir cuidadosamente o pente, evitando a retenção de bolhas de ar
nos seus dentes.
Alinhar o pente na “sandwich” e adicionar mais solução de modo a
que a “sandwich” fique completamente cheia.
Marcar a posição dos poços do pente no gel com uma caneta.
Aguardar que o monómero
polimerize no erlenmeyer antes de o
deitar fora.
Quando se tiver certificado de que o gel de concentração já polimerizou, tirar o
pente com cuidado, puxando-o para cima lentamente, para
não estragar os poços do gel.
Lavar os poços do gel com água
destilada ou com tampão de
electroforese já diluído.
Fluxograma da sandwich
Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores de 0,75 mm e os
“pentes” com mistura etanol-éter etílico (2:1, v/v) e deixar secar ao ar.
Colocar os dois espaçadores sobre a placa de vidro rectangular maior, ao longo das arestas laterais, e por
cima, em "sandwich", colocar a placa de vidro de menores dimensões, de modo a ficar rigorosamente sobre a primeira, com as extremidades inferiores dos
espaçadores e das placas bem alinhadas. Nesta altura, os
espaçadores devem ficar cerca de 5 mm saídos na outra extremidade em relação à placa de vidro maior.
Desapertar os quatro parafusos das molas da peça suporte da “sandwich”
(clamp assembly) e montá-la na bancada de modo a que os parafusos não fiquem virados para a pessoa que
manuseia o material.
De um modo firme, pegar na “sandwich” preparada
anteriormente com a placa de vidro maior afastada em relação a si e introduzi-la na peça suporte da
“sandwich”.
No final, a placa de vidro maior deve ficar encostada à
placa de acrílico da peça suporte da
“sandwich”. Apertar os dois
parafusos superiores da
montagem.
Introduzir a montagem anterior na caixa de polimerização de
modo a que os parafusos fiquem
afastados em relação a si.
Despertar novamente os dois parafusos superiores de modo a que as
placas de vidro e os espaçadores
assentem na base da caixa de
polimerização.
Insirir o cartão de alinhamento entre as duas placas de
vidro de modo a posicionar correctamente os espaçadores e, com cuidado, apertar ambos os pares de
parafusos.
Retirar o cartão de alinhamento e a peça suporte da “sandwich” da caixa de
polimerização, confirmando que as placas e os espaçadores estão perfeitamente alinhados na sua base
inferior. Se tal não acontecer, repetir os passos anteriores pois, pode ocorrer um fuga do gel durante a
sua introdução entre as placas de vidro.
Usando o nível da bolha de ar,
nivelar a caixa de polimerização.
Confirmar que as borrachas de silicone cinzentas removíveis estão limpas e completamente livres de restos de
acrilamida de modo a assegurar uma boa selagem do sistema.
Colocar as borrachas de silicone na parte superior da caixa
de polimerização.
Transferir novamente a peça suporte da “sandwich” para a caixa de
polimerização mas agora para a sua posição central. Para isso, pressionar a placa de acrílico de encontro à base da
caixa de polimerização, de modo a que as placas
de vidro assentem nas borrachas
cinzentas.
Encaixar a placa de acrílico debaixo da saliência da
caixa de polimerização empurrando as molas brancas da
montagem. Não exercer pressão
contra as placas de vidro ou
espaçadores pois poderiam partir-se.
Introduza um pente na "sandwich" até que os seus dentes fiquem totalmente
inseridos entre as duas placas de vidro.
Marcar com uma caneta um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o
nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de
separação.
Materiais, reagentes e procedimento
Tantos os materiais como os reagentes utilizados nesta experiência estão de acordo com
o protocolo experimental.
O procedimento da electroforese sofreu as seguintes modificações:
1. Á amostra P foi adicionado apenas 10μL de proteína padrão em vez de 5 μL e
95 μL de água destilada
2. As outras amostras continham 20μL de γ-globulina
3. Adicionou-se a cada amostra e à proteína padrão 20μL de tampão Tris-HCl (pH
6,8) 0,0625 M em vez dos 100μL
Tratamento de dados
SDS-PAGE
a) Apresente um esquema da separação obtida na eletroforese SDS-PAGE.
