Post on 29-Nov-2018
Lei de Bragg e Espaço Recíproco
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1. Cristalização.
2. Coleta de dados de difração de raios X.
3. Interpretação do padrão de
difração de raios X
4. Resolução da estrutura.
5. Análise.
Etapas para resolução da
estrutura 3D de
macromoléculas biológicas por
cristalografia
2
Cristalografia
Considere um conjunto de planos
paralelos de um retículo cristalino, como
mostrado na figura ao lado. A distância
entre os planos consecutivos do retículo
cristalino é chamada distância interplanar
(d). Na figura temos um feixe paralelo de
raios X de comprimento de onda ,
incidindo sobre este conjunto de planos
paralelos. Podemos analisar a difração de
raios X como se fosse resultado da
reflexão dos raios X pelos planos. Para
que ocorra difração num dado ângulo , é
necessário que as ondas difratadas
sofram interferência construtiva. Veja
bem, a reflexão é uma analogia,
fisicamente não ocorre tal reflexão.
d
Raios X incidentes Raios X difratados
3
Lei de Bragg
Analisemos a diferença de caminho
ótico dos feixes 1 e 2, indicados na
figura. O feixe 2 percorre a distância A +
B a mais que o feixe 1. Assim, para que
as ondas dos feixes 1 e 2 sofram
interferência construtiva, a diferença de
caminho ótico entre elas deve ser um
número inteiro de comprimentos de
onda.
A B
A + B = 2.A = 2 d.sen
dd
1
2
1
2
d
d.sen 4
Lei de Bragg
A diferença de caminho ótico (2 d.sen )
tem que ser um número inteiro de
comprimento de ondas (n.), onde n é
inteiro, assim temos:
2 d.sen = n. (Lei de Bragg)
A B
dd
1
2
1
2
d
d.sen 5
Lei de Bragg
Num experimento típico de difração de raios X, temos a fonte de radiação, o cristal e o
detector, como mostrado no diagrama esquemático abaixo. Normalmente os ângulos
de difração são expressos em relação ao feixe incidente, ou seja, 2 .
2
Fonte de raios X
Cristal
6
Aplicação da Lei de Bragg
Ao coletarmos dados de difração de
raios X de um cristal, usando-se uma
geometria como a mostrada no slide
anterior, teremos picos de difração para
todos os ângulos 2 que satisfaçam à lei
de Bragg. Se elaborarmos o gráfico da
intensidade da radiação difratada contra
o ângulo de espalhamento (2), teremos
um gráfico com o aspecto mostrado ao
lado. Toda vez que posicionamos o
nosso detector, num ângulo que satisfaz
à lei de Bragg, teremos um pico no
gráfico.
7
Aplicação da Lei de Bragg
Equipamentos que medem o padrão de difração de raios X, são chamados de
difratômetros. Há uma grande variedade de tipos e formas de difratômetro de raios X,
dependendo do tipo de experimento que se deseja realizar. A figura abaixo mostra um
difratômetro de pó, usado para amostras policristalinas.
8
Aplicação da Lei de Bragg
No caso de colocarmos um filme fotográfico para registrar a imagem de difração de
raios X, como mostrado no diagrama abaixo, teremos um padrão de difração de raios
X bidimensional, quanto mais distante o ponto de difração de raios X do ponto central
da figura (feixe direto) maior o ângulo de espalhamento (2). A foto da direita foi girada
90º com relação ao diagrama de esquerda. No aparato experimental o filme ou placa
de imagem está perpendicular ao plano.
2
Cristal
Filme fotográfico ou placa de imagem
Feixe de raios X
Feixe direto
Film
e f
oto
grá
fico o
u p
laca
de
im
age
m
9
Aplicação da Lei de Bragg
Consideremos uma cela unitária, como
mostrada na figura ao lado, as conclusões
referentes à esta cela unitária, no que
tange às propriedades dos índices de
Miller, valem para os outros sistemas
cristalinos, com exceção do sistema
hexagonal, que não discutiremos aqui. Na
análise do fenômeno de difração de raios
X, uma atenção especial é dada para o
conjunto de planos paralelos que difratam.
Tal conjunto de planos paralelos, num
retículo cristalino, pode ser representado
por um conjunto de inteiros, relacionados
aos interceptos com os eixos x, y e z.
Para simplificar a explicação
consideremos os seguintes exemplos.x
y
z
10
Índices de Miller
(100)
O plano ilustrado ao lado intercepta o eixo
x na posição 1, e é paralelo aos eixos y e
z. Os índices de Miller deste plano obtém-
se com o inverso dos interceptos aos
eixos x, y e z. Os interceptos são 1, , ;
e o inverso é 1, 0, 0, assim o índice de
Miller do plano em cinza mostrado ao lado
é (100). Na verdade estes índices indicam
a família de planos paralelos a ele e que
interceptam o eixo x em a, 2, 3, 4, ....
x
y
z
1
11
Índices de Miller
O plano, mostrado na figura ao lado,
intercepta o eixo x em 1, o eixo y em 1 e é
paralelo ao eixo z. O índice de Miller é
(110).
x
y
z
1
1(110)
12
Índices de Miller
O plano ao lado intercepta o eixo x em 1,
o eixo y em 1 e o eixo z em 1. O índice de
Miller é (111).
x
y
z
1
1
1
(111)
13
Índices de Miller
O plano ao lado intercepta o eixo x em 1,
o eixo z em 1 e é paralelo ao eixo y. O
índice de Miller é (101).
x
y
z
1
1
1
(101)
14
Índices de Miller
O plano ao lado intercepta o eixo y em 1,
o eixo z em 1 e é paralelo ao eixo x. O
índice de Miller é (011).
x
y
z
1
1
1
(011)
15
Índices de Miller
O plano ao lado intercepta o eixo x em
1/2, o eixo y em 1 e é paralelo ao eixo z.
O índice de Miller é (210).
x
y
z
1
½
(210)
16
Índices de Miller
O plano ao lado intercepta o eixo x em
1/4, o eixo y em 1 e é paralelo ao eixo z.
O índice de Miller é (410).
x
y
z
1¼
(410)
17
Índices de Miller
Ao lado temos a indicação dos planos
(100), paralelo ao plano yz, (010) paralelo
ao plano xz e (001) paralelo ao plano xy.
x
y
z
(100)(010)
(001)
18
Índices de Miller
Na figura ao lado temos um plano
interceptando o eixo y em ½ e paralelo ao
plano xz, determinamos os índices de
Miller invertendo-se o intercepto em y,
assim temos (020).
x
y
z
½
(020)
19
Índices de Miller
Na figura ao lado temos um plano
interceptando o eixo y em 1/4 e paralelo
ao plano xz, determinamos os índices de
Miller invertendo-se o intercepto em y,
assim temos (040).
x
y
z
1/4
(040)
20
Índices de Miller
Toda vez que o plano corta a origem,
coordenadas 0,0,0; temos que lembrar
que esta representação refere-se a um
cristal, onde temos repetição da cela
unitária em três dimensões, como
mostrado ao lado.
x
y
z
1
O plano equivalente corta o eixo x em 1 e
o eixo y em -1, sendo paralelo à z, os
índice de Miller são (1 -1 0), a notação
cristalográfica usa uma barra sobre
números negativos: (110) 21
Índices de Miller
A cela unitária ao lado tem parâmetros de
cela unitária a = 4 Å, b = 8 Å e c = 3
Å, consideremos um plano que
intercepta a cela unitária em x = 1 Å, y
= 4 Å e z = 3 Å. Determinaremos o
índices de Miller do plano seguindo-se
o seguinte algoritmo.
1) Tomemos os interceptos nos eixo x, y
e z:
x = 1 Å, y = 4 Å e z = 3
2) Calculemos a fração do eixo de cada
intercepto:
¼, 4/8 e 3/3 ou seja, ¼, ½, 1
3) Invertemos essas frações, como segue:
4, 2, 1. Os índices de Miller desse plano
são (421)x
y
z
a = 4 Å
b = 8 Å
c = 3 Å
1 Å
4 Å
3 Å
22
Índices de Miller
(100)
x
y
z
Vetores perpendiculares a planos
cristalinos de índice de Miller (hkl)
recebem índices da direção [hkl], em
notação cristalográfica, qualquer direção,
indicada por [hkl] representa a direção de
um vetor perpendicular ao plano (hkl). Na
cela unitária ao lado temos as direções
[100], [010] e [001] indicadas, essas
direções são perpendiculares aos planos
(100), (010) e (001), respectivamente.
[100][010]
[001]
(001)
(010)
23
Índices de Miller
O espaço recíproco pode ser definido
como um conjunto de pontos, onde cada
ponto é determinado como segue:
considere normais a todos os planos do
espaço (hkl), saindo de um ponto O,
considerado como origem. Cada normal
aos plano (hkl) finaliza em um ponto, a
uma distância dhkl* = 1/dhkl, onde dhkl é a
distância interplanar dos planos (hkl), este
conjunto de pontos (terminações das
normais) é que formam o espaço
recíproco. Vamos ilustrar em duas
dimensões.
x
y
O
(110)
Ponto do espaço recíproco
Ponto do espaço direto
24
Espaço Recíproco
Consideremos o espaço direto,
representado abaixo, vamos determinar
alguns pontos do espaço recíproco. Seja
o plano (110), representado pela linha
vermelha, consideremos uma origem
arbitrária, indicada por O. Vamos traçar
um vetor de O, perpendicular ao plano
(110), o tamanho deste vetor é d110*,
assim temos um ponto do espaço
recíproco no final deste vetor.
x
y
O
(110)
Ponto do espaço recíproco
Ponto do espaço direto
dhkl*
25
Espaço Recíproco
Para o plano (120) temos o ponto
indicado. Resumindo, aplicando-se
sucessivamente este processo, teremos
um conjunto de pontos dos espaço
recíproco, para cada plano do espaço
direto, ou seja, temos uma
correspondência entre os potenciais
planos refletores e pontos do espaço
recíproco.
x
y
O
110
(110) (120)
120
Ponto do espaço recíproco
Ponto do espaço direto
26
Espaço Recíproco
As propriedades geométricas de um
retículo recíproco são as inversas do
retículo cristalino. Consideremos uma cela
unitária com parâmetros relativamente
grandes (a, b, c), como o parâmetros de
cela unitária de cristais de proteínas. A
cela recíproca (a*, b*, c*) é pequena
(propriedade recíproca).
x
y
z
a
b
c
a*
b*
c*
27
Espaço Recíproco
Agora temos uma cela unitária direta
relativamente pequena (a,b,c) a cela
recíproca é grande (a*, b*, c*).
x
b
a*
b*
c*
a
c
y
z
28
Espaço Recíproco
O espaço recíproco é um artefato matemático criado para auxiliar na interpretação do
processo de difração de raios X. O espaço recíproco, determinado pelos eixos
recíprocos a*, b*, c* e ângulos *, * e * está relacionado com o espaço direto,
representado pelos eixos a, b, c e ângulos , e . A dimensão do espaço recíproco é
o inverso do comprimento, consequentemente suas unidades são inversas das
unidades de comprimento(m-1, cm-1, Å-1 e outras). As equações abaixo relacionam os
eixos diretos com os recíprocos.
a* = bc sen
V
b* = ac sen
V
c* = ab sen
V
V = 1/V* = abc(1 – cos2 - cos2 - cos2 + 2 cos .cos .cos )1/2
V* = 1/V = abc(1 – cos2* - cos2* - cos2* + 2 cos *.cos *.cos * )1/2
29
Espaço Recíproco
Os ângulos *, *, * e , , são dados pelas seguintes equações.
cos * = cos cos - cos
sen sen
cos * = cos cos - cos
sen sen
cos * = cos cos - cos
sen sen
cos = cos * cos * - cos *
sen * sen *
cos * = cos * cos * - cos *
sen * sen *
cos * = cos * cos * - cos *
sen * sen *
30
Espaço Recíproco
Podemos interpretar o fenômeno da difração de raios X por um cristal considerando-se
uma esfera centrada no cristal, de raio 1/, como mostra a figura, essa esfera é
chamada esfera de Ewald.
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
Cristal
Feixe de raios X
C
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe direto
31
Esfera de Ewald
Toda vez que um ponto do retículo recíproco cruza a esfera de Ewald, temos a
produção de um ponto de difração. Na figura abaixo um ponto do retículo recíproco é
representado por intersecção das linhas.
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
Cristal
Feixe de raios X
C
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe direto
32
Esfera de Ewald
O ponto P produz um ponto de difração, ao girarmos o cristal giramos o retículo
recíproco, trazendo novos pontos em condição de difração, como o ponto P’.
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
Cristal
Feixe de raios X
C
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe direto
33
Esfera de Ewald
O resultado líquido de girarmos o cristal é que podemos registra diversos pontos de
difração. Normalmente, em coleta de dados, que usa a geometria da câmara de
oscilação, este recurso é usado para obtenção de diversos pontos por cada imagem
medida.
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
Cristal
Feixe de raios X
C
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe direto
34
Esfera de Ewald
O módulo de vetor de espalhamento é d (espaçamento interplanar), a partir da análise
da figura podemos determinar a relação entre o ângulo , d e o comprimento de onda
(), como segue.
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
Cristal
Feixe de raios X
C
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe direto
35
Esfera de Ewald
Considere o triângulo APO, pela
geometria da figura temos que o ângulo
PÂO é , assim temos:
sen = S
2/
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
CristalC
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe diretoFeixe de raios XA
36
Esfera de Ewald
P é um ponto do espaço recíproco, assim seu comprimento é 1/dhkl, onde hkl são os
índices dos planos relacionados com P. Assim temos:
sen = S
2/= 1/dhkl
2/
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
CristalC
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe diretoFeixe de raios XA
37
Esfera de Ewald
Ou seja: 2.d sen =
O
Retículo recíproco
Esfera de Ewald
CristalC
P
P’
1/
S (vetor do espaço recíproco)
Feixe difratado
Feixe diretoFeixe de raios XA
38
Esfera de Ewald
Experimentalmente observamos que os
pontos do retículo recíproco apresentam
volume, ou seja, eles ficam em condição
de difração um certo tempo, durante a
rotação do retículo recíproco. Isto deve-se
a fatores como a mosaicidade do cristal,
ou seja, há uma leve desordem, o que
não traz todas as celas unitárias em
condição de difração, para um dado ponto
do retículo, ao mesmo tempo.
000-100-200 100 200
00-1-10-1-20-1 10-1 20-1
001-101-201 101 201
Feixe de
Raios X
Retículo
recíproco
Esfera de
Ewald
39
Esfera de Ewald
Podemos pensar no ponto do retículo
recíproco como um nódulo, que durante a
rotação do retículo recíproco entra em
condição de difração (cruza a esfera de
Ewald), fica um certo tempo nesta
situação, durante a rotação e depois sai
de condição de difração. Na animação ao
lado temos um nódulo do retículo
recíproco que entra em condição de
difração, fica um certa tempo, e depois
cessa a difração. O detector indica o
registro da intensidade difratada por meio
da coloração azul.
Fonte: http://www.science.uva.nl/research/cmp/docs/Goedkoop/
40
Esfera de Ewald
A câmara de oscilação, ou rotação, é o principal instrumento usado para o registro do
padrão de difração de raios X de cristais de macromoléculas biológicas. O diagrama
esquemático abaixo ilustra as principais características da câmara de oscilação.
Fonte de raios X
Cabeça goniométrica
Cristal
Retículo recíproco
Placa de imagem
Padrão registrado
na placa de imagem
41
Esfera de Ewald
As reflexões registradas na imagem de difração podem ser interpretadas como
resultado da reflexão de um plano de índice hkl, onde hkl são os índices de Miller da
família de plano. A distância interplanar é dado pela seguinte equação:
Fonte de raios X
Cabeça goniométrica
Cristal
Retículo recíproco
Placa de imagem
Padrão registrado
na placa de imagem
42
Esfera de Ewald
Uma das características geométricas da família de plano de índice hkl é a distância
interplanar (d), que no caso dos sistemas ortorrômbico, tetragonal e cúbico é dada
pela seguinte equação:
Onde hkl são os índices do plano de reflexão, e a, b e c os parâmetros de cela
unitária.
Para os outros sistemas cristalinos a equação é a seguinte:
Onde V é o volume da cela unitária.
2
2
2
2
2
21
c
l
b
k
a
h
d
2/12
22
222222222222
)]coscos.(cos2
)coscos.(cos2)coscos.(cos2
[
bckla
hkabcchlab
senbalsencaksencbhVd
43
Esfera de Ewald
Feixe de
Raios X
Esfera de
Ewald
2/
1/
000-100-200 100 200
00-1-10-1-20-1 10-1 20-1
001-101-201 101 201
Retículo
recíproco
Ao girarmos o cristal, e
consequentemente o retículo recíproco,
podemos varrer uma ampla região do
espaço recíproco. O número total de
pontos do retículo recíproco, que podem
cruzar a esfera de Ewald, pode ser
determinado a partir da esfera limite. Girar
o retículo recíproco é equivalente a
girarmos a esfera de Ewald, que gera
então uma esfera limite de raio 2/.
Esfera limite
44
Esfera Limite
Feixe de
Raios X
Esfera de
Ewald
2/
1/
000-100-200 100 200
00-1-10-1-20-1 10-1 20-1
001-101-201 101 201
Retículo
recíproco
Os pontos do retículo recíproco dentro do
volume da esfera limite podem ser
trazidos em condição de difração. A
determinação do número total de pontos
que podem gerar padrões de difração de
raios X é determinado dividindo-se o
volume da esfera limite pelo volume da
cela unitária recíproca, considerando-se
que a cela unitária é primitiva.
Esfera limite
45
Esfera Limite
Feixe de
Raios X
Esfera de
Ewald
2/
1/
000-100-200 100 200
00-1-10-1-20-1 10-1 20-1
001-101-201 101 201
Retículo
recíproco
Esfera limite
Seja N o número de reflexões
potencialmente gerados para uma esfera
limite de raios 2/.
N = Vesfera limite
V*
N = 4/3 (2/)3
V*
Sabemos que: V*=1/Vcell , onde Vcell é o
volume da cela unitária, assim temos:
N = 32 Vcell
3 3
46
Esfera Limite
Consideremos uma cela unitária ortorrômbica de dimensões 40 x 60 x 80 Å, que
difrata a 2,5 Å de resolução, o volume da cela unitária é Vcell = 40 . 60 . 80 = 192.000
Å3. Usando-se a equação do número de reflexões temos:
N = 32 V
3 3
= 32 192.000 / 3.(2,5)3 = 411.775 reflexões
Felizmente, por razões de simetria não é necessário coletar todas essas reflexões, 1/8
dos dados de difração de raios X, ou próximo disso normalmente é suficiente para o
grupo espacial ortorrômbico primitivo ou aproximadamente 51.472 reflexões.
47
Número Máximo de Reflexões
1. Num experimento de difração de raios X tivemos 10 picos, registrados nas
seguintes posições angulares:===========================
n 2. () ()
1 11,0 5,5
2 22,4 11,2
3 33,2 16,6
4 45,2 22,6
5 57,0 28,5
6 70,4 35,2
7 84,6 42,3
8 100,6 50,3
9 120,0 60,0
10 148,4 74,2
===========================
Sabendo-se que o cristal é cúbico, determine o parâmetro de cela unitária médio.
O comprimento de onda usado é 1,54 Å.
2. Consideremos um cristal cúbico primitivo com parâmetro de cela unitária a = 4 Å.
Determine a posição angular, das 4 primeiras linhas de difração de raios X desse
cristal, sabendo-se que o comprimento de onda da radiação incidente é 1,54 Å.
Data de entrega: 19/10/2018.
.
48
Lista de Exercícios
Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer-
Verlag.
Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2nd ed.San Diego: Academic
Press.
Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide.
2nd ed. New York: John Wiley & Sons.
Última atualização em 28 de setembro de 2018.
49
Referências