Post on 16-Jul-2022
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – IBCCF
TANIRA GIARA MELLO
Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do
Cordão Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular
Encefálico Hemorrágico
RIO DE JANEIRO
2019
ii
TANIRA GIARA MELLO
Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão
Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia)
Primeiro orientador: Dra. Rosalia Mendez Otero
Segundo orientador: Dr. Pedro Moreno Pimentel Coelho
Co-orientador: Dr. Paulo Henrique Rosado de Castro
Rio de Janeiro
2019
iii
Mello, Tanira Giara.
Avaliação do potencial terapêutico de células mesenquimais do cordão umbilical
em modelo animal de acidente vascular encefálico hemorrágico. / Tanira
Giara Mello. – Rio de Janeiro: UFRJ / Centro de Ciências da Saúde, Instituto
de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2019.
xviii, 94 f.: il.; 31 cm.
Orientadores: Rosalia Mendez Otero e Pedro Moreno Pimentel Coelho.
Coorientador: Paulo Henrique Rosado de Castro.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro / Instituto de
Biologia, Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), 2019.
Referências: f. 87-94 .
1. Acidente Vascular Cerebral. 2. Terapia Baseada em Transplante de
Células e Tecidos. 3. Células-Tronco Mesenquimais. 4. Cordão Umbilical. 5.
Fisiologia - Tese. I. Mendez-Otero, Rosalia. II. Coelho, Pedro Moreno
Pimentel. III. Rosado de Castro, Paulo Henrique. III. Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica, Pós-Graduação em Ciências Biológicas
(Fisiologia). IV. Título.
iv
Tanira Giara Mello
Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão Umbilical em
Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia) do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Fisiologia)
Aprovada por:
_______________________________________ Dra Rosália Mendez Otero
______________________________________ Dr Pedro Moreno Pimentel Coelho
_____________________________________ Dr Paulo Henrique Rosado de Castro
_____________________________________ Dra Fernanda Ferreira Cruz (Revisora)
_____________________________________ Dra Ana Maria Blanco Martinez
_____________________________________ Dra Leandra Santos Baptista
_____________________________________ Dr Wagner Baetas Cruz
Rio de janeiro, de de 2019.
v
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Neurobiologia Celular e Molecular
do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e pelo Departamento de Ciência
e Tecnologia (DECIT) do Ministério da Saúde.
vi
Ao meu pequeno e amado Samir,
que dividiu parte da sua infância com esse trabalho.
vii
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Professora Rosália Mendez-Otero, por me aceitar como
aluna no seu grupo de pesquisa, apesar da minha condição em ter que dividir o
trabalho desta pesquisa com emprego e maternidade.
Ao meu segundo orientador Professor Pedro Moreno Pimentel Coelho, que foi
quem me ensinou a trabalhar com modelo animal e me deu imenso apoio para a
realização desta pesquisa.
Ao meu Co-orientador Professor Paulo Henrique Rosado de Castro, por todo
suporte para a realização dos experimentos de biodistribuição e ressonância
magnética, assim como apoio em diversos outros momentos.
À minha ex-chefe Ana Maria Braghirolli, ao meu atual chefe Julio César Suíta e
à diretoria do Instituto de Engenharia Nuclear, por terem me concedido um período de
liberação parcial de horas, para que eu pudesse fazer as disciplinas e realizar a parte
experimental desta Tese.
Aos diversos colaboradores deste trabalho: Professor Sérgio Augusto Lopes de
Souza, Professora Bianca Gutfilen, Professor Fernando Fernades Paiva, Fernanda
Meirelles, Juliana Ferreira Vasques, Teresa Puig Pijuan e Maria Fernanda.
À professora Fernanda Ferreira Cruz, que aceitou o convite para ser revisora
desta Tese.
Aos alunos de iniciação científica Raphael Santos de Almeida Rezende de
Mattos, William Simões Rangel Junior e Carla Araújo.
Ao técnico Felipe Marins e aos colegas do Laboratório de Neurobiologia Celular
e Molecular por todas as vezes que solicitei suporte.
À Erica Lima e à Marcilene pelo apoio no meu trabalho do IEN, quando precisei
me ausentar para realizar este trabalho.
Aos meus amigos de IEN Héricka Kennup, João Francisco e Brandão pelo
apoio moral.
viii
Aos meus pais Iara e Luiz e meus irmãos Márcia e Marcelo, que mesmo à
distância, sempre acreditaram em mim.