Represente a curva de calibração do gel preparado e determine a massa
molecular relativa das subunidades da γ-globulina.
No gel realizado foi aplicada proteína padrão nos poços 2 e 7, os poços 1 e 10 foram
deixados livres e sendo que nos outros foram colocadas ϒ – globulina.
Esquema do gel:
Ilustração 1 – gel de concentração de SDS-PAGE
Gel de concentração.
Altura do gel: 4 cm
Gel de resolução.
Distância migrada do
azul de bromofenol:
3,6cm
A electroforese decorreu durante 1.30 a uma voltagem de 100 V, após esse tempo,
cuidadosamente, retirou-se o gel das placas de vidro para electroforese e mediu-se a altura do
gel de concentração (4cm), assim como a distancia percorrida pelo azul de bromofenol (3,6cm).
A ilustração 1 demonstra este esquema, antes da revelação do gel.
A distância percorrida pelo azul de bromofenol (3,6cm) é utilizada para determinar os Rf
de cada risca adquirida no gel de concentração após a sua revelação (demonstrado em anexo) na
seguinte fórmula:
Para se obter a distância percorrida de cada risca da proteína padrão mede-se com uma
régua a distância de migração da banda desde o poço do gel até ao centro da mesma.
Demonstramos o cálculo utilizado para o primeiro exemplo (P3, primeira risca), pois são
realizados cálculos análogos para a determinação dos outros Rf’s:
Para traçar a recta de calibração, ainda é necessário realizar o logaritmo de cada uma das
massas moleculares relativas apresentadas na Tabela 1 que foram identificadas na amostra
padrão.
Proteína Massa Molecular
relativa (MMr) (Da)
Log10 (MMr)
(Da)
Xilanase U4 96 000 4,98
Albumina 66 000 4,82
Fosfamanose isomerase 48 000 4,68
Celulase 5 A 40 000 4,60
Celulase M9 32 000 4,51
Esterase Fam 4 de glucidos 26 100 4,41
Dominio M6 de ligação a xiloglucanos 18 500 4,27
Tabela 1 – Massa relativa dos vários componentes da proteína padrão
Assim, traçamos a curva de calibração que nos permitiu determinar, aproximadamente, as
massas moleculares relativas das bandas adquiridas nos outros poços.
Gráfico 1 – Recta de distribuição do Rf em função do log(MMr) em SDS-PAGE
Exemplificação da determinação de uma das massas moleculares relativas (exemplo
anterior):
Sendo:
Então, para
O verdadeiro valor de MMr para esta banda é
Realizando, cálculos análogos para todos os outros dados, construímos a Tabela 2
Log(MMr) (Da) MMr (Da)
P3 P4 P5 P6 P8 P9 P3 P4 P5 P6 P8 P9
4,915332 4,740629 4,740629 4,740629 4,985213 4,915332 82287,13 55033,73 55033,73 55033,73 96652,51 82287,13
4,845451 4,461104 4,461104 4,461104 - - 70056,87 28913,73 28913,73 28913,73 - -
4,740629 - - - - - 55033,73 - - - - -
4,461104 - - - - - 28913,73 - - - - -
Tabela 2 – Tabela alusiva ao Gráfico 1, cálculo das massas moleculares relativas nos diferentes poços da SDS-PAGE
Infelizmente muitos destes resultados não estam de acordo com o esperado, como é o
caso evidente da quarta risca do poço três (P3), tendo migrado exactamente o mesmo que a
Esterase Fam.4 de glúcidos, obviamente que tem de ter massa molecular relativa idêntica, ou
seja, em vez de 28913,73 deveria ser perto de 26100. Isto pode ser explicado a partir de uma
observação mais cuidada do Gráfico 1: apesar de o valor de R2
(0,9545) ser, relativamente,
próximo de 1, consiguimos inferir que a recta de distribuição escolhida não é a melhor, uma vez
que não possui nenhum dos pontos obtidos da amostra padrão, R2
possui um valor tão elevado
pois os desvios são compensados. Então, o grupo decidiu realizar um novo gráfico rejeitando
y = -0,795x + 4,0188 R² = 0,9545
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 5 5,1
Rf vs log(MMr)
quer o primeiro, quer o último pontos, visto que estão completamente desnivelados da recta.
