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Interbio v.11 n.2, Jul-Dez, 2017 - ISSN 1981-3775
SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DO CHÁ VERDE
(Camellia sinensis)
ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND TOXICITY OF GREEN TEA (Camellia sinensis)
SCHMITZ, Wanderlei Onofre 1; ESTEVÃO, Dirceu 2; CECCHINI, Rubens 2; FERREIRA,
Dalva Trevisan 5; CAVASSIN, Emerson D. 4; SAITO, Alexandre 2; SARIDAKIS, Halha
Ostrensky 3
Resumo
Vários estudos vem sendo desenvolvidos para comprovar as atividades terapêuticas do chá verde (Camélia sinensis
L). Seus componentes, flavonóides e catequinas, que apresentam atividades: antioxidante, quimioprotetora,
antiinflamatória, anticarcinogênica e antibacteriana. Este trabalho tem por objetivo avaliar o mecanismo de ação do
extrato do chá verde (ECV), como agente antibacteriano e avaliar sua toxicidade. Para testar a atividade
antibacteriana foram utilizandas 07 bactérias padrão e bactérias de origem hospitalar: Escherichia coli ATCC 25922,
Klebsiella pneumoniae ATCC 70063 -lactamase positiva, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 23212 e 22 cepas S. aureus sendo 11 sensíveis a oxacilina (MSSA) e 11 resistentes a
essa droga (MRSA), isoladas de pacientes do Hospital Universitário de Londrina-PR. Nos testes de atividade
hemolítica foram utilizados eritrócitos humanos e nos testes de hepatotoxicidade foram utilizados ratos submetidos
por via oral a dose única de ECV (120 mg/Kg). Os resultados indicam que o chá verde apresenta atividade
antibacteriana e ao mesmo tempo baixa toxicidade, na dose testada.
Palavras chaves: Camellia sinensis, Chá Verde, flavonóides, catequinas, antibacteriano, toxicidade.
Abstract
Several studies have been developed to prove green tea (Camellia sinensis L) therapeutic activities. Tea components, flavonoids and catechins present activities: antioxidant, chemoprotector, anti-inflammatory, anticarcinogenesis and
antibacterial. The work’s objective is evaluate the green tea extract (ECV) mechanism of action, as antibacterial
agent and evaluate it toxicity. To antibacterial test activity were used 07 reference bacteria strain and hospital
bacteria: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063 -lactamase producer, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 14028,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 23212 and 22 strain S. aureus 11 oxacillin
susceptible (MSSA) and 11 oxacillin resistant (MRSA), isolated from patients of the University Hospital of
Londrina-PR. For the tests of hemolytic activity in human erythrocytes and the hepatotoxicity tests in rats oral dose
were used (120 mg/Kg). The results indicate that the green tea presents antibacterial activity and at the same time
low toxicity, in the tested dose.
Key words: Camellia sinensis, Green Tea, flavonoids and catechins, antibacterial, toxicity.
1Doutor em Ciências da Saúde, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil. 2Departamento de Ciências Patológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil
3Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil.
4Departamento de Ciências da Saúde, Hospital Universitário de Londrina, Londrina-PR, Brasil
5Departamento de Química, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil
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Interbio v.11 n.2, Jul-Dez, 2017 - ISSN 1981-3775
SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.
Introdução
A bebida conhecida como chá é uma
infusão da planta Camellia sinensis L. Nos
países orientais é mais consumida na forma de
chá verde e a grande maioria dos estudos são
realizados com esta forma de chá. Além da
sua qualidade de estimulante leve e de
provocar a sensação de bem estar, muitos
componentes importantes, principalmente os
polifenóis, podem contribuir para suas
propriedades farmacológicas de antioxidante,
anti-radicais livres, quimioprotetor, anti-
cancerígeno, antiinflamatório, antialérgico,
hipocolesterolemiante, promotor imunológico,
quelante de metais, capacidade de se
complexar com macromoléculas (proteínas e
polissacarídeos), ação antibacteriana e
antiviral. Estas propriedades farmacológicas
estão diretamente relacionadas com a
estrutura química das catequinas e flavonóides
(COOK, SAMMAN, 1996; ANGHILERI,
THOUVENOT, 2000).
O chá verde contém as catequinas:
epicatequina (EC), epigalocatequina (EGC),
galato-3-epicatequina (ECG), galato-3-
epigalocatequina (EGCG) e flavonóides
(kempferol, quercetina, miricetina) que são os
principais componentes químicos terapêuticos
da C. sinensis. Outros componentes do chá
verde são: xantinas (cafeína, teofilina,
teobromina), teoflavinas (teoflavina, teo-
flavina-3-galato, teoflavina-3'-galato, teoflavi-
na-3,3'-digalato), taninos e saponinas
(teosaponinas). As catequinas correspondem a
aproximadamente 25% dos compostos
derivados das folhas secas do chá verde
(RICE-EVANS, MILLER, PAGANGA,
1996; ZUANAZZI in SIMÕES et al., 2002).
