Seminário Biologia Molecular & Métodos

AnalíticosPor:

Anderson Moura; Amélia Somensi; Argus Rocha Neto; Clarissa Feltrin e Luan Aires.

Proporcionar a compreensão das atividades enzimáticas fundamentais utilizadas na clonagem molecular.

OBJETIVO:

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA:

Dogma Central da Biologia Molecular:

Tradução

Repl

icaç

ão

Transcrição

As sínteses de DNA, RNA e Proteica envolvem três etapas básicas:

1.Iniciação da cadeia.2.Ampliação ou alongamento da cadeia.3.Término da cadeia.

Antes de ocorrer a condensação dos cromossomos é

necessário haver a duplicação do DNA.

Replicação Semiconservativa:

• Watson e Crick (1953): duplicação do material genético por complementariedade.

• Matthew Meselson e Franklin Stahl (1958): - Cultivo de bactérias em isótopo 15N.

Cultivo bacteriano em meio contendo

o isótopo 15N

Células transferidas para

meio com 14 N

Extração e Purificação de

DNA

Experimentos de Meselson e Stahl (1958):

Como ocorre a replicação:Em 1963 John Cairns por meio de auto-radiografia de bactérias, percebeu a existência de um ponto inicial para a replicação, denominado Origem da replicação.

Acreditava que a replicação era unidirecional.

Cultivo de E. coli em meio

contendo timidina (3H)

Isolamento do DNA, espalhamento em

emulsão fotográfica

Observação em microscópio

eletrônico

Na origem se formam duas forquilhas de replicação:

Estrutura da oriC, o único ponto de replicação em cromossomos circulares bacterianos.

DNA ReplicadoDNA Replicado

DNA ParentalDNA Parental

Forquilha de Forquilha de ReplicaçãoReplicação

Forquilha de replicação:

Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas.

Replicon:Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação.

Célula procariórica possui um único replicon.

Células eucarióticas possuem vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular, ainda que não simultaneamente.

Primeiro passo:

Abrir o DNA (forquilha de replicação) e manter as fitas complementares separadas, para que a DNA polimerase inicie atividade:

• Topoisomerase.

• Helicase.

• Proteína ligante de DNA (SSB).

As DNAs polimerases são as enzimas que sintetizam DNA:Também possuem função em atividades auxiliares e de reparo.

As duas fitas parentais são separadas e cada uma atua como molde para síntese de uma nova fita.

Síntese de DNA envolve a formação das ligações fosfodiéster:

Principais DNA polimerases e suas funções:

ENZIMAENZIMA GENEGENE FUNÇÃOFUNÇÃO

I polAEnvolvida no reparo de DNA

danificado.

II polBRequerida para reiniciar a

replicação.

III polC Replicase (replicação do DNA).

IV dinBReplicação através de lesão ou

dano.

V umuD’2CReplicação através de lesão ou

dano.

Lembrem-se:

•Sentido da síntese sempre é 5’ 3’.

• A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3’ – OH da cadeia em crescimento.

As fitas filhas alongam-se com o desenrolamento da forquilha?

A síntese de DNA é semidescontínua:

Então, qual é o mecanismo?

Fragmentos de Okazaki

A síntese de DNA é semidescontínua:

A síntese de DNA é semidescontínua:

Por que todas as enzimas DNA polimerases promovem o crescimento da fita de DNA somente na direção 5’ para 3’?

A síntese de DNA é semidescontínua:

Conversão do DNA duplex em fita simples:Para que a replicação ocorra, três atividades são necessárias para converter a dupla fita de DNA em um estado de fita simples:

1.Helicase:

2.Topoisomerase:

3.Proteína ligante DNA (SSB):

Classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA, utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula.

Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.

Ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.

Um iniciador é necessário para o começo da síntese de DNA:

Primase: • Cataliza a síntese de um pequeno RNA (primer).• Fornece o iniciador para DNA pol III.

Em relação a síntese da fita descontínua, vários iniciadores de RNA são produzidos pela primase para possibilitar a ligação dos fragmentos de Okazaki.

Em relação a síntese da fita descontínua, vários iniciadores de RNA são produzidos pela primase para possibilitar a ligação dos fragmentos de Okazaki.