Assim, construímos o Gráfico 2.
Gráfico 2 – Recta de distribuição do Rf em função do log(MMr) melhorado em SDS-PAGE
Os cálculos são análogos aos realizados anteriormente, à excepção que a recta utilizada
para determinar as massas relativas foi:
Então, construímos a Tabela 3, como novas e melhoradas massas moleculares relativas.
Log(MMr) (Da) MMr (Da)
P3 P4 P5 P6 P8 P9 P3 P4 P5 P6 P8 P9
4,895334 4,713875 4,713875 4,713875 4,967918 4,895334 78584,03 51745,8 51745,8 51745,8 92879,1 78584,03
4,822751 4,42354 4,42354 4,42354 - - 66489,13 26517,97 26517,97 26517,97 - -
4,713875 - - - - - 51745,8 - - - - -
4,42354 - - - - - 26517,97 - - - - -
Tabela 3 – Tabela alusiva ao Gráfico 2, cálculo das massas moleculares relativas nos diferentes poços da SDS-PAGE
Através dos dados da Tabela 3 realizou-se a recta de calibração representada no Gráfico
2. Esta é utilizada para calcular a massa molecular relativa das subunidades da ϒ – globulina.
A partir desta recta o resultado comentado anteriormente, aproxima-se muito mais do
verdadeiro (26000), 26517,97 é apenas um pouco superior, isto deve-se ao facto de, a partir da
recta de calibração, apenas obtemos resultados aproximados. Podemos, assim, assumir esta
recta, uma vez que a maioria dos resultados assemelha-se mais à realidade esperada. No entanto
a primeira risca do terceiro poço (78584,03) possui um valor para a massa relativa mais
aproximado ao real (9600) no Gráfico 1 (82287,13) do que no Gráfico 2. Uma vez rejeitado o
primeiro, resta-nos a hipótese de considerar o dado em questão um erro, devido à anulação da
risca da amostra padrão correspondente.
y = -0,7654x + 3,858 R² = 0,9983
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9
Rf vs log(MMr) melhorado
Novamente, outro exemplo que levou a preferência deste gráfico é: a segunda risca que
tem massa relativa aproximadamente semelhante a 66000, sendo muito superior a este valor
(70056,87) no Gráfico 1; porém, comparando com o Gráfico 2 esse valor decresce para
66489,13 podendo ser assumido como verdadeiro, repetidamente este não é corresponde ao
valor exacto devido à recta de calibração, que representa uma aproximação da relação entre Rf e
log(MMr) dos nossos dados.
Assim concluímos que o Gráfico 2 apresenta uma recta de calibração mais relacionada
com os nossos resultados do que a do Gráfico 1 pelo que assumimos o primeiro.
De seguida isolamos os valores de Rf e MMr retirados da Tabela 3
Rf MMr (Da)
0,11 78 584
0,17 66 489,1
0,25 51 745,8
0,47 26 518 Tabela 4 – Dados dos Rf e MMr das bandas dos poços 3 a 6
b) Discuta globalmente os resultados obtidos na técnica de SDS-PAGE em
termos da estrutura da γ-globulina.
Analisando a Tabela 4 e o gel de concentração após a resolução (em anexo) chegamos à
conclusão que a ϒ – globulina possui duas cadeias, uma leve com, aproximadamente, 26518 Da
de massa relativa e outra pesada 66489,1 Da. Tal como esperado a cadeia pesada da proteína
migrou menos que a leve, uma vez que apresentarem maior dificuldade em passar pelos crivos
do gel por possuírem maiores dimensões.
Observando, com mais cuidado, notamos que os diversos poços que contêm ϒ –
globulina apresentam diferentes números de bandas, bem como nitidez de cada. Iniciando com
os poços 3 a 6 todos a eles foi adicionado 100 mL de β-mercaptoetanol, agente que reduz as
ligações persulforeto dos polipeptídos, destruindo as suas estruturas tridimensionais. Só com a
sua adição, garantimos que todas elas têm forma linear e igual massa.
Dos poços, anteriormente considerados o P3 foi o único que não foi aquecido (100ºC),
pelo que podemos verificar que a desnaturação da ϒ – globulina não foi total e, possivelmente,
ainda continha algumas pontes dissulfito apresentando bandas com massas moleculares relativas
superiores à cadeia pesada. Os restantes (P4 a P6) foram sujeitos a aquecimento, mas com
tempos diferentes (1, 2 e 5 minutos, respectivamente). Obviamente que o P6 possui o melhor
resultado com as cadeias leve e pesada bem definidas e sem mais bandas. Este acontecimento
esperado, deve-se ao facto de a ϒ – globulina estar definitivamente desnaturada pelo que no gel
apenas observamos duas bandas bem nítidas representativas das suas cadeias. Assim, deduzimos
que quanto maior o tempo de aquecimento maior a destruição dos níveis de estrutura da
proteína.
Já para os poços 8 e 9 não foi utilizado β-mercaptoetanol pelo que não foram destruídas
as ligações persulforeto. Assim verificamos uma migração das amostras mínima uma vez que as
cadeias leve e pesada permaneceram juntas, tendo um elevadíssimo peso molecular não
atravessam os crivos do gel de concentração e, portanto, permanecem, praticamente, no poço. O
P9, apesar de ter sido aquecido (100 ºC, 5 minutos), evidenciou o mesmo resultado que o P8, o
que nos permite inferir que o aquecimento não é suficiente para quebrar as ligações em questão,
não se dando a separação das cadeias.
Focagem isoeléctrica
Ilustração 2 – gel de resolução da Focagem isoeléctrica
a) Explique o número de bandas de proteína padrão que encontrou.
Neste gel foram colocadas amostras padrão nos poços 3 e 8 e nos poços 5 (mioglobina) e
7 (BSA) solução proteica desconhecida, tal como é possível presenciar no gel de resolução
apresentado em anexo.
Após uma observação muito cuidada do mesmo, apenas conseguimos detectar onze
bandas. De inicio este resultado poderia gerar alguma confusão, uma vez que a proteína padrão
possui doze componentes diferentes, porém é o dado esperado uma vez que a Amiloglucosidase
( pH = 3,5) possui um pH inferior ao do corante, o vermelho de metilo (pH = 3,75). Isto
significa que a suposta banda correspondente ao enzima referido não ficou retida no gel.
No reservatório superior encontrava-se uma solução alcalina (NaOH 25mM) no cátodo
(pólo negativo) e no reservatório inferior colocou-se uma solução mais ácida ( Ácido acético
20mM) o ânodo (pólo positivo). Então os componentes da proteína padrão mais ácidos
migraram mais que os alcalinos. A partir desta análise podemos induzir que a Amiloglucosidase
(pH = 3,5) percorreu todo o gel, não ficando retida nele.
b) De acordo com os dados obtidos para os padrões, construa uma curva de
calibração do gel: pI da banda versus distância migrada em relação ao cátodo.
Componentes pI
Amiloglucosidase 3,50
Vermelho de metilo (corante) 3,75
Inibidor da tripsina de soja 4,55
β –lactoglobulina 5,20
Anidrase carbónica bovina B 5,85
Anidrase carbónica humana B 6,55
Banda acídica da mioglobina do cavalo 6,85
Banda básica da mioglobina do cavalo 7,35
Banda acídica da lectina da lentilha 8,15
Banda central da lectina da lentilha 8,45
Banda básica da lectina da lentilha 8,65
Tripsinogénio 9,3
Tabela 5 – pontos isoeléctricos dos componentes do Broad p/ Calibration Kit da Amersaham BioSciences
Gráfico 3 – Relação entre a distância migrada das diferentes proteínas em função dos seus pontos isoeléctricos
Uma análise delicada do Gráfico 3 e da Tabela 5 leva-nos a deduzir que apesar do
elevado R2 conseguido a recta de calibração não retrata a realidade mas uma aproximação à
mesma. Isto porque segundo a recta os componentes da amostra padrão, cujos pontos
isoeléctricos são conhecidos, teriam valores ligeiramente diferentes dos tabelados. Contudo esta
aproximação é razoável pelo que considerámos ao longo do relatório como verdadeira.
y = -0,9124x + 9,0422 R² = 0,9805
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8 10
pI da banda vs Distância migrada em relação ao cátodo
c) Determine o valor de pI das proteínas estudadas a partir da curva de
calibração anterior.