Embora, possua uma série de
atividades benéficas para o organismo, o chá
pode apresentar efeitos tóxicos. Apesar de
possuir menos cafeína que o café, sua
ingestão em excesso pode causar efeitos
colaterais como: insônia, estado de vigília,
nervosismo e taquicardia em indivíduos
sensíveis (MELLO; SANTOS in SIMÕES et
al., 2002). Devido a capacidade de se
complexar com íons metálicos, pode reduzir a
absorção do ferro (COOK, SAMMAN, 1996).
As folhas do chá verde apresentam altas
concentrações de alumínio e altas
concentrações de alumínio no sangue são
encontradas na doença de Alzheimer’s. No
entanto os países com alto consumo de chá
não apresentam altos índices de doença de
Alzheimer’s (TREVISATO, 2000). As
catequinas, assim como outros flavonóides,
podem sofrer oxidação e gerar radicais livres
(superóxido e peróxido de hidrogênio) através
da reação de Fenton (URIOS et al., 2003;
NAKAGAWA et al., 2002). Estes radicais
livres podem levar a lipoperoxidação de
membranas e lesão celular. A dosagem do
malondialdeido acético (MDA) e do
complexo ferro-xilenol laranja, são capazes de
medir a lipoperoxidação de membrana. A
lesão celular pode ser avaliada pela dosagem
de transaminases (AST/ALT) e o
histopatológico possibilita identificar qualquer
alteração morfológica das células.
Para compreender a toxicidade das
catequinas é preciso conhecer sua absorção,
distribuição e metabolismo, pois é em função
destes dados é que poderemos tecer uma
estratégia de uso terapêutico destes
compostos. Chen et al. (1997), propôs que a
EGCG é a fração mais rapidamente absorvida,
distribuindo se por todos os tecidos e
possuindo um tempo de meia vida maior que
das outras catequinas. Cai et al. (2002a)
verificaram que as baixas concentrações
sanguíneas das catequinas se devem a rápida
difusão tecidual e não ao efeito de primeira
passagem. Lee et al. (2002) demonstraram
tempos de meia-vida de 3.4 h para EGCG, 1.7
h para EGC e 2.0 horas para EC. Já Warden et
al. (2001) avaliaram a biodisponibilidade das
catequinas, em humanos e verificaram que as
concentrações plasmáticas de EGC, EC e
EGCG apresentaram picos em
aproximadamente 5 h. Portanto o baixo tempo
de meia-vida, sua baixa disponibilidade
plasmática e o rápido metabolismo das
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catequinas, constituem um problema para o
usa do chá verde como agente terapêutico.
O objetivo deste trabalho é avaliar a
atividade antibacteriana do extrato etanólico
de chá verde (ECV) frente a diferentes
espécies de bactérias, em particular
Staphylococcus aureus, em doses não tóxicas
ou com toxicidade.
Ação Antibacteriana
Vários mecanismos são propostos para
explicar a atividade antibacteriana do chá
verde: inibição de síntese protéica da PBP2,
lesão de parede celular por inibição das
autolisinas e lesão de membrana através de
radicais livres (YAM, HAMILTON-MILLER,
SHAH, 1998, HAMILTON-MILLER, SHAH,
1999; ARAKAWA et al., 2004).
Com o objetivo de esclarecer a
atividade antibacteriana do chá muitos estudos
têm sido realizados. Já Toda et al. (1989)
descreveram a ação antibacteriana do chá
verde contra Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Salmonella
typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella
enteritidis, Shigella flexneri, Shigella
dysenteriae, e Vibrio cholerae. Kubo, Muroi e
Himejima (1992), descreveram a ação
antibacteriana dos 10 principais óleos voláteis
do chá, contra Streptococcus mutans,
Propionibacterium acne, Pseudomonas
aeruginosa, Enterobacter aerogennes e
Escherichia coli. Foi ainda descrito que a
fração EGCG do chá verde, mostrou atividade
bacteriostática contra E. coli O157:H7
(enterohemorrágica) (OSAWA et al., 1999).
Bactérias isoladas de saliva e dentes
cariogênicos de humanos (Streptococcus
salivarius e S. mutans) foram testadas frente
ao chá verde e os autores observaram ação
inibitória do crescimento bacteriano
(RASHEED, HAIDER, 1998). Hamilton-
Miller (2001) demonstrou que vários
componentes do chá verde têm atividade
antibacteriana contra S. mutans e S. sobrinus e
impedem a aderência destas bactérias aos
dentes, sugerindo seu uso na prevenção de
cáries.
Yee, Koo e Szeto (2002) verificaram
que pacientes com consumo alto de chá verde
apresentam baixa taxa de infecção por
Helicobacter pilori, quando comparados com
pacientes que consomem pouco ou nenhum
chá (45% e 74% respectivamente).
TAKABAYASHI et al. (2004) administraram
20 mg/mL de chá verde diariamente, durante
10 dias a cobaias infectados com H. pilori.