Um iniciador é necessário para o começo da síntese de DNA:

Os fragmentos (Okazaki) sintetizados na fita descontínua são ligados enzimaticamente (LIGASE) para gerar uma fita contínua.

Os fragmentos (Okazaki) sintetizados na fita descontínua são ligados enzimaticamente (LIGASE) para gerar uma fita contínua.

• Circunda o DNA;• Associa-se com DNA pol III deixando-a altamente processiva;• Mantém DNA pol III ligada à molécula de DNA.

Braçadeira β: conecta a DNA polimerase ao DNA:

Velocidade: 1000 nucleotídeos/segundo cada

Manutenção de VELOCIDADE e PRECISÃO

REPLISSOMOATIVIDADE REVISORASISTEMAS DE REPARO

E. coli (20 a 40 min.)

~ 1 erro/ 109 nucleotídeos

Replicação: velocidade e precisão

Replissomo:

Atividade revisora (atividade exonuclease 3’ 5’) garante a fidelidade da replicação:

Visão geral da replicação:

1. HELICASE.

2. TOPOISOMERASE.

3. BRAÇADEIRAS.

4. PRIMASE.

5. DNA POLIMERASE III.

6. DNA POLIMERASE II.

7. DNA POLIMERASE I.

8. DNA LIGASE.

DNA Polimerases

• Enzimas responsáveis pela polimerização de uma nova molécula de DNA através da adição de desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTPs).

DNA Polimerases procariotos

DNA Polimerase Bacteriana

Atividades

Pol I Alongamento da fita de DNA 5’ 3’;Atividade de revisão 3’ 5’;Atividade de exonuclease 5’ 3’.

Pol II Alongamento da fita de DNA 5’ 3’;Atividade de revisão 3’ 5’.

Pol III Alongamento da fita de DNA 5’ 3’;É a principal envolvida na replicação dos procariontes;Atividade de revisão 3’5’

Fragmento Klenow

Polimerase 5’ 3’Exonuclease 3’ 5’

E. Coli

DNA Polimerase T4• Atividade de exonuclease 3’ 5’ e de polimerase

5’ 3’;

• Não apresenta atividade de exonuclease 5’ 3’;

• Pode ser utilizada na finalização da extremidade 5’ saliente e marcação do terminal 3’ da fita dupla de DNA;

• Atividade de exonuclease: retira aproximadamente 40 bases/minuto na fita dupla e 4000 bases da fita simples;

• Atividade de endonuclease: polimeriza 15000 nucleotídeos/minutos em condições padronizadas.

DNA Polimerase do bacteriófago modificado T7

• Complexo de duas ptns:

1) Produto de 84 kDa do gene 5 do T7 – propriedade catalítica;2) Tireodoxina da E. Coli de 12 kDa – conecta o gene 5 ao molde do iniciador.

• Polimerização de milhares de nucleotídeos sem dissoaciação;

•Taxa de polimerização de mais de 300 nucleotídeos/segundo;

• Utilizado no preparo de sondas radioativas e amplificação de grandes fragmentos de DNA;

• Identificado uma região de 28 aa com atividade de exonuclease 3’ 5’;

• A deleção desta região aumenta a taxa de polimerização e de mutação espontânea;

• Alta eficiência em incorporar nucleotídeos análogos (5’(α-thio)-dNTPs, dc7-GTP ou dITP) usados para melhorar a resolução do sequenciamento de DNA no gel.

DNA Polimerase do bacteriófago modificado T7

Terminal deoxinucleotidil transferase (TdT)

• Cataliza a adição de homopolímeros nas terminações das caudas de DNA de uma maneira independente do molde;

• Utilizada para marcação com nucleotídeos modificados;

• Ensaios de apoptose;

• Tdt requer a presença de um iniciador de DNA fita simples na presença de Mg+2;

• Aceita a presença de um iniciador de DNA fita dupla na presença de Co+2.

DNA Polimerases termoestáveis

• Purificadas no início dos anos 70;

• Interesse com o desenvolvimento da técnica de PCR.