Após a obtenção da recta de distribuição, calculámos os pI das diferentes bandas
utilizando a equação reduzida da recta:
Demonstração de um cálculo efectuado para o poço dois (P5) primeira banda (0,5cm):
Realizando esta equação para todas as outras bandas construímos a seguinte tabela:
Poço Amostra Distâncias migradas
em relação ao cátodo pI pI da proteína
3 BSA
0,5
2,8
3,2
3,2
3,5
3,7
4,2
9,36
6,84
6,51
6,40
6,07
5,86
5,31
5,86
4 γ-Globulina 2,7 6,95 6,95
5 Lisozima 0,3 Fora da gama* 9,58
6 Tripsina 3,0 6,62 6,62
7 Mioglobina
1,4
1,8
2,1
2,3
2,5
2,8
3,1
8,38
7,94
7,61
7,39
7,17
6,84
6,51
7,17
8 Citocromo c 0 Fora da gama* 9,90
9 Fosfatase ácida
2,5
2,8
3,0
3,3
3,5
3,7
4
5,6
7,17
6,84
6,62
6,29
6,07
5,86
5,53
3,77
6,29
Tabela 6 - Tabela alusiva ao Gráfico 3, cálculo dos pontos isoeléctricos dos dois poços na Focagem isoeléctrica
*NOTA: o citocromo c e o lisozima não apresentam pontos isoeléctricos dentro da gama de pH
do gel pelo que praticamente não migram nos mesmo mantendo-se nos poços, onde foram
colocados.
Os valores escolhidos para o pI de cada proteína teve em consideração a banda de
maiores dimensões, isto é a que estava mais conecentrada poir esse valor de pH deverá
aproximar-se mais do verdadeiro ponto isoeléctrico da proteína.
d) Discuta os resultados e compare os valores obtidos com os pI calculados para
as proteínas estudadas a partir da sua sequência de resíduos de aminoácidos
(consulte uma base de dados de proteínas (http://www.expasy.org/ )). Comente os
possíveis desvios observados.
Proteína Valores tabelados Valores experimentais
BSA 5,82 5,86
ϒ - globulina 6,85 6,95
Lisozima 9,36 9,58
Tripsina 6,08 6,62
Mioglobina 7,2 7,17
Citocromo c 9,59 9,90
Fosfatase Ácido 6,29 6,29
Tabela 7 – valores tabelados dos pontos isoeléctricos das proteínas utilizadas no gel de resolução
Tal como podemos verificar pela Tabela 7 a grande maioria dos nossos resultados não
só se assemelham aos verdadeiros como tomam exactamente o mesmo valor, pelo que
consideramos que esta experiencia foi realizada com enorme rigor e precisão levando-nos a
pouquíssimos erros. No entanto estes não podem ser desvalorizados e, portanto, tomamo-los em
consideração: principalmente os de paralaxe em medições de volumes e também no
manuseamento do material. Quanto à qualidade das amostras resta-nos apenas assumir que se
encontram puras, todavia podem ter sido responsáveis pelos pequenos desvios obtidos. É apenas
de salientar as amostras de Tripsina e Citocromo c. Estes desníveis poderão estar associados à
recta de calibração e não necessariamente a pureza das amostras.
Os elementos do grupo tiveram alguma dificuldade em observar as bandas dos poços 4
(ϒ - globulina) e 6 (Tripsina) e, em vez de reparar nas supostas riscas, ainda dentro dos poços 5
(Lisozima) e 8 (citocromo c) não avistamos nenhuma deduzindo que aí se encontravam, visto
que o nosso gel de resolução se encontrava ligeiramente danificado.
Conclusão:
Electroforese em gel é uma tecnica que tem em consideração a migração de espécies
carregadas eletricamente, quando dissolvidas ou suspensas num eletrólito, cujo é aplicado uma
corrente eléctrica. As moléculas são separadas consoante a sua relação carga/massa, quanto
menor esta for menor será a distância percorrida pela devida molécula no gel. Esta tecnica é,
geralmente, utilizada na separação de proteínas ou moléculas de DNA e RNA.
Para este tabalho laboratorial foi utilizada a eletroforese em gel de poliacrilamida na
presença de dodecilssulfato de sódio (SDS). Este método é muito utilizado para a análise de
massas moleculares de proteínas oligoméricas. A poliacrilamida é uma mistura de dois
polimeros: acrilamida (molécula linear) e bisacrilamida (molécula em forma de “T”); onde a sua
mistura dá origem a uma rede, o gel. Este é uma matriz constituída por um polímero de
acrilamida com ligações cruzadas de N, N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malha pode
ser escolhida. Quanto maior a concentração de acrilamida, menores serão os poros da malha
formada, podendo-se, então, criar diferentes gradientes de separação alterando as concentrações
usadas de cada uma das moléculas referidas.
Antes de iniciar a SDS-PAGE, as diferentes cargas, nativas de cada proteína, devem ser
eliminadas para que esta separação dependa apenas da sua massa molecular. Então, as proteínas
são misturadas com SDS. Este detergente desnaturante confere às proteínas umas estrutura
linear (a forma nativa é geralmente globular) e densidade de carga uniforme. Isto é acontece
devido a duas características muito importantes desta substância química: ser alifático, possui
uma região hidrólilica, que forma interacções fracas com a água, e outra hidrofóbica, que
interage com as cadeias polipeptídicas tornando todas as proteínas negativamente carregadas
anulando, deste modo, a razão carga/massa referida precedentemente; e ser aniónico, possui
elevada carga negativa, podendo transferi-las para as devidas cadeias.
Na preparação das amostras colocámos, em 6 (incluíndo as duas amostras padrão), com
β-mercaptoetanol, agente que reduz as ligações persulfureto da ϒ – globulina, destruindo a sua
estrutura quaternária. Só com a sua adição, garantimos que todas elas têm forma linear e igual
massa, uma vez que para as outras duas amostras este agente não foi colocado não se verificou
separação entre cadeias leve e pesada.
Após esse tratamento, as proteínas são aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e
submetidas a uma corrente elétrica (100V), fazendo com que elas migrem através da malha em
direção ao polo positivo, o anôdo. Dependendo do seu tamanho, cada proteína se moverá
diferentemente: as proteínas menores migrarão mais rapidamente, enquanto que as maiores
terão mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se ficarão presas no mesmo.
Na Focagem isoeléctrica a diferença entre as proteínas a separar numa amostra foca-se
nos, respectivos pontos isoeléctricos. Todas as proteínas possuem uma carga nativa que pode ser
positiva, negativa ou nula dependendo do pH do meio, quando não possuem carga o respectivo
pH denomina-se ponto isoeléctrico (pI).
Quando uma proteína é colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o
gradiente de pH é estabelecido pela mistura de soluções tampão especiais (NaOH 25mM e
CH3COOH 20mM) e sujeita a um campo eléctrico (200V) irá inicialmente mover-se em
direcção ao eléctrodo com carga oposta à da proteína, nesta experiência encaminharam-se para o
cátodo.
Durante a migração através do gradiente de pH, a proteína irá captar ou perder protões.
Enquanto a proteína migra a sua velocidade vai diminuindo até chegar ao ponto em que o valor
de pH será igual ao seu pI. Neste ponto a proteína terá carga total neutra e como consequência
deixa de migrar, ficando retida no gel. Se a proteína se difundir para uma região fora do seu pI,
irá adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posição onde é globalmente
neutra, é devido a este fenómeno que se encontram diversas bandas em cada zona do gel. Esta
pode ter grupos ionizados, mas globalmente é neutra.
Concluindo ambas as técnicas utilizadas são bastante eficazes para a determinação das
proteínas utilizadas, apesar de serem métodos de comparação.
Bibliografia http://www.ufrgs.br/leo/eletroforese/policrilamida.htm
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel
http://www.expasy.org
http://kdbio.inescid.pt/~atf/bioinformatics.ath.cx/bioinformatics.ath.cx/index09c3.html?id=11
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