Após esse tempo, os estômagos eram retirados
e amostras cultivadas, obtendo assim a
contagem de unidades formadoras de colônias
(CFU). O numero de CFU diminuiu
significativamente após o tratamento,
sugerindo efeito antibacteriano do chá em
infecção por H. pilori.
Vários componentes do chá
apresentam atividade antibacteriana,
especialmente contra S. aureus resistentes a
meticilina (MRSA). Em 1999, SHIOTA et al.
demonstrou ação sinérgica do chá verde com
a oxacilina em S. aureus MRSA e em cepas
de bactérias produtoras de -lactamase. Este
fenômeno pode ser explicado pela prevenção
de síntese de proteínas ligantes de penicilina
(PBP2) e inibição de secreção de -
lactamases respectivamente. West et al.
(2001) também relataram a capacidade do chá
verde de inibir o crescimento de S. aureus
MRSA e MSSA. Hamilton-Miller e Shah
(2000) isolaram um novo princípio ativo,
patenteado e chamado por eles de composto
“P”, que mostrou atividade contra S. aureus
MRSA.
Existe uma relação direta entre a
estrutura química dos flavonóides e
catequinas e sua atividade antibacteriana.
Aparentemente, flavonóides e catequinas com
dihidroxilação nas posições 2’- 4’ ou 2’- 6’ no
anel B e dihidroxilação nas posições 5-7 no
anel A apresentam maior atividade
antibacteriana contra S. aureus MRSA
(STAPLETON. TAYLOR, 2002). Uma
possível explicação para estes dados é que as
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catequinas possuem capacidade de se
complexar com membranas lipoprotéicas,
principalmente ECG e EGCG que são
melhores incorporadas as membranas
fosfolipídicas. A ação de altas concentrações
das catequinas pode causar lesão as estruturas
da membrana celular, desestabilizando a
membrana levando a atividade antibacteriana
(CATURLA et al., 2003).
Lee et al. (2003) realizaram um estudo
com bactérias patogênicas incluindo S. aureus
MRSA, S. aureus resistente a ciprofloxacina,
Enterococcus resistente a vancomicina e de P.
aeruginosa resistente a ciprofloxacina e
obtiveram atividade antibacteriana em
concentrações de 1.6 mg/mL para todas as
bactérias testadas. Os resultados obtidos por
diferentes autores sugerem que a ação
antibacteriana do chá verde pode ser eficiente,
no entanto, há necessidade de maiores estudos
para definir sua aplicação segura como
fármaco e/ou como inibidor da atividade
enzimática das -lactamase e outras enzimas
responsáveis pela resistência aos
antimicrobianos.
Material e Métodos
Reagentes
Agar e Caldo Muller-Hinton, TSB e
TSA (Tryptose Soy Broth and Agar),
oxacilina, alcool etílico absoluto, folhas secas
de C. sinensis, bactérias padrão: E. coli ATCC
25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063
(produtora de -lactamase), Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883, P. aeruginosa
ATCC 27853, S. typhimurium ATCC 14028,
S. aureus ATCC 25923 e Enterococcus
faecalis ATCC 23212, 22 cepas de S. aureus,
Dietilnitrosamina (DEN), Cloreto férrico
1mM (FeCl3), ácido ascórbico 1mM, butanol
pureza HPLC, tampão Fosfato de K+
monobásico com NaCl 0,9% 10mM, Ácido
Tiobarbitúrico 1% (TBA), Sulfato de Ferro
(FeSO4 1mM), Ácido Sulfúrico H2SO4
(1mM), Xilenol Laranja (1mM), Metanol
HPLC, Hidroperóxido de Cumeno (CHP),
Tampão fosfato de K+ monobásico com NaCl
0,9% 10mM, papa de hemácias humanas de
doadores saudáveis, ECV dissolvido em
solução tampão fosfato de K+ monobásico
com NaCl 0,9% 10mM com pH de 7,4
(27mg/mL).
Preparo do Extrato das Folhas de C.
sinensis
O extrato etanólico de chá verde
(ECV) foi preparado a partir de folhas secas
de C. sinensis, adquiridas da Quimer Ervas
Medicinais. O extrato foi filtrado em papel de
filtro e concentrado em rota vapor, sendo
posteriormente utilizado em diferentes
concentrações adequadas aos vários testes
realizados.
Animais
Foram utilizados ratos Wistar machos
(·200g), divididos em dois grupos (n=6),
grupo G1 (controle negativo) e grupo G2
tratado com dose única via oral de ECV (120
mg/Kg). Os animais foram alojados em
gaiolas com temperatura, umidade relativa do
ar e ciclo de luz controlados com dieta sólida
e líquida ad libitum. O sangue dos animais foi
coletado por punção cardíaca e o soro
separado através de centrifugação a 2.500rpm
por 15 min. Os animais foram sacrificados,
por deslocamento cervical, os fígados
retirados para dosagem de Malondialdeido
Acético (MDA), Complexo de Fe(III)-Xilenol
Laranja e estudo histopatológico (HWA et al.,
2000; JUN et al., 2002; BAHAR, TAWFEQ,
ABU, 2003).
Protocolo Experimental
No protocolo experimental para os
ratos tratados com dose única de ECV (120
mg/Kg), foram utilizados ratos Wistar machos
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(·200g), sendo divididos em dois grupos (n =
6), sendo o grupo G2 tratado com dose única
de ECV (120 mg/Kg) e sacrificado em 24 hs
após dose única de DEN (200mg/Kg).
Animais tratados com dose única de ECV (120 mg/Kg)
0 Horas 24 Horas
G 1 (Controle)
0 Horas 24 Horas
G 2 (ECV 120 mg/Kg de animal)
Sacrifício
Salina
ECV (120 mg/Kg de animal)
Teste de Susceptibilidade
Foram utilizadas 07 bactérias padrão:
E. coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae
ATCC 70063 (produtora de -lactamase),
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, P.
aeruginosa ATCC 27853, S. typhimurium
ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923 e
Enterococcus faecalis ATCC 23212. O ECV
foi adicionado ao agar Muller-Hinton (MHA)
fundido e resfriado a 40C e vertido em placa
de Petri estéril (Técnica de Pour-plate). O
crescimento bacteriano (na fase logarítmica)
obtido após 3 h a 36 C, foi diluído e
alíquotas de 10·l das diluições foram
dispersadas sobre a superfície do meio +
ECV, de forma a obter um numero de
colônias passíveis de contagem. Como
controle de crescimento das bactérias foi
utilizado MHA sem adição de ECV. Todos os
testes foram realizados em duplicata. A leitura
foi realizada após incubação a 36 C por 12
hs, comparando o numero de UFC das placas
com ECV em relação ao controle.
Teste de Susceptibilidade de S. aureus
Foram utilizadas 22 cepas S. aureus,
11 meticilina-resistente (MRSA) e 11
meticilina-sensível (MSSA). As amostras
foram isoladas de pacientes provenientes do
Hospital Universitário (HU) de Londrina. A
metodologia utilizada foi a do experimento
anterior.
Determinação do Efeito Bactericida e/ou
Bacteriostático do ECV
As amostras de S. aureus acima
citadas foram cultivadas em caldo Muller-
Hinton (MHB) acrescido de diferentes
concentrações de ECV, associado ou não a
oxacilina (6 g/mL). Os testes e os controles
foram incubados a 36 C por 12 hs. A
avaliação da inibição do crescimento foi
realizada por comparação com os controles
negativo (sem ECV) e positivo (com
oxacilina). Uma alíquota de cada tubo foi
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plaqueada em MHA sem extrato para verificar
a atividade bactericida ou bacteriostática do
ECV e se a associação com oxacilina alterou
estas propriedades. As placas foram incubadas
a 36 C por 12 hs.
Curva de Crescimento Bacteriano
Foram selecionadas as amostras 6R S.
aureus MRSA e 6S MSSA, para curva de
crescimento em TSB (Tryptose Soy Broth)
acrescido ou não de ECV (1.000 g/mL). O
inóculo das bactérias foi preparado na fase
logarítmica, obtido após cultivo por 3 h a 36
C, o inóculo foi diluído para se obter a
concentração de 2 x 106 CFU/mL, 1 mL desta
diluição foi inoculado em 149 mL de TSB,
mantido em banho-maria a 36 C com
agitação. Uma alíquota de 3 mL foi retirada
dos frasco em cada um dos tempos 0, 2, 4, 6 e
12 hs, sendo 1 mL desta alíquota diluída em
9mL de salina estéril, sendo realizadas
diluições seriadas.
Estas diluições foram semeadas em
placa de Petri com TSA (Tryptose Soy Agar)
estéril utilizando alça de Drigalsky, para
contagem de colônias viáveis. As placas
foram incubadas a 36 C por 12 hs. Os 2 mL
restantes da cultura foram levados para leitura
em espectrofotômetro (Varian 634 S) de
duplo feixe a 600nm, à temperatura ambiente,
obtendo a densidade óptica dos pontos da
curva de crescimento.
Determinação da Toxicidade Celular do
ECV em Hemácias Humanas
Foram utilizados dois frascos o
primeiro com 300L de papa de hemácia +
tampão fosfato (vol. final 30 mL), no segundo
papa de hemácia + tampão fosfato e 600L de
ECV (0,54 mg/mL de ECV). Uma alíquota de
3mL foi retirada a cada hora durante 6 hs, os
frascos ficaram em banho-maria a 37C, com
agitação de 7,5. A alíquota foi centrifugadas
por 5 min. a 2000rpm e o sobrenadante
retirado para leitura de hemólise em 540nm
(espectrofotômetro Varian 634 S) (ZHANG et
al., 1997; LENFANT, et al., 2000).
Dosagem das Enzimas AST e ALT
Analisaram-se as atividades das
enzimas aspartato e alanina aminotransferase
(AST/ALT) no soro dos animais através do
método de Reitman e Frankel (1957),
utilizando-se kits comerciais.
Dosagem de MDA
Os fígados pesados foram transferidos
para uma solução tampão fosfato de K+
monobásico com NaCl 0,9% 10mM na
proporção de 10mL de solução para cada 100
mg de fígado. Foram homogeneizados durante
30 seg. em homogeneizador ultra-turrax, sob
banho de gelo. O homogenato foi utilizado
para dosagem de MDA. O método de
dosagem de MDA foi utilizado para a
quantificação de lipoperóxidos formados.
A leitura da fase orgânica foi realizada
à temperatura ambiente em espectrofotômetro
(Varian 634 S) de duplo feixe de 535 a
572nm. Os níveis de lipoperoxidação são
expressos em nmoles de malondialdeído/g de
fígado (BUEGE, AUST, 1978; JENTZSCH et
al., 1990 modificado por CECCHINI et al.,
1990).
Dosagem de Xilenol Laranja
O método do Xilenol foi utilizado para
a quantificação de lipoperóxidos. Cada 100mg
de fígado foi homogeneizada em 10mL de
metanol HPLC, sob banho de gelo. Os tubos
foram centrifugados a 2.000g por 10 min em
centrifuga refrigerada (Janetzki K24), o
sobrenadante foi usado como amostra. Os
testes foram incubados por 24 h. a
temperatura ambiente. A leitura foi em 560nm
(Varian 634 S), após adicionou-se CHP e
incubado por 30 min. a temperatura ambiente
e ler novamente a 560nm. Os níveis de
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lipoperoxidação são expressos em nmoles de
CHP/g de fígado (HERMES-LIMA et al.,
1995).
Estudo Histopatológico em Fígado de Ratos
Os animais foram sacrificados por
deslocamento servical e os fígados removidos
e lavados com salina normal. Para o estudo
histopatológico foi utilizado um corte
transversal do lóbo medial, processado e
emblocados em parafina. Cortes de 5 m
foram feitos e posteriormente corados com
hematoxilina e eosina e observados ao
microscópio óptico.
Análise estatística
As análises descritivas de todas as
variáveis estudadas estão apresentadas como
média e o erro padrão da média (SE).
Empregando-se programa de análise
estatística computadorizada STATISTICA 6.0
(STAT SOFT), a comparação entre os grupos
foi realizada pela análise de variância
paramétrico (ANOVA), Teste T-Studant e
Teste de Tukey (HSD) para amostras
variáveis independentes. Todas as conclusões
estatísticas foram efetuadas em nível de 5%
de significância.
Resultados e Discussão
Na Tabela 1, podemos observar a ação
do ECV na inibição de crescimento das
bactérias padrão (104 UFC/mL), as bactérias
apresentam suscetibilidades diferentes ao
ECV, mesmo em doses diferentes o extrato
foi capaz de inibir o crescimento dessas
bactérias. O S. aureus, dentre as bactérias
testadas foi o mais sensível, apresentando
inibição total do crescimento na concentração
de 1.000 g/mL. Já a E. coli foi a mais
resistente sendo inibida parcialmente na
concentração de 4.000 g/mL, concentração
esta que inibiu totalmente as outras bactérias.
Pelos resultados observados o ECV
apresenta melhor atividade em bactérias gram
positivas, isso pode indicar que o fato da
diferença das paredes dessas bactérias esteja
diretamente associado ao mecanismo de ação
do ECV.
Um possível mecanismo de ação das
catequinas é devido a sua capacidade de se
ligar a peptídeos, pois a parede das bactérias
gram positivas são ricas em peptideoglicano e
em compensação a parede das gram negativas
ricas em lipopolissacarideos, e é
provavelmente devido a esta diferença que as
catequinas agem com maior eficiência em
bactérias gram positivas (ZHAO et al., 2001;
HU et al., 2001).
Devido a sua especial sensibilidade ao
ECV testes com concentrações menores foram
realizadas com cepas S. aureus MRSA e
MSSA. Os resultados se encontram na Tabela
2, onde pode se observar que o ECV é
aparentemente mais eficaz na inibição do
crescimento de bactéria MRSA, pois na
concentração de 750 g/mL 100% das
bactérias foram inibidas total ou parcial, já
todas as MSSA foram 100% resistentes ao
ECV, nestas concentrações, portanto a
Concentração Inibitória Mínima (MIC) foi de
750 g/mL para os MRSA e de 1.000 g/mL
para os MSSA.
O mecanismo de ação do ECV pode
ser através da desestabilização da sua parede
celular se ligando aos peptídeos, mas a
aparente ação especifica sobre MRSA, podem
estar diretamente ligado as alterações
encontradas na sua parede como a expressão
de PBP2 que é produzida pelo MRSA e que
permita esta bactéria “escapar” da ação do
oxacilina, por tanto as catequinas podem ter
uma ação mais especifica as bactérias que
expressem PBP2 (YAM et al., 1998).
