Post on 17-Apr-2015
Avanços da Nanotecnologia Farmacêutica-1
Prof. Dr. Nelson Durán
MSc. Priscyla D. Marcato
MSc. Zaine Teixeira
IQ-UNICAMP
aula-2 (12/03/08)qf-933
1 nm = 10-9 m
NANO (anão)
ALGUMAS DICAS• Rede de Nanobiotecnologia:
(www.nanobiotec.iqm.unicamp.br)• Google: MIT OpenCourseWare(vários cursos completos)• MIT OpenCourseWare BE.4625(curso: Molecular Principles of Biomaterials)Conferencia(http://www.ranf.com/pdf/discursos/numero/
vila.pdf)Rawat et al. Nanocarriers... Biol. Pharm. Bull. 29, 1790 (2006).Kayser et al. The Impact of nanobiotechnology... Current
Pharm. Biotechnol. 6, 3 (2005).
3,5 bilhões de anos atrás - Células possuem biomáquinas nanométricas que têm funções como manipulação de material genético e suprimento de energia.
Os químicos: Sintetizam polímeros (grandes cadeias de moléculas feitas de minúsculas unidades nanoescalares- monômeros) há muitas décadas
NANO X MACRO
Abaixo de 100 nm as propriedades físicas e químicas mudam
• Aumento da área superficial = maior reatividade, maior penetração em células
• Novas propriedades óticas, elétricas e magnéticas
NANO X MACRO
NANO X MACRO
NANOBIOTECNOLOGIA É MULTIDISCIPLINAR
NanotecnologiaNanobiotecnologia
Medicina
Engenharias
Informática Ciências dos
Materiais
Biologia
Química
Física
• Oral
Rotas de administração de ativos
• Oftálmica
• Dérmica
• Parenteral (intravenosa,
intramuscular, subcutânea)
• Nasal
QUAL É A FUNÇÃO DOS ATIVO (FÁRMACO OU
COSMÉTICO) NAÁREA ESPECIFICA DE
ATUAÇÃO?
O FÁRMACO DEVE ATINGIR UM ALVO DEFINIDO COM
EXATIDÃO
CÉLULAS OU TECIDOSCONTROLAR O MECANISMO
DE PENETRAÇÃO DO FARMACO
“MAGIC BULLET”(Paul Ehrlich)
O ATIVO É LOCALIZADO DEFORMA PRECISA NO ALVO E NO
EXATO LOCAL DA AÇÃO
OS ATIVOS ESTÃO LONGE DESTE DESENHO
NANOTECNOLOGIA
NanoBioTecnologia
• Encapsulamento de ativos (drug delivery)
• Biosensores
• Máquinas e dispositivos Moleculares
• Implantes médicos
•Engenharia de tecidos
•Descoberta de novos medicamentos
O princípio ativo é encapsulado em espécies coloidais como lipossomas, nano e micropartículas poliméricas ou lipídicas sólidas
O princípio ativo pode estar associado a nanopatrículas metálicas e nanotubos de carbono
SISTEMA DE LIBERAÇÃO SUSTENTADA
Nanopartículas: diâmetro 1m
Micropartículas: diâmetro > 1 m
Vantagens
• Melhora a estabilidade física e química de ativos
• Melhorar a biodisponibilidade
• Mantém o efeito do fármaco no tecido alvo
• Solubilizar ativos lipofílicos
• Minimiza os efeitos colaterais
• Reduz a toxicidade
• Diminui o número de doses/aplicações
LIBERAÇÃO SUSTENTADA
Efeitos adversos
Níveis tóxicos
Faixa terapéutica
Concentração
Min. efetiva
Sem efeito
Convencional
Liberação ordem zero
Tempo/dosagem administrada
Nív
eis
Pla
smát
icos
Dendrímeros Nanoemulsões
Ciclodextrina
Lipossoma Nanopartículas Poliméricas
Nanopartículas Metálicas
Nanopartículas Lipídicas Sólidas
Fulerenos Nanotubo de Carbono
Preparação e Caracterização de
Nanopartículas no Encapsulamento de
Ativos/Fármacos
Top-Down X Bottom-Up
http://www.barrettresearch.ca/teaching/nanotechnology/nano06.htm
Encapsulamento e liberação de
ativos: Método Botton-Up através
de moléculas auto-organização
de moléculas em solução aquosa
Moléculas anfifílicas
Reúnem dois grupos com polaridades ou solubilidades opostas
lipídeos, surfactantes, proteínas
Sal de amina graxa (surfactante catiônico)
Alquilssulfato(surfactante aniônico)
Betaína (surfactante anfotérico)
(Surfactantes não-iônicos)
Polimeros em bloco
Estruturas de algumas moléculas anfifílicas típicas
fosfatidilcolina (fosfolipídios)
EMULSÕES
Aula 2
É uma dispersão, na qual as fases são líquidos imiscíveis ou
parcialmente miscíveis. Neste sistema tem-se uma fase finamente
dividida (dispersa ou interna) em uma outra fase (contínua ou
externa), na presença de surfatante (agente emulsificante).