TAQ Polimerase

• Purificada em 1976 da bactéria Thermophilus aquaticus - 70°C e 80°C;

• Considerada a molécula do ano pela revista Science em 1989;

• Meia vida de 40 min a 95°C e 30 min a 100°C;

• Atividade ótima: 80°C e Mg+2;

Yellowstone National Park

TAQ Polimerase

• Não possui atividade de revisão;

• Adição de resíduos de adenina nas terminações 3’nos produtos de PCR;

• Outras DNA polimerases foram descobertas – mais eficientes;

• As polimerases de DNA termoestáveis são comumente chamadas de Taq.

BST Polimerase

• DNA Pol I isolada em 1968 da bactéria termofílica Bacillus stearothermophilus (Bst) (39-70°C);

• Ativa a 65°C e inativa depois de 15 min à 75°C;

• Atividade exonuclease 5’3’- requer Mg+2;

• Proteases geram dois fragmentos;

• O maior fragmento é mais veloz do que a enzima íntegra.

THT Polimerase

• Isolada do Thermus thermophilus HB-8;

• Não possui atividade de revisão;

• Na presença de Mg+2 induz polimerização de DNA e na presença de Mn+2 tem atividade de transcriptase reversa.

DNA Pol termoestáveis c/ atividade de revisão

DNA polimerase Características

Pyrococcus furiosus (Pfu) Taxa de erro 10x < Taq

Pyrococcus woesei (Pow)

Meia-vida > 2h a 100°C.Baixa taxa de erroPolimeriza apenas moldes pequenosMistura de Taq e Pow permite a amplificação de longas cadeias de DNA

Thermococcus litoralis (Tli, Vent) Taxa de erros entre Taq e PfuMeia vida de 7hs a 95°C

Pyrococcus abyssi (Pol I e II) Taxa de erro similar a PfuMais termoestável que Pfu ou Taq

Hot start

• Objetiva evitar eventos não-epecíficos como: hibridização ou formação de dímeros no iniciador;

• Introduz uma barreira entre as estruturas secundárias e o sítio de ligação da DNA polimerase durante o seu preparo;

• A barreira pode ser: anticorpo, oligonucleotídeo ou modificação química reversível;

• Liberada das enzimas durante o primeiro ciclo de desnaturação do PCR – restaurando a atividade enzimática apenas depois da desnaturação das estruturas secudárias.

Hot start

Transcriptase reversa ou DNA polimerase dependente

de RNA

Vírus Epstein-Barr - 1964 Papilomavírus Humano

(HPV) – 1983

Peyton Rous, 1911

Agente filtrável em sarcoma

Rous Sarcoma Virus (RSV)

1960 – 1961 Genoma RNA1970 – Transcrição reversa

(Temin e Mizutani, 1970)

DNAc

Ocorrência natural da TR

Retrovírus

• Rous Sarcoma Virus (RSV)

• Raucher Leukaemia Virus (RLV)

TRs virais

Família Exemplos de vírus Particularidades

Metaviridae(RNA)

Saccharomyces cerevisiae Ty3 virus,

Drosophila melanogaster gypsy virus,

Ascaris lumbricoides Tas virus.

Retrovírus com atividade de retrotransposon.

Pseudoviridae(RNA)

Saccharomyces cerevisiae Ty1 virus,

Drosophila melanogaster copia virus

RNA de fita simples.

Hepadnaviridae(DNA fita dupla)

Hepatite B Dupla fita circular com fragmentação.

Caulimoviridae (RNA)

Plantas - Cauliflower mosaic virus, Soyben chlorotic mottle virus.

TR – Produção de DNAc, que não se

integra ao genoma do hospedeiro.

TRs não virais

TRANSPOSONS

- 80% genoma total das plantas

- 45% genoma humano

Cortar e colar

RETROTRANSPOSONS

- 42% do genoma humano

Copiar e colar

Elementos transponíveis

TRs não virais

Telômeros – Sequências não codificadoras

Telomerase – Enzima composta por RNA e TR que introduz nucleotídeos na região 3’

possibilitando a reconstrução dos telômeros.

DNA Polimerase?

TR e biologia molecular

•RT- PCR (Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction)

Preparação de bibliotecas DNAc e sequenciamento.

TR usadas em biologia molecular

AMV/MAV - TR• O Avian Myeoloblastosis Virus é dependente de outro vírus para

sua replicação, o Myeoloblastosis Associated Virus;

• AMV - Genoma contem oncogene v-myb = intensa proliferação dos mieloblastos.

α =RT e RNase H- Fragmenta = RNase H

RT

MuLV -TR

• Maloney murine leukemia virus;

• Menos eficaz e menos estável que AMV/MAV -RT;

• Baixa atividade de RNase H;

• Capaz de gerar transcritos mais longos.

TR - Termoestável

• DNA polimerase da Thermus Thermophilus:

• Epicentre’s MonsterScript™:

- Dependente de Mg2+;

- Sem atividade RNase H;

- Ativa em 65°C;

- Produz DNAc maior que15kb.

Organismos termófilos

Transcreve RNA na presença de MnCl2.

• O fragmento de Klenow da Carboxydothermus hydrogenoformans:

- Ativo em até 72° C.

• Thermo-X ™ RT :- Meia-vida de 120 min a 65° C;- Maior estabilidade já relatada.

TR - Termoestável

Polimerase I

RNA polimerase

• Principais usadas em Biologia Molecular: SP6 e T7- RNA polimerase

SP6 - Bacteriófago da Salmonella typhymurium LT2

Bacteriófago T7Transcrição!

• Usada para:- Síntese in vitro de transcritos anti-senso;- Produção de RNAs marcados com sondas;- Mapeamento com proteção de RNase

(expressão de RNAm).

• SP6 e T7 – RNA polimerase- Mg2+ e DNA molde fita dupla;- Espermidina e albumina de soro;- Transcritos downstream ao promotor; - Transcreve até a cauda poli-A.

RNA polimerase

Modelo deve ser linearizado

Ligases

Atividades da ligase

Conectam fragmentos de DNA por Ligações fosfodiéster 3’ OH –

5’PO4-

1° AMP

2° União

3°liberação AMP

1) União dos fragmentos de Okazaki

2) Reparo do DNA

3) União de fragmentos gerados pela ação de enzimas de restrição

Atividades da ligase

4) Outros processos de manipulação de DNA

Ligases utilizadas em biologia molecular

Cofatores

DNA ligase não termoestável

Bacteriófago T7 Vírus da Chlorella

Mais usada em Biologia Molecular:

• T4 DNA ligase – Requer Mg2+ e ATP como cofatores;

• Repara fitas simples em DNA dupla fita, RNA ou híbridos de DNA/RNA.

Bacteriófago T4

E. Coli DNA ligase - Atuação

Preferencialmente em extremidades coesivas

de DNA dupla fita.

Em abruptas na presença de Ficoll e polietilenoglicol.

Híbridos de DNA/ RNA ou RNA/RNA não são eficientemente ligados.

Particularidades das DNA ligases

• Dependentes de: - Temperatura;- Concentração de fragmentos;- Natureza dos fragmentos;- Extremidades rombas ou coesivas.

Dificuldade em presumir uma condição ideal de incubação!

.

• Protocolos: Ligação overnight a 16 ° C;• Otimização deve ser feita para cada reação.

DNA ligases termoestáveis

• Podem ligar duplex e reparar fitas simples a 45 – 80°C;• Altamente específicas e bem adaptadas ao rigor;

Thermus thermophilus; Bacillus stearothermophilus;Thermus scotoductus;Rhodothermus marinus.

• USO: Reação em cadeia da ligase (LCR) - para detectar mutações de uma única base.

RNA ligases

• Ligações fosfodiéster (5’PO4 – 3’OH) em fitas simples de DNA ou RNA.

T4 RNA ligase

• T4 RNA ligase 1 – RNA fita simples.

T4 RNA ligase 1• Aplicações:- Análise da estrutura do RNA;- Mapeamento de sítios de ligação de

proteínas;- Rápida amplificação de extremidades

de DNAc;- Ligação de oligonuceotídeos

adaptadores no DNAc;- Síntese de oligonucleotídeos;- Modificação de ácidos nucléicos na

região 5’;- Extensão de iniciadores na PCR;- Usada na circularização de moléculas

de RNA e DNA.

• Catalisa ligações intramoleculares e intermoleculares em RNA;

• Mais ativas para ligações de RNA; • Pode ligar DNA dupla fita.

T4 RNA ligase 2

RNA ligase termoestável

• Isolada de bacteriófagos rm378 e TS2126 que infectam Rhodothermus marinus e Thermus scotoductus respectivamente.

Rhodothermus marinus

Fosfatase alcalina

Fosfatase alcalina• Altamente expressa em células indiferenciadas

• Função enzimática > Remove o grupo fosfato de proteínas, alcalóides e nucleotídeos (hidrolisa ligações fosfodiéster)

• Importância biológica > Upkeep de Pi, Uptake de moléculas

• No leite e produção

• Em pesquisa > Anticorpos Conjugados> Remoção do P 5’– Impede anelamento

T4 Polinucleotídeo quinase

• Descoberta em E. coli infectadas por T4• As bactérias infetadas quebram sítios

específicos de seus tRNAs para interferir na manutenção viral

• O T4, por sua vez, utiliza sua Pkn para restaurar esses tRNAs

T4 Polinucleotídeo quinase

• Atividade enzimática• Cinase e Fosfatase

– Transferência de um fosfato de ATP• 3’ de um mononucleotídeo

• 5’-OH de RNAs e DNAs

– Condições ótimas > 37ºC» pH 7.6» Mg+2

» Agentes redutores» 5 ATP : 1 5’OH-

T4 Polinucleotídeo quinase

• Aplicações– Mapeamento de sítios de restrição– Fingerprint de DNA e RNA– Síntese de substratos para DNA e RNA ligase– Sequenciamento de bases

T4 Polinucleotídeo quinase

Fosfatase ácida Tobacco5' cap

Desoxirribonuclease I

Desoxirribonuclease I

• Glicoproteína purificada de pâncreas bovino– Mistura de 4 isoenzimas (A,B,C e D);– Pode haver RNAse A nessa mistura.

• Atividade enzimática– Cliva porções 3’ de pirimidinas, formando

polinucleotídeos;– Age em ssDNA e dsDNA.

• Aplicações– Marcação de DNA;– Geração de fragmentos aleatórios para

sequenciamento;– Digestão em amostras protéicas ou de RNA.

Desoxirribonuclease I

Exonuclease III

Exonuclease III

• Atividade enzimática– Remove mononucleotídeos da porção 3’-OH

de dsDNAs• C>A=T>G

– Remove o fosfato de 3’-fosfato de DNA– Degrada fitas hibridas de DNA-RNA

• Especificidade por dsDNA

Exonuclease III

• Aplicações– Marcação de DNA (principalmente dsDNA)– Redução do comprimento do DNA

Bal 31 nucleases

• Atividade enzimática– Encurta a fita de DNA em ambas porções 3’ e

5’

• Aplicações – Mapeamento de sítios de restrição;– Remoção de longos trechos (milhares de pb);– Remoção de curtos

trechos(dezenas/centenas de pb).

Exonuclease VII

• Atividade enzimática– Encurta ambas porções 3’ e 5” de DNA

• Específica para DNA fita simples

• Não age em RNAs ou DNA dupla fita

• Aplicações– Remoção de primers restantes em reações

de PCR finalizadas.

RNAse A

RNAse A

• Atividade enzimática– Cliva RNAs na porção 3’-fosfato ou 3’-fosfo-

oligonucleotídeos;– Em fitas híbridas de DNA-RNA, cliva o RNA

nos pontos não correspondentes.

• Aplicações

• Inativação

Ribonuclease H

Ribonuclease H

• Cliva específicamente os RNAs de híbridos RNA-DNA

• Importante em RT-PCR

S1 Nuclease

• Hidrolisa ssDNAs – 5x mais rápido do que ssRNAs – 75mil x mais rápido do que dsDNAs

• Hidrolisa ssDNAs e ssRNAs

» cDNAS

Mung bean nuclease

Metilases

Metilase

• Bactérias usam endonucleases de restrição:

– Degradar DNA estranho introduzido por agentes infecciosos como bacteriófagos;

– Preservar o seu próprio DNA da destruição por enzimas de restrição:

• Bactérias marcam seu DNA pela adição de grupamentos metil;• Essa modificação não interfere no pareamento de bases do DNA;

• Metilases são parte do sistema de restrição e modificação!

Metilase

• Sistema de restrição-modificação:

– Endonuclease de restrição Metilase correspondente;

– Catalizam a transferência de grupamentos metil da S-Adenosil Metionina (SAM) para nucleotídeos específicos da dupla fita de DNA:

Fonte: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Metilases%20De%20Modifica%C3%A7%C3%A3o%20Do%20Dna&lang=3

Metilase

• Há três tipos de sistemas:

– I e III Complexos geralmente grandes, com múltiplas subunidades contendo atividades tanto de endonucleases quanto de metilase;

• Tipo I Cliva o DNA em sítios aleatórios que podem estar a mais de 1000 pb da sequência de reconhecimento;

• Tipo III Cliva o DNA a cerda de 25 pb da sequência de reconhecimento;

• Os dois tipos requerem uso de ATP para se moverem ao longo do DNA.

Metilase

– Complexo II São as mais comuns no sistema, codificadas por proteínas independentes;

• Atuam de forma independente da sua endonuclease de restrição;

Metilase

• Exceções a inibição das enzimas de restrição pela metilação:

– Algumas endonucleases de restrição clivam o DNA em uma sequência de reconhecimento modificada pela DAM ou DCM;

– Alguma bactérias possuem endonucleases de restrição que apenas degradam DNA metilado e não o DNA não metilado do hospedeiro:

• De modo a combater a camuflagem evolutiva que certos bacteriófagos desenvolveram pelo DNA metilado.

Reparo do DNA

• Proteínas e RNA danificados Substituídas pelas informações codificadas DNA;

– DNA Insubstituíveis;

• Manutenção é um imperativo celular;

• Conjunto elaborado de sistemas de reparo;

• Erros no pareamento Replicada e transmitida (permanente) Mutações.

Reparo do DNA

• Número e diversidade de sistemas de reparo:– Reparo de erro de pareamento (erros de pareamento);

– Reparo por excisão de bases (bases anormais, bases alquiladas, dímeros de pirimidinas);

– Reparo por excisão de nucleotídeos (lesões do DNA que causam grandes alterações estruturais);

– Reparo direto (dímeros de pirimidinas).

Reparo do DNA

• Erros de pareamento:– Quase sempre corrigidos refletindo a informação da fita molde;

– Necessidade de discriminar a fita molde da fita recém-sintetizada;

– Marcação por metilação;

– Mecanismo não completamente compreendido para a maioria das bactérias ou eucariotos E.coli e correlatas.

Metilase

• Em E. Coli:– Discriminação das fitas se baseia pela DAM (gene):

• DAM Metilação do DNA na posição N6 de todas adeninas nas sequências 5’ GATC;

– Imediatamente após passagem pela forquilha de replicação há um curto período em que:

• Fita molde é metilada X Fita recém sintetizada não.

Metilase

• Metilação DCM (gene) citosina:

– Os sítios de reconhecimento do DCM são pontos intensos para mutação;

– Especialmente em transições C T no 3’C pela desaminação do 5-meC:

• Desaminação do 5-Metil Citosina (5-meC) base Timina;

– Sistema de reparo que reconhece e repara o pareamento errado através da formação de pequenos locais de excisão Vsp

– Vsp necessita da sobreposição parcial do gene Dcm expressão e coordenação.

Metilase• Cepas deficientes em metilação Determinação do papel da

metilação do DNA na biologia do organismo;

• Com o avanço das tecnologias de DNA recombinante:

– Propagação do DNA por cepas deficientes em metilação;

• Possibilidade de identificar as endonucleases que são afetadas pela metilação do DNA;

• Capacidade de se criar sítios específicos de clivagem do DNA;

• Melhorar o entendimento dos papeis que cada sistema atual na organização e regulação celular.

Outras Enzimas

Poliadenilato-polimerase

Poliadenilato-polimerase

• Na extremidade 3’, a maioria dos RNAms eucarióticos possuem um conjunto de resíduos de A Cauda poli (A):

– Sítio de ligação para uma ou mais proteínas específicas;

– Ajudam a proteger o RNAm da destruição enzimática

– Em bactérias essas caudas estimulam a degradação do RNAm;

Poliadenilato-polimerase• A cauda poli (A) é adicionada em diversas etapas:

– A Pol II Sintetiza RNA além do segmento do transcrito contendo sequências sinalizadoras de clivagem;

– Sequência que sinaliza é ligada por um complexo de enzimas:• Endonuclease;• Poliadenilato-polimerase;• E outras proteínas com múltiplas subunidades.

– A endonuclease cliva o RNA no lado 3’ a da sequência conservada;

– A Poliadenilato-polimerase sintetiza a cauda poli (A) de 80 a 250 nucleotídeos de comprimento.

Outras Enzimas

Topoisomerases I e II

Topoisomerase

• A supertorção do DNA:– Processo regulado com precisão;– Influi em muitos aspectos do metabolismo do DNA;

• Cada célula possui enzimas cuja única função é desenrolar e/ou relaxar o DNA;

– Enzimas que aumentam ou diminuem o grau de subenrolamento Topoisomerases Modificam o número de ligações no DNA.

Topoisomerase• Topoisomerase I:

– Atuam quebrando transitoriamente uma das duas cadeias o DNA passando a cadeia não rompida pela brecha, religando as extremidades;

– Modificam o Lk (“número de ligações”) em incrementos de 1;

• Topoisomerase II:

– Quebram ambas as cadeias do DNA;

– Modificam o Lk em incrementos de 2;

Vídeo

Topoisomerase

• Efeitos demonstrados por eletroforese em géis de agarose:

– População de DNA de plasmídeos idênticos com o mesmo número de ligação migra como uma banda discreta;

– Topoisômeros com valores de Lk diferindo em apenas 1 podem ser separados por este métodos.

Topoisomerase

• O estado topológico do DNA está intimamente relacionado com sua função;

• Sem topoisomerases:

– Células não podem se replicar;

– Não podem compactar seu DNA ou expressam seus genes e morrem;

Topoisomerase

• Importância:

– Duas classes de inibidores de topoisomerases bacterianas foram desenvolvidos como antibióticos:

• Cumarinas Inibem a ligação de ATP a topoisomerases do tipo II bacterianas, DNA girase e topoisomerase IV;

• Quinolonas Atuam bloqueando a última etapa da reação da topoisomerase, a soldagem da quebra na cadeia de DNA (inibidores da DNA girase e da topoisomerase IV);

Topoisomerase

• Importância:

– Alguns dos mais importantes agentes quimioterápicos usados no tratamento de câncer são inibidores de topoisomerases:

• Células tumorais apresentam, geralmente, níveis elevados de topoisomerases;

– Agentes dirigidos a essas enzimas são mais tóxicos aos tumores do que a outros tecidos.

Outras Enzimas

Guanilil transferase

Guanilil transferase

• É um complexo enzimático isolado a partir de Vaccinia virus;

• Utilizada para rotular ambas extremidades 5’ finais di e trifosfatos de moléculas de RNA após a remoção química do resíduo terminal de 7-metil-guanina;

Guanilil transferase

• Complexo apresenta 3 atividades enzimáticas:

1. Atua como uma RNA trifosfatase catalizando a quebra do pirofosfato a partir do trifosfato terminal de uma molécula de RNA, liberando um bifosfato terminal no RNA;

2. É uma guanil transferase, capaz de transferir uma molécula de GTP para o RNA, liberando pirofosfato;

3. É uma RNA metil transferase capaz de transferir um grupamento metil proveniente de SAM para o 5 resíduo de guanina de uma molécula de RNA.

Conclusão do autor

• Diversas são as enzimas à disposição dos estudiosos para:

– Propagar;

– Cortar;

– Modificar;

Conclusão do autor

• A maioria das preparações comerciais são confiáveis e podem ser utilizadas com muita segurança;

• No entanto, nem sempre há informações a respeito de origem biológica, dimensão do controle de qualidade, entre outras informações cruciais para definição dos protocolos;

• Cuidados ao se escolher as atividades enzimáticas e a qualidade dos reagentes são fatores chave para o sucesso.

Conclusão

• A correta compreensão de cada uma é que ajudará a selecionar-se a mais adequada para um propósito específico;

OBRIGADO!