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Tabela 1 – Teste de inibição de crescimento de bactérias padrão. Foram utilizadas bactérias (104 UFC/mL), sendo o
ECV adicionado ao MHA em placa de Petri e alíquotas foram dispersadas sobre a superfície do MHA + ECV, os testes foram realizados em duplicata e o resultado foi por comparação com o controle negativo. (I - inibição total do
crescimento 100%; IP - inibição parcial do crescimento 99 -50%; R – Resistente inibição inferior a 50%)
Inibição do Crescimento de Amostras de S. aureus MSSA e MRSA em Presença de
Diferentes Concentrações de ECV
ECV
750 g/mL 1.000 g/mL 1.500 g/mL
Inibição Total (I) 0/11S
8/11R
3/11S
11/11R
11/11S
11/11R
Inibição Parcial (IP) 0/11S
3/11R
4/11S
0/11R
0/11S
0/11R
Resistência (R) 11/11S
0/11R
4/11S
0/11R
0/11S
0/11R
Tabela 2 - Teste de inibição de crescimento de S. aureus MRSA e MSSA. Foi utilizadas cepas isoladas de pacientes
do Hospital Universitário, (11-MRSA) e (11-MSSA), na concentração de 104 UFC/mL, sendo o ECV adicionado ao
MHA em placa de Petri e alíquotas foram dispersadas sobre a superfície do MHA + ECV, os testes foram realizados
em duplicata e o resultado foi por comparação com o controle negativo.
Inibição do Crescimento de Amostras de Bactérias Padrões em Presença de Diferentes
Concentrações de ECV
ECV
Bactérias 1.000 g/mL 2.000 g/mL 3.000 g/mL 4.000 g/mL 5.000 g/mL
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 27853
R
I
I
I
I
Escherichia
coli
ATCC 25922
R
IP
IP
I
I
Klebsiella
pneumoniae
ATCC 13883
IP
I
I
I
I
Klebsiella
pneumoniae
ATCC 70063
IP
IP
I
I
I
Staphylococcus
aureus
ATCC 25923
I
I
I
I
I
Salmonella
tiphymurium
ATCC 14028
IP
I
I
I
I
Enterococcus
faecalis
ATCC 23212
R
IP
IP
I
I
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0 2 4 6 8 10 12
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
bbb
b
a
a
a
a
A
a **
** ** **
CF
U / m
L (
log
10
)
Time (hr)
S
S + ECV
0 2 4 6 8 10 12
5
6
7
8
9
10
11
12
bbb
b
a
a
a
a
B
**
** ** **
a
CF
U / m
L (
log
10
)
Time (hr)
R
R + ECV
0 2 4 6 8 10 12
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
b
b
a
a
a
D
a
a
CF
U / m
L (
log
10)
Time (hr)
S
R
0 2 4 6 8 10 12
4,75
5,00
5,25
5,50
5,75
6,00
6,25
C
aaaa
ba
CF
U / m
L (
log
10
)
Time (hr)
S + ECV
R + ECV
Pelos resultados já obtidos sabe-se que
o ECV age muito bem sobre o S. aureus, mas
para saber se ter uma visão mais dinâmica de
como seria este efeito optou-se por uma Curva
de Crescimento Bacteriano (Fig. 1). Para a
curva selecionou se uma cepa de cada grupo
(6R/6S). As bactérias foram inoculadas em
TSB acrescido ou não de ECV. Uma alíquota
foi retirada nos tempos 0, 2, 4, 6 e 24 hs, estas
alíquotas foram diluída e semeadas em TSA,
para contagem de colônias viáveis. As curvas
de crescimento marcadas com a letra a e b
demonstram claramente serem diferentes
entre si e o efeito bacteriostático do ECV
sobre as cepas bacterianas, foi
estatisticamente significativo (** p<0,01). O
ECV inibe o crescimento das bactérias, mas
aparentemente não tem capacidade bactericida
sobre as bactérias testadas, este fato
confirmaria a ação das catequinas como
agentes desestabilizadores que impediriam a
divisão das bactérias, mas não seria capaz de
provocar sua morte.
Figura 1 - Curva de Crescimento Bacteriano Associado ou Não ao ECV. Foram selecionadas S. aureus MRSA e MSSA (2 x 106 CFU/mL), que foram inoculadas em 149 mL de TSB (Tryptose Soy Broth) acrescido ou não de ECV
(1.000 g/mL). Uma alíquota foi retirada nos tempos 0, 2, 4, 6 e 12 hs. Sendo semeadas para contagem de colônias viáveis. A Curva de crescimento da cepa S. aureus 6S em presença e ausência de ECV. B Curva de crescimento da
cepa S. aureus 6R em presença e ausência de ECV. C Curva de crescimento da cepa S. aureus 6S e 6R na presença
de ECV. D Curva de crescimento da cepa S. aureus 6S e 6R na ausência de ECV. (** p<0,01, os pontos das curvas
marcadas com a letra a e b são diferentes entre si).
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Determinação do Efeito Bactericida e/ou Bacteriostático do ECV Associado a Oxacilina (6 g/mL) em S.
aureus MRSA
ECV Oxacilina
(6 g/mL)
1.000 g/mL
+ Oxa. 6 g/mL
1.500 g/mL
+ Oxa. 6 g/mL
Inibição Total (I)
0/11R
3/11R
9/11R
Inibição Parcial (IP)
0/11R
7/11R
2/11R
Resistência (R)
11/11R
0/11R
0/11R
Tabela 3 - Determinação do efeito bactericida e/ou bacteriostático. As amostras de S. aureus MRSA (104
UFC/mL) foram cultivadas em (MHB) com ECV, associado ou não a oxacilina (6 g/mL). A avaliação da inibição do crescimento foi realizada por comparação com os controles negativo (sem ECV) e positivo (com oxacilina). Uma
amostra de cada tubo foi plaqueada em MHA para verificar a atividade bactericida ou bacteriostática.
0 1 2 3 4 5 6
0
4
8
12
16
20
24
aa
aa **
bb b b
b
a
aa
a
a
He
mo
lis
e (
% )
Tempo ( hrs )
Tampao
ECV + Tampao
Figura 2- Teste de toxicidade do ECV em hemácias humanas de doadores saudáveis. Foram utilizados dois frascos,
o primeiro com hemácia + tampão fosfato e no segundo foi acrescentado ECV (0,54 mg/mL), de onde se retirou uma
alíquota a cada hora para testar uma possível ação hemolítica do ECV através de geração de radicais livres (**
p<0,01, os pontos das curvas marcadas com a letra a e b são diferentes entre si).
Devido aos resultados anteriores, ficou
claro a necessidade de confirma o efeito
bacteriostático do ECV, e se sua associação
com oxacilina poderia alterar estes resultados.
Portanto, S. aureus MRSA (104 UFC/mL)
foram cultivadas em MHB, com diferentes
concentrações de ECV, associado ou não a
oxacilina (6 g/mL). As amostras foram
plaqueadas (MHA) para verificar a atividade
bactericida ou bacteriostática de ECV
associado ou não com oxacilina. Os resultados
confirmaram que a ação do ECV
isoladamente é bacteriostática, pois inibia o
crescimento das bactérias em caldo, mas ao
serem plaqueadas em MHA, elas voltavam a
crescer. Já ao ser associado a oxacilina o
extrato passou a ter um efeito bactericida,
sendo capaz de eliminar as bactérias no caldo,
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que ao serem plaqueadas mostraram uma
diminuição no número de bactérias (Tabela
3). A resistência a oxacilina isoladamente
pelos MRSA é devido a produção de -
lactamase, (todas as cepas testadas produzem
-lactamase), portanto um mecanismo
possível de explicar a ação da oxacilina em
bactérias resistentes é que as catequinas
podem agir sobres as enzimas -lactamase,
inibindo sua ação e com isso possibilitando a
ação da oxacilina nas bactérias (YAM et al.,
1998). Outro dado interessante encontrado por
Stapleton et al. (2004), é que dentre as
catequinas do chá verde a ECG é a mais
eficiente na capacidade de modular a ação das
-lactamase e que o EGCG e a segunda
catequina em eficiência, estes dados podem
estar diretamente relacionados com a
capacidade destas catequinas de se
incorporarem na membrana celular, Caturla et
al. (2003) descreveram esta capacidade das
catequinas se incorporarem em membranas
celulares e que ECG e depois EGCG eram as
catequinas que mais profundamente se
incorporavam as membranas celulares.
G1 (AST) G2 (AST) G1 (ALT) G2 (ALT)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
b
a
b
a
U/L
Grupos de Animais
AST / ALT
Figura 3- A dosagem das atividades enzimáticas da AST e ALT. O grupo G1 é o controle negativo e o G2 foi
tratado com dose única de ECV (120mg/Kg). O sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca e as atividades
das enzimas foram analisadas através do método de Reitman e Frankel (1957), utilizando-se kits comerciais (os
grupos marcados com a letra a e b são semelhantes entre si) (n = 6).
Demonstrada a capacidade do ECV de
agir sobre bactérias, é importante saber se o
extrato pode apresentar afeitos tóxicos, pois
agentes antioxidantes podem se auto-oxidar e
gerar radicais livres, que podem levar a lesões
celulares importantes. Na Fig. 2 o ECV foi
incubado com hemácias humanas durante 6
hs, para testar uma ação hemolítica através de
geração de radicais livres. Tendo, na verdade
aparentemente protegido as hemácias contra a
hemólise provocada pelo tampão fosfato, que
pode ser visualizado na curva a. Isso pode
ocorrer devido a capacidade das catequinas de
se ligarem a membrana citoplasmática das
células e com isso estabilizando estas
estruturas inibindo assim a hemólise causada
pelo tampão fosfato (** p<0,01, os pontos das
curvas marcadas com a letra a e b são
diferentes entre si). Portanto, as catequinas
aparentemente não geram radicais livres com
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grande facilidade, pois se gerassem radicais
livres, estes teriam lesionado as membranas
dos eritrócitos e provocando a hemólise,
assim a geração de radicais livres pelas
catequinas não aparenta ser um dos principais
mecanismo de ação das catequinas em
bactérias por exemplo, pois para a geração de
livres pelas catequinas seria necessário a
presença de ferro para ocorrer a reação de
Fenton e com isso gerar radicais livres
(hidroperoxidos) (ARAKAWA et al., 2004;
NAKAGAWA et al., 2004).
Figura 4 – Dosagem de MDA (A) e Xilenol Laranja (B)dos grupos G1 e G2. O grupo G1 é o controle negativo e o
G2 foi tratado com dose única de ECV. Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e seus fígados
retirados para preparo do homogenato com 100 mg de fígado (os grupos marcados com a letra a são semelhantes
entre si) (n = 6).
Figura 5 – Estudo Histopatológico do Fígado dos Ratos. Corte G1 da região centro-lobular do fígado dos animais
controles normais, não demonstrando alteração patológica do tecido observado. Corte G2 é da região centro-lobular
do fígado dos animais tratados com dose única de ECV, demonstrando claramente alteração patológica de
degeneração reversível no tecido observado. Coloração de hematoxilina e eosina no aumento de 100X e no quadro
em destaque aumento de 400X no microscópio óptico.
G1 G2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
A
a
a
MD
A (
nm
ol/
g F
igad
o)
Grupos de Animais
MDA
G1 G2
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
B
aa
Xil
en
ol
( n
mo
l C
HP
/g F
igad
o)
Grupos de Animais
Xilenol
24
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O próximo passo foi utilizar o ECV
em um experimento com ratos tratados com
dose única de ECV, para avaliar a lesão
celular hepática. Para avaliar a extensão do
dano celular dosou-se AST/ALT, na
peroxidação de lipídio avaliou-se MDA e
Xilenol e o Histopatológico foi utilizado para
demonstrar qualquer alteração da morfologia
celular. Na Fig 3, temos a dosagem das
enzima AST e ALT, onde os grupos marcadas
com a mesma letra a e b são semelhantes
entre si.
Na Fig.4 A temos a dosagem de MDA
que também não demonstrou diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos,
indicando não haver lipoperoxidação nos
hepatócitos tratados com ECV nesta
concentração, portanto o ECV não foi capaz
de gerar radicais livres na Fig. 4 B a dosagem
do Xilenol apresentou resultados semelhantes
entre si, estes resultados vem corroborar com
os resultados da curva de hemólise indicando
que não houve formação de radicais livres e
lipoperoxidação das membranas celulares
tratadas com ECV, (todos os grupos marcadas
com a mesma letra a são semelhantes entre
si).
Na Fig. 5 temos o corte G1 da região
centro-lobular do fígado dos animais controles
normais, não demonstrando alteração
patológica do tecido observado. Já na Fig. 5 o
corte G2, temos a região centro-lobular do
fígado dos animais tratados com dose única de
ECV, demonstrando claramente alteração
patológica de degeneração reversível no
tecido observado. Fica claro que doses
elevadas de ECV podem alterar a morfologia
das células hepáticas, provavelmente devido a
capacidade das catequinas de se ligarem a
membrana plasmática das células
desestabilizando estas estruturas e levando a
alterações estruturais e causando
degenerações reversíveis, mas estas alterações
são consideradas reversíveis e é até
relativamente comum encontrar lesões desse
tipo em animais que usam doses terapêuticas
de medicamentos de uso corriqueiro como por
exemplo o paracetamol.
Conclusão
Estes estudos sugerem que o ECV
apresentada boa atividade antibacteriana
contra todas as bactérias testas,
principalmente as gram positivas,
provavelmente devido a capacidade das
catequinas do ECV de se ligarem aos
peptideoglicanos que são encontrados na
parede das bactérias gram positivas. Sendo
sua atividade bacteriostática frente às
bactérias testadas, mas quando associado a
oxacilina passou a ter atividade bactericida
frente as cepas de S. aureus MRSA. Um
possível mecanismo que explicar esta ação da
oxacilina em bactérias resistentes é que as
catequinas podem agir sobres às enzimas -
lactamase, inibindo sua ação e com isso
possibilitando a ação da oxacilina nas
bactérias e a uma aparente ação mais eficiente
sobre MRSA, podem estar relacionada com a
expressão de PBP2, indicando uma afinidade
maior a estas bactérias. Além de que o ECV
apresentou baixa toxicidade, o extrato vegetal
do chá verde ou seus componentes podem ser
compostos promissores no tratamento e na
prevenção de patologias de fundo bacteriano.
Com os resultados obtidos esperamos que no
futuro possa-se determinar um possível
emprego deste composto como adjuvante no
tratamento de infecções bacterianas,
especialmente pelo S. aureus MRSA.
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