Classificação (tamanho das partículas da fase dispersa):
MACROEMULSÕES - >400 nm;MINIEMULSÕES – 100 a 400 nm;MICROEMULSÕES - transparentes, < 100 nm;MÚLTIPLAS – a partícula dispersa já é uma emulsão
Emulsão
De Azevedo, 2004
Exemplos de tipos de emulsões
A/ODe Azevedo, 2004
A
O
O
A
A
A/O
Emulsão múltipla A/O/A
Emulsão A/C
H2O / óleo de parafina / emulsificador (copoliol
cetildimeticona, lipofílico), A/O
H2O /emulsificador (SDS, hidrofílico), espessante (poli
ácido acrílico),A
H2O / CO2 (l ou supercrítico) / emulsificante
Neste caso não é qualquer emulsificante, tem que ter boa solubilidade em CO2 com fracas forças de dispersãodas cadeias
(perfluoropoliéter)
CF3 – (O-CF2- CF (CF3)n- (O-CF2)-COO- NH4
+
Gota a gota, rpm
De Azevedo, 2004
Conceito de tensão interfacial:
Forças de dispersão (as chamadas forças de London):flutuações
Presença de momentos de dipolo instantâneos inerentes às
moléculas, que se reorientam o tempo todo
Os momentos de dipolo de moléculas vizinhas são
correlacionados e em decorrência,moléculas vizinhas sempre se
atraem
Existe uma energia superficial decorrente da existência destas
forças intermoleculares, particularmente de dispersão
De Azevedo, 2004
Conceito de tensão interfacial:
Em conseqüência das forças intermoleculares, moléculas
sempre se atraem e a tendência é a minimização da área
superficial espontaneamente (variação da energia livre
superficial ou interfacial com a variação de área)
A é a área de contato entre as fases
(Processo de aumento da superfície de um líquido)
A =G
T,P ,n
De Azevedo, 2004
INSTABILIDADE: 2 líquidos imiscíveis puros não podem formar uma emulsão:
A tensão interfacial de valor alto representa uma energia livre
interfacial alta, decorrente do aumento na área de contato entre
as fases
O sistema é instável termodinamicamente, se comparado à área
mínima que se conseguiria entre as duas fases quando
separadas.
De Azevedo, 2004.
Esta metaestabilidade está intimamente relacionada à
presença de moléculas anfifílicas (surfatantes) na interface.
Adsorve na interface L-L como um filme interfacial orientado
Provoca abaixamento da tensão interfacial, o que leva à diminuição na energia livre interfacial
Isto permite uma maior área de contato entre as fases
A maior parte dos sistemas que interessam são metaestáveis ( A energia livre do sistema tende a diminuir, mas este sistema é mantido no mesmo estado por uma
barreira de ativação)
óleoóleo
(O/A, interface)
água
óleo interface
De Azevedo, 2004
Instabilidade física das emulsões
Mecanismos
Floculação , sedimentação (“creaming”)
Coalescência
Envelhecimento de Ostwald,
separação de fases
reversível
irreversível
Irreversível“quebra”
Mecanismos
De Azevedo, 2004
Instabilidade Física das emulsões
Dispersão:Movimento Browniano,
DifusãoColisão efetiva
Forças atrativas entre as gotas,formam-se agregados (floculação)
Rompimento do filme interfacial e coalescência
Paralelamente a estes fenômenos, as gotas podem flotar ou sedimentar (tamanho)
“Ostwald Ripening”
De Azevedo, 2004
Abaixamento da tensão interfacial: A formação da emulsão é mais fácil, mas existem outros fatores de estabilidade
Mecanismos de estabilizaçãodas gotas
Estérica: força repulsiva entre as cadeias (tamanho e solvente);La Mer: floculação x coagulaçãoEletrostática: carga do surfactante, adsorção de contra-íons.Repulsão governada pelo “overlap” entre as camadas difusas (potencial de Stern).
Drenagem gera gradientes de [surfatante] mas há cura do filme Outros: natureza do filme interfacial, viscosidade da fase contínuaDe Azevedo, 2004
Estabilidade pela presença de partículas sólidas
Partículas de látex de poliestireno estabilizando uma
gota de águana interface água/octano
A partícula irá permanecer no líquido que molha melhor (ângulo de contato)
Para deslocar a partícula da interface é necessário realizar trabalho
De Azevedo, 2004
Ordenamento das partículas de látex de poliestireno ( 2,6 m )
na interface água/octano
Organizadas em monocamada com empacotamento hexagonal
A mesma monocamada, após compressão: dobras e filme pregueado.
Forças repulsivas laterais (originadas da carga superficial das partículas) dá origem à monocamada altamente organizada.
De Azevedo, 2004
Seleção do surfatante comoagente emulsificante
Método do HLB (balanço hidrofílico-lipofílico, Griffin, 1949).
hidrofilicidade
O tamanho relativo dos grupos determina a
curvatura preferida da interface, o que
determina a fase dispersa
Selecionar o surfatante ou uma combinação de
surfatantes
De Azevedo, 2004
O/A x A/OJacob Israelachvili (University of California) First World Congress in Emulsions, Paris, 1993
Hierarquia de forças e o tipo de estrutura auto-organizada que estabiliza: emulsões e micremulsões ocupam um lugar especial, energia da ordem de kT.
Parâmetro de agregação crítica, CPP = Vap/ L A
O PROBLEMA:Não acompanha mudanças nas
condições (temperatura, co-
surfatantes)
HLB é indicativo apenas do tipo de emulsão que pode ser esperada ,mas não é indicativo de sua eficiência (concentração requerida) ou de sua contribuição à estabilidade da emulsão;
Muitas maneiras de se calcular, ex: HLB= 20 * M hidrofílico/ M hidrofílico + M lipofílico
(não-iônicos)
O SONHO:Relacionar estrutura
molecular do surfatante com HLB
Exemplo:Etoxilados, HLB=13 mas acima de 80 0C forma emulsão A/O
De Azevedo, 2004
Método de PITShinoda e Saito (1969) definiram PIT como a temperatura na qual uma emulsão O/A torna-se A/O;Nesta temperatura as tendências hidrofílica e lipofílica do surfatante são perfeitamente balanceáveis.
De Azevedo, 2004
Diagramas de fase para o sistema surfatante/óleo/água
3 diferentes tipos de diagramas de fase, dependendo dos valores relativos de energia de interação do surfatante com óleo ou água; “tie line” seria horizontal para afinidades totalmente balanceadas
Winsor tipo I Winsor tipo II Winsor tipo III
Região bifásica: tensoativo-águapredomina
tensoativo-óleopredomina
microemulsão
22
23
1
2
2
1
1
De Azevedo, 2004
Preparação de emulsõesA formação e estabilidade de uma emulsão é afetada pela seqüência e metodologia de mistura ( ex: emulsificador adicionado em separado, mistura de todos os componetes); a energia introduzida influi no diâmetro das gotas; forte tensão de cisalhamento pode levar a coalescência e polidispersidade (margarina O/W : componente de aroma na fase dispersa)
Métodos
oMétodos de micronização – energia mecânica ao sistema, promovendo agitação dos 2 fluidos e do emulsificador (agitador) ultra-som: produção repentina e subseqüente colapso das cavidades em um líquido; crescimento da pressão local, subdivisão da gota (problemas de reprodutibilidade, controle dos núcleos de cavitação
Métodos
Preparação de emulsões
Inversão de fase: O/A preparada de uma emulsão A/O (menor gasto energético)
PIT: pequenas gotas podem ser obtidas em T um pouco abaixo do PIT; consegue-se uma menor tensão interfacial
Aplicação : preparação de microesferas
SEM, elétrons secundários (topografia)A=5000x (clorofórmio)
De Azevedo, 2004
Emulsão múltipla na obtenção de microesferas para vacinas de DNA
De Azevedo, 2004
Bibliografia-M.M.M.DE ACEVEDO(2004)[1] Rosen, M. J. Surfactants and Interfacial Phenomena, John Wiley & Sons: New Yok, 1989, 304-336.[2] Rosano, H. L., Gandolfo, F. G. e Hidrot, J-D. (1998). Stability of W1 /O/ W2 multiple emulsions, influence of ripening andinterfacial interactions Colloids Surf. A. 71, 109-121.[3] Lee, C. D., Psathas, P. A. e Johnston, K. P. (1999). Water-in-Carbon Doxide Emulsions: Formation and Stability., Langmuir 15, 6781-6791.[4] Hunter, R. J. Foundations of Colloid Science, Clarendo,Oxford,, 1991, 177. [5] Wnali, K., Yi, Liu et. al. ( 2000). Interactions between alkali/surfactant/polymer and their effects on emulsion stability/. Colloids Surf. A. 175, 243-247.[6] Taylor, P. (1995). Ostwald ripening in emulsions/. Colloids Surf. A. 99, 175-185.[7] Sjöblom, J., Emulsions and Emulsion Stability-Surfactant science Series (61), Marcel Dekker: New Yok, 1996, 1-41.[8] Adamson, A. W. e Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, John Wiley & Sons, 1997.[9] Israelachvilli, J. (1997). The science and applications of emulsions-an overview Colloids Surf. A. 91, 1-8.[10] Davis, H. T. (1994). Factors determining emulsion type: hidrophile-lipophile balance and beyond Colloids Surf. A. 91, 9-24.[11] Stein, H. N. The -Surfactant science Series (61), Marcel Dekker: New Yok, 1996, 1-41.[12] Becher., P.Encyclopedia of Emulsion Technology-vol.3, NY, M. Dekker Inc.,1988.[13] Lim, F. Bomedical Application of Microencapsulation, CRC Press, Inc. : Boca Raton, USA, 1985.
FORMAÇÃO DE AGREGADOS POR MOLÉCULAS ANFIFÍLICAS
Surfactantes
Tensoativos ou agentes de superfície
“head” hidrofílica
“tail” hidrofóbica
Surfactantes em solução
cmc – concentração micelar crítica – faixa
estreita de concentração
Aparecimento de agregados (micelas)
Myers, 1999; Fendler, 1982
Tipos de Micelas
Jönsson e col., 1998
Número de monômeros de surfactantes em cada micela no sistema aquoso
constante em uma ampla faixa (~100 vezes cmc)
Número de Agregação
da concentração
Formação de diferentes tipos de agregados organizados: mesofases liotrópicas
Cristais Líquidos Liotrópicos
Efeito da temperatura sobre os tipos de
agregados formados por surfactantes não-
iônicos
(mesofases termotrópicas)
Cristais Líquidos Termotrópicos
Vesículas ou lipossomas
multivesículas
Fendler e col. 1982
Parâmetro de crítico de empacotamento, p
Dependente da natureza do grupo polar e cadeia hidrofóbica, concencentração, temperatura, pH etc.
Rodríguez-Hernández e col., 2005
MICELAS
Preparação de Micelas
Equilíbrio simples
Diálise
‘casting’
liofilização
Emulsão
o/a
Gaucher e col., 2005
Modelos de Solubilização
Rangel-Yagui e col., 2005
A introdução de moléculas ativas não muda significativamente o tamanho micelar.
O método de preparação exerce influência sobre a quantidade encapsulada.
Lukyanov e Torchilin, 2004
Eficiências de Encapsulamento
Métodos convencionais como HPCL, absorbância no UV/VIS, fluorescência.
Comumente variam de 1,5-50%.
Lukyanov e Torchilin, 2004
Técnicas de Caracterização
Espalhamento de luz dinâmico (DLS).
Espalhamento de luz estático (SLS).
Espalhamento de nêutrons a baixos ângulos (SANS).
Espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
Espalhamento de luz dinâmico (DLS)
Intensidade de luz espalhada por partículas em suspensão em movimento Browniano.
DT=kT/3d
cálculo do raio de hidratação, d (raio de Stokes)
Edwards e Baeumner, 2006
PLGA-PLURONIC-PVA system PLGA-PLURONIC system
Dynamic Light Scattering and zetapotencialmeasurements
Effective diameter = 2.120 nmPolydispersity 0.266
Effective diameter = 1.560 nmPolydispersity 0.326
Zeta potencial = -1,75 mV Zeta potencial = -35,6 mV
Espalhamento de luz estático (SLS)
Tempo médio de espalhamento em função do ângulo.
Informações sobre raio médio, massa molar e raio giratório.
Edwards e Baeumner, 2006
Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo (SAXS) e Espalhamento de Nêutrons a Baixo Ângulo (SANS)Mede-se a intensidade de luz espalhada em função do ângulo de espalhamento.
Interferências geradas por estruturas organizadas (seguem a lei de Bragg: d=n/2(1/sen=n)
Informações sobre tamanhos, formas e organizações de partículas. Linder e Zamb, 1991
Small Angle X-ray Scattering(SAXS)
http://srs.dl.ac.uk/arch/DALAI/SAXS.html
Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
Feixe de elétrons incidentes que interagem com a amostra de diferentes formas
Informações sobre tamanhos, formas e organizações de partículas.
Aplicações de sistemas micelares no carreamento
de bioativos PEG-b-PDLLA no encapsulamento do anticancerígeno Paclitaxel (formulação padrão com Cremofor EL, Taxol®)
Aumento da eficácia, diminuição de efeitos colaterais
Kim e col., 2004
Micelas baseadas em PEG-PE foram modificadas com o mAb 2C5, sendo reconhecidas por diversos tipos de tumores, conforme estudos realizados no encapsulamento de paclitaxel.
Lukyanov e Torchilin, 2004; Gao e col., 2003
Micelas de PEG-b-Phis foram relatados na forma micelar quando em pH fisiológico. A acidificação do meio aquoso provoca a ionização progressiva dos segmentos de Polihistidina (Phis), expondo as moléculas encapsuladas.
Gaucher e col., 2005; Lee e col., 2005
NANOPARTICULAS MICELARES COMERCIALIZADAS E EM
DESENVOLVIMENTO
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
FSD=female sexual dysfunction; PMH= post-menopausal hormone
CRISTAIS LÍQUIDOS
Técnicas de preparação similares aos de preparações de micelas.
Sagalowicz e col. 2006
Modelos de Solubilização
Técnicas de Caracterização Medidas de viscosidade
Microscopia óptica com luz polarizada.
Espalhamento de luz dinâmico (DLS).
Espalhamento de luz estático (SLS).
Espalhamento de nêutrons a baixos ângulos (SANS).
Espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS).
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
Microscopia óptica
Identificação das fases líquido cristalinos devido a observação de diferentes texturas.
Ex. fase hexagonal apresenta textura do tipo leque.
fase cúbica (isotrópica).
Microscopia óptica: exemplos de texturas
fase líquido cristalina hexagonal
fase líquido cristalina lamelar
Micrografias por cryo-TEM
de uma fase hexagonal
reversa (b); fase cúbica
hexagonal reversa de uma
dispersão de Dimodan U (c),
vesícula a partir de uma
fase lamelar a partir
de uma mistura de
Dimodan U e lactato de
sódio esteárico (d);
dispersão de micela de
solução de polissorbato
80 (e).
Sagalowicz e col. 2006
Aplicações Ciclosporina A, um peptídeo altamente lipofílico empregado no tratamento de inflamações dérmicas, foi encapsulado em fases cúbicas e hexagonais de monoleína, sendo que foi observado um aumento da permeação cutânea, além da diminuição da irritação.
Lopes e col., 2006
Aplicações
Furosemida como fármaco modelo em sistema líquido cristalino para aplicação oral. Foi obtida uma fase cúbica de monoleína que aumentou a biodisponibilidade do medicamento, além de promover uma liberação sustentada.
Sallam e col., 2002
LIPOSSOMAS
Preparação de lipossomas
Lipossomas: MLV, SUV, LUV
Preparação de lipossomasLipossomas: MUV, SUV, LUV
(http://www.avantipolarlipids.com/PreperationofLiposomes.html) jun/2006.
Modelos de Solubilização
Fendler, 1982
Caracterização de lipossomas
Número de lamelas
Distribuição de tamanhos
Composição e concentração de lipídios, além da eficiência de encapsulamento
Número de lamelas31P NMR (adição de Mn2+ que suprime o sinal P) NMR dos fosfolipídeos da face externa dos lipossomas.
SAXS
Cyo-TEM
Distribuição de Tamanhos DLS
SLS
HPLC-GEC-high-performance gel exclusion chromatography
Conteúdo de fosfolipídios Métodos colorimétricos
NMR
HPLC
Outras caracterizações DSC na interação ativo/membrana
NMR na organização das vesículas
Possibilidades de interações
Chorilli e col., 2004
Limitações da Primeira Geração de Lipossomas
Segunda Geração de Lipossomas: “Stealth”
Janof, 1999; Villanova e Consiglieri, 2000
Exemploinjeção em tumores sólidos, de maneira a reduzir efeitos colaterais e aumentar a citotoxicidade local. Após a injeção tumoral aproximadamente 90% dos lipossomas catiônicos permaneceram nos tumores.
Hashida e col., 2005
Geração Atual de Lipossomas
Exemplos Os Lipossomas funcionalizados com transferina aumentaram a eficiência de transporte para as células endoteliais capilares cerebrais de uma droga modelo, através de receptores de transferina, em comparação com as formulações sem transferina.
Visser e col., 2006
Exemplos
Lipídios galactosilados em lipossomas no encapsulamento da doxorubina promoveram direcionamento da droga para hepatócitos.
Wang e col. 2006
EXEMPLOS DE LIPOSSOMAS APROVADO PELA FDA
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
PRODUTOS LIPOSSOMAIS EM FASE CLINICA I/II APROVADA PELA FDA
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
PRODUTOS LIPOSSOMAIS EM FASE CLINICA III E IV APROVADA PELA FDA.
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
ALGUMAS VACINAS LIPOSSOMAIS EM DIFERENTESFASES CLÍNICAS
Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007
OUTROS TIPOS DE AGREGADOS ORGANIZADOS DE MOLÉCULAS
ANFIFÍLICAS
Complexos de poliíons (PIC) no carreamento de bioativos.
Yamamoto e col., 2001
Nanotubos de peptídeos
Hidrólise parcial de -lactalbumina na presença de Ca2+
Condições mais severas de hidrólise do que na pasteurização
Graveland-Bikker and Kruif, 2006
THE EMERGING FIELD OF NANOTUBE BIOTECHNOLOGYC. R. Martin and P. Kohli (NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY, 2, 29 (2003).
Yu et al. Bioconjugate Chem. 16, 1484-1487 (2005)
Nanofibras de Oligopeptídeo
Globular e Filamentos Fibras
Concentração
Fung e col., 2003
Bibliografia
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