Aos meus sogros Lúcia e Angelo.
Ao meu filho Samirzinho, que é uma luz na minha vida, e levantou meu astral e
meu deu energias para prosseguir, em diversos momentos difíceis.
Ao meu marido Samir, que sem o seu apoio não seria possível eu realizar o
doutorado.
Às agências de fomento CNPq, FAPERJ e ao Ministério da Saúde pelo
financiamento a esta pesquisa.
ix
Resumo
MELLO, Tanira Giara. Avaliação do Potencial Terapêutico de Células Mesenquimais do Cordão Umbilical em Modelo Animal de Acidente Vascular Encefálico Hemorrágico. Rio de Janeiro, 2019. Tese de doutorado em Ciências Biológicas – Fisiologia. Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
O acidente vascular encefálico hemorrágico (AVEh) representa entre 10 a 20% de causas de AVE no mundo e tem uma taxa de letalidade de 40% em um mês, assim como alto índice de morbidade. O volume inicial do hematoma e a sua expansão são fatores que afetam o prognóstico do paciente. Apesar disso, até o momento não há um tratamento específico, existindo apenas terapias sintomáticas e/ou de apoio. Nesse contexto, a terapia celular representa uma perspectiva promissora para os pacientes com AVEh. Neste trabalho, estudamos a terapia celular realizada com células mesenquimais estromais extraídas da geleia de Wharton de cordão umbilical humano (hWJ-MSCs), injetadas por via intravenosa, em modelo animal de injeção de colagenase, que promove hemorragia dentro da região estriatal do cérebro de ratos. Foram estabelecidos dois graus diferentes de severidade da lesão (moderado e severo), assim como foram testadas duas janelas terapêuticas, uma na fase hiperaguda (1 h) e outra na fase aguda (24 h) após o AVEh severo, bem como o transplante na fase aguda (24 h) do AVEh moderado. Foi avaliada a eficácia da terapia celular através da realização de testes funcionais e da análise do volume de lesão em imagens adquiridas por ressonância magnética. No modelo de AVEh moderado, não foram demonstrados prejuízos funcionais permanentes, não sendo possível avaliar a eficácia do tratamento com os testes utilizados (Rotarod, Elevated body swing test e teste do cilindro). No entanto, houve uma redução estatisticamente significativa no volume de lesão no grupo tratado com hWJ-MSCs, em comparação ao grupo veículo. No modelo de AVEh de grau severo, no grupo tratado em 24 h, observou-se prejuízo funcional dos animais do grupo veículo no elevated body swing e no teste do cilindro em todos os tempos avaliados, e de forma transiente no teste do rotarod. No entanto, o grupo hWJ-MSCs não apresentou diferenças significativas em relação ao grupo veículo. A análise do volume de lesão também não demonstrou diferenças significativas entre os grupos. Já no modelo de AVEh de grau severo tratado com hWJ-MSCs apenas 1 h após início da hemorragia, não conseguimos detectar diferenças entre os grupos nos testes funcionais e na análise do volume de lesão. Esses resultados nos indicam que a eficácia da administração intravenosa de hWJ-MSCs para redução do volume de lesão parece depender do volume inicial do hematoma e que a administração das células na fase hiperaguda ou início da fase aguda da hemorragia parece não afetar o desfecho do AVEh severo. A biodistribuição das hWJ-MSCs marcadas com Tecnécio 99m mostrou haver uma captação preferencial pelos pulmões, rins, fígado e baço nas primeiras 24 h após a injeção, nos modelos de AVEh moderado e severo, assim como uma maior captação das células no hemisfério cerebral ipsilateral à lesão, indicando uma possível migração em direção ao hematoma.
Palavras-chave: Acidente vascular encefálico hemorrágico, terapia celular, células estromais mesenquimais, biodistribuição
x
Abstract
Intracerebral hemorrhage (ICH) represents between 10 and 20% of the causes of stroke worldwide and has a 40% mortality rate in one month, as well as a high morbidity rate. The initial hematoma volume and its expansion are factors that affect the prognosis of the patient. Nevertheless, there is no specific treatment so far, only symptomatic therapies and / or supportive care. In this context, cell therapy represents a promising perspective for ICH patients. In this study, we evaluated the cellular therapy performed with intravenous injection of human umbilical cord Wharton jelly stromal mesenchymal cells (hWJ-MSCs), using the collagenase injection ICH model to promote hemorrhage within the striatal region of the rat brain. We used two different degrees of injury severity (moderate and severe), as well as tested two therapeutic windows, one in the hyperacute phase and one in the acute phase in the model of severe ICH. We evaluated the effectiveness of cell therapy by performing behavioral tests and analyzing the lesion volume using magnetic resonance imaging. In the moderate ICH model, no permanent functional impairment was demonstrated, and it was not possible to evaluate the efficacy of the treatment with the tests used. However, there was a statistically significant reduction in lesion volume in the hWJ-MSCs group compared to the vehicle group. In the severe ICH model, in the group treated at 24 h, we observed functional impairment of the animals of the vehicle group in the elevated body swing test and cylinder test at all times evaluated, and a transient impairment in the rotarod test. The hWJ-MSCs group did not present significant differences in relation to the vehicle group. Injury volume analysis showed no significant differences between groups. In the severe ICH model which received hWJ-MSCs 1 h after the onset of bleeding, we could not detect differences between groups in the behavioral tests and in the lesion volume analysis. These results showed that the efficacy of intravenous administration of hWJ-MSCs to reduce lesion volume seems to depend on the initial hematoma volume and that administration of cells in the hyperacute or early acute phase of hemorrhage for severe ICH does not seem to affect the outcome of severe ICH. The biodistribution of technetium 99m-labeled hWJ-MSCs showed preferential uptake by the lungs, kidneys, liver and spleen within the first 24 h after injection, in moderate and severe ICH models, as well as increased uptake of cells in the ipsilateral brain hemisphere, indicating a possible migration towards the hematoma.
Keywords: intracerebral hemorrhage, stroke, cell therapy, mesenchymal stromal cells,
biodistribution
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Número de óbitos no Brasil causados por acidente vascular encefálico.......2
Figura 2: Representação do modelo de injeção de colagenase .................................... 6
Figura 3: Representação da fisiopatologia do AVEh ................................................... 12
Figura 4: Representação da aparência da hemorragia na ressonância magnética e a
estrutura da hemoglobina e seus produtos de oxidação ............................................. 18
Figura 5: Representação gráfica dos modelos animais .............................................. 25
Figura 6: Representação da extração das células mesenquimais da geleia de Wharton
de cordão umbilical humano........................................................................................ 37
Figura 7: Caracterização das MSCs de cordão umbilical por imunofenotipagem.. ..... 47
Figura 8: Diferenciação das hWJ-MSCs em linhagens celulares mesodérmicas. ....... 48
Figura 9: Teste do Rotarod no AVEh moderado ......................................................... 49
Figura 10: Elevated body swing test no AVEh moderado. .......................................... 50
Figura 11: Teste do cilindro no AVEh moderado ......................................................... 51
Figura 12: Volume de lesão nos animais com AVEh moderado.................................. 52
Figura 13: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh moderado. ............ 53
Figura 14: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh
moderado em uma sequência T2* .............................................................................. 54
Figura 15: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh
moderado .................................................................................................................... 55
Figura 16: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh moderado ... 56
Figura 17: Teste do Rotarod no AVEh severo 24 h.. ................................................... 57
Figura 18: Elevated body swing test no AVEh severo 24 h ......................................... 58
xii
Figura 19: Teste do cilindro no AVEh severo 24 h. ..................................................... 59
Figura 20: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 24 h. .............................. 61
Figura 21: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo. ................. 62
Figura 22: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh
severo 24h em uma sequência T2*. ............................................................................ 63
Figura 23: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh
severo 24 h. ................................................................................................................. 64
Figura 24: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh severo 24 h. 65
Figura 25: Avaliação funcional dos animais AVEh severo que receberam injeção 1 h
após cirurgia.. .............................................................................................................. 67
Figura 26: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h.. ............................... 69
Figura 27: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h.. .......... 70
Figura 28: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh
severo 1h em uma sequência T2*. ............................................................................. 71
Figura 29: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h versus 24
h. ................................................................................................................................. 71
Figura 30: Representação da imagem de corpo inteiro dos animais que receberam
MSCs marcadas com 99mTc ........................................................................................ 73
Figura 31: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m Tc. ................................... 74
Figura 32: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m Tc nos hemisférios
cerebrais...................................................................................................................... 75
xiii
LISTA DE SIGLAS
AD-MSCs – células estromais mesenquimais extraídas de tecido adiposo
AVE – acidente vascular encefálico
AVEh - acidente vascular encefálico hemorrágico
BHE – barreira hematoencefálica
BM-MSCs – células estromais mesenquimais extraídas da medula óssea, do inglês
bone marrow
BSA – soro de albumina bovina, do inglês bovine serum albumine
CMMO – células mononucleares derivadas da medula óssea
CXCR4 - receptor de quimiocina CXC tipo 4
EBST – teste de balanço corporal elevado, do inglês elevated body swing test
ESCs - células tronco embrionárias, do inglês embryonic stem cells
DMEM – meio Eagle modificado por Dulbecco, do inglês Dulbecco’s modified Eagle
medium
FGF-2 - fator de crescimento de fibroblasto 2, do inglês fibroblast growth fator 2) e
interleucina 1β (IL-1β)
GBD – carga global de doenças, do inglês global burden of disease
GFAP – proteína glial fibrilar ácida, do inglês glial fibrillary acidic protein
GRE - eco gradiente, do inglês Gradient echo
hWJ-MSCs – células mesenquimais humanas extraídas da geleia de Wharton, do
inglês human Wharton’s jelly
IDO – indoleamina 2,3 dioxigenase
IFN-γ - interferon γ
IL-1β - interleucina 1β
xiv
IL-6 – interleucina 6
IL-10 – interleucina 10
iPSCs – células-tronco pluripotentes induzidas do inglês induced pluripotent stem cell
ISCT - Sociedade Internacional de terapia Celular, do inglês International Society of
Cell Therapy
MAC – complexo de ataque a membrana, do inglês membrane attack complex
MHC – complexo principal de histocompatibilidade, do inglês major histocompatibility
complex
MMPs – metaloproteinases de matriz, do inglês matrix metalloproteinases
MSCs – células estromais mesenquimais, do inglês mesenchymal stromal cells
NSCs – células-tronco neurais, do inglês neural stem cell
NOS2 – óxido nítrico sintetase 2, do inglês nitric oxide synthase 2
PBS – tampão salina fosfato, do inglês phosphate buffer saline
PFA - paraformaldeído
PGE2 – prostaglandinas E2
PPARγ - receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama, do inglês
peroxisome proliferator-activated receptors
RGCs - células ganglionares da retina, do inglês retinal ganglion cells
RM – ressonância magnética
rMSCs – células estromais mesenquimais de ratos
ROI - região de interesse, do inglês region of interest
ROS – espécies reativas de oxigênio, do inglês reactive oxygen species
SDF-1 - fator derivado de célula estromal 1, do inglês stromal cell-derived factor 1
SFB – soro fetal bovino
xv
SNC – sistema nervoso central
SPECT – tomografia computadorizada por emissão de fóton único, do inglês single
photon emission computed tomography
STICH II – Ensaio cirúrgico para hemorragia intracerebral II, do inglês Surgical Trial
for Intracerebral Haemorrhage II
TGF-1- fator de transformação do crescimento, do inglês transforming growth fator 1
TLR – receptor do tipo toll, do inglês toll-like receptor
TNF-α – fator de necrose tumoral, do inglês tumor necrosis factor α
TSG-6 – proteína do gene 6 estimulada por TNF, do inglês TNF-stimulated gene 6
protein
UC-MSCs - células estromais mesenquimais extraídas de cordão umbilical
VEGF - fator de crescimento do endotélio vascular, do inglês vascular endothelial
growth fator
xvi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ............................................................................................... VII
Resumo .................................................................................................................... IX
Abstract ..................................................................................................................... X
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. XI
LISTA DE SIGLAS ................................................................................................. XIII
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
1.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO .............................................................. 1
1.2 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO (AVEH) .................... 2
1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E TERAPIAS EM ACIDENTE VASCULAR
ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO ................................................................................. 3
1.4 MODELOS PRÉ-CLÍNICOS DE AVEH ............................................................... 5
1.5 AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO SENSORIOMOTORA EM MODELOS ANIMAIS ..... 8
1.6 FISIOPATOLOGIA DO ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO
.......................................................................................................................... 10
1.7 AVALIAÇÃO DA EVOLUÇÃO DO AVEH POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA EM
MODELO ANIMAL .................................................................................................... 14
1.8 TERAPIA CELULAR ......................................................................................... 19
1.8.1 Células-tronco ................................................................................................ 19
1.9 TERAPIA CELULAR COM MSCS EM DOENÇAS NEUROLÓGICAS .............. 23
1.9.1 Terapia celular com MSCs no AVEh............................................................... 24
1.10 BIODISTRIBUIÇÃO DE CÉLULAS TRONCO APÓS TRANSPLANTE
INTRAVENOSO ........................................................................................................ 28
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 31
3. HIPÓTESE .......................................................................................................... 32
4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 33
5. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 34
5.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ............................................................................. 34
5.2 DESENHO EXPERIMENTAL PARA TESTE FUNCIONAL E RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA ............................................................................................................. 34
5.3 CIRURGIA ........................................................................................................ 35
xvii
5.4 EXTRAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON E CULTIVO CELULAR ....
36
5.5 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON ........................ 38
5.5.1 Imunofenotipagem das hWJ-MSCs ................................................................ 38
5.5.2.1 Diferenciação Condrogênica .................................................................... 39
5.5.2.2 Diferenciação Osteogênica ...................................................................... 39
5.5.2.3 Diferenciação Adipogênica ....................................................................... 40
5.6 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CÉLULAS .......................................... 40
5.7 PERFUSÃO TRANSCARDÍACA ....................................................................... 41
5.8 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA.......................................................................... 41
5.8.1 Ressonância Magnética – Modelo AVEh moderado ....................................... 41
5.8.2 Ressonância Magnética – Modelo AVEh severo ............................................ 42
5.9 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99m TC . 43
5.10 AVALIAÇÃO FUNCIONAL ................................................................................ 44
5.10.1 Rotarod ........................................................................................................... 44
5.10.2 Elevated body swing test ................................................................................ 44
5.10.3 Teste do cilindro ............................................................................................. 45
5.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 45
6. RESULTADOS ................................................................................................... 47
6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON ........................ 47
6.2 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO ............. 48
6.3 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO
51
6.4 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH MODERADO ................................. 54
6.5 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 24 H ........... 57
6.6 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO
24H .......................................................................................................................... 59
6.7 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH SEVERO 24 H ............................... 63
6.8 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1 H ............. 66
6.9 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1H
.......................................................................................................................... 68
6.10 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99m TC7272
7. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 76
xviii
7.1 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O VOLUME DE LESÃO
EM ANIMAIS COM AVEH ......................................................................................... 76
7.2 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O PREJUÍZO
FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH ................................................................. 80
7.3 BIODISTRIBUIÇÃO DAS HWJ-MSCS EM ANIMAIS COM AVEH ...................... 83
8. CONCLUSÕES .................................................................................................. 86
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 87
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO
O acidente vascular encefálico (AVE) é classicamente definido pela Organização
Mundial da Saúde como ―um conjunto de manifestações clínicas decorrentes de
perturbação neurológica focal ou global, de início súbito, com duração superior a 24
horas e/ou evolução para o óbito, atribuído a causa vascular‖. No entanto, a American
Heart Association e a American Stroke Association, consideram essa definição
desatualizada, pois leva em conta apenas os sintomas clínicos, sem considerar os
avanços em tecnologia, como as imagens por ressonância magnética (RM) ou
tomografia computadorizada, e incluiria também na sua definição infartos silenciosos
(SACCO et al., 2013; COUPLAND et al., 2017).
O AVE é a segunda principal causa de morte no mundo, sendo que em 2016
causou 5,5 milhões de mortes. Também é a segunda causa de incapacitação,
havendo mais de 80 milhões de sobreviventes de AVE no mundo. São estimados
116,4 milhões de anos de vida perdidos ajustados por incapacidade relacionados ao
AVE, segundo o estudo do GBD (GBD, do inglês Global Burden of Disease) de 2016
(JOHNSON, 2019). É um problema de saúde global, susceptível a aumentar no
futuro, devido às alterações demográficas em curso, incluindo o envelhecimento da
população e as transições de saúde observadas em países em desenvolvimento
(FEIGIN et al., 2015).
No Brasil, segundo o Sistema de Informação de Mortalidade do Datasus (2019),
entre 2015 e 2017, ocorreram 117.893 óbitos causados por acidente vascular
encefálico não especificado como hemorrágico ou isquêmico (Figura 1). Estatísticas
brasileiras indicam que em 2016, o AVE foi a segunda causa mais frequente de óbito
na população, apresentando uma taxa bruta de 52,2 mortes por 1000 habitantes. As
taxas padronizadas de morte para 100 mil habitantes foram de 62,5 para o sexo
masculino e de 43,4 para o sexo feminino (Ministério da Saúde, 2019).
2
1.2 ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO (AVEH)
O AVE pode ser classificado nos tipos hemorrágico e isquêmico. O AVE
hemorrágico (AVEh) representa entre 10% a 20% dos casos no mundo (AN; KIM;
YOON, 2017). Uma hemorragia será classificada como um AVE se for causada por
um evento vascular, se resultar em uma injúria ao sistema nervoso central (SNC), e
se não for causada por origem traumática. O processo hemorrágico pode ser
subaracnóide ou intracerebral. A primeira ocorre quando há extravasamento de
sangue para o espaço subaracnóideo, geralmente por ruptura de aneurisma
intracraniano. Já a hemorragia intracerebral, pode ser definida como um sangramento
dentro do parênquima cerebral ou do sistema ventricular e que não foi causada por
trauma (SACCO et al., 2013). O AVEh apresenta uma incidência no mundo de 24,6
para cada 100.000 pessoas e uma taxa de letalidade de aproximadamente 40% em
um mês, 54% em um ano e 71% em 5 anos, sendo que metade das mortes ocorre
nas primeiras 48 a 72 h (AGUILAR e BROTT, 2011). O AVE do tipo isquêmico é mais
freqüente, mas o AVEh é responsável por mais mortes e mais anos de vida perdidos
ajustados por incapacidade (KATAN; LUFT, 2018). A prevalência no mundo em 2013
foi estimada em 4 milhões de homens e 3,36 milhões de mulheres (FEIGIN;
NORRVING; MENSAH, 2017). Apenas 12% a 39% dos pacientes atingem
independência funcional a longo prazo (AN; KIM; YOON, 2017).
A idade, o sexo e a etnia influenciam na incidência do AVEh, como provavelmente
também os fatores ambientais. Ocorre uma incidência maior entre asiáticos do que
Figura 1: Número de óbitos no Brasil por região, causados por acidente vascular encefálico não especificado isquêmico ou hemorrágico entre 2015 e 2017. Fonte: Datasus, 2019.
3
em outros grupos étnicos, sendo que entre japoneses, há maior incidência em
homens do que em mulheres (não sendo essa diferença significativa em outros
grupos) (VAN ASCH et al., 2010). A incidência aumenta com a idade, sendo quase
dez vezes maior entre pessoas acima de 85 anos do que em pessoas entre 45 a 54
anos (VAN ASCH et al., 2010). No Brasil, pesquisa realizada nos hospitais de
Fortaleza mostrou que a incidência de AVEh intraparenquimal foi de 15,2% (DE
CARVALHO et al., 2011).
O principal fator de risco do AVEh é a hipertensão arterial, que está mais
associada a uma hemorragia localizada em região profunda no cérebro, enquanto a
segunda maior causa é a angiopatia amiloide cerebral, mais relacionada às
hemorragias que ocorrem nos lobos frontal, occipital e parietal. Outros fatores de risco
modificáveis associados são: tabagismo, álcool, hipercolesterolemia, diabetes
mellitus, e o uso de anticoagulantes, especialmente a warfarina, drogas
simpaticomiméticas (como cocaína, heroína e anfetaminas) e agentes
antiplaquetários (DASTUR; YU, 2017; AN; KIM; YOON, 2017). Um prognóstico de má
qualidade de vida parece estar mais associado a uma hemorragia intracerebral
profunda, na qual uma hemorragia nos núcleos da base pode causar déficits motores
mais graves ou prejudicar múltiplas funções corticais, como linguagem, sensação e
percepção espacial (CHRISTENSEN; MAYER; FERRAN, 2009).
1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS E TERAPIAS EM ACIDENTE VASCULAR
ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO
Os sintomas mais comuns do AVEh são cefaleia, náusea e vômito. A cefaleia
é mais comum em pacientes que apresentam grandes hematomas e é atribuída à
tração nas fibras de dor das meninges, aumento da pressão intracraniana ou sangue
no líquido cerebrospinal. Pacientes com grandes hemorragias frequentemente tem
uma diminuição no nível de consciência devido ao aumento da pressão intracraniana
e à compressão do tálamo e tronco cerebral. A deterioração neurológica é comum
antes e durante a internação hospitalar e pode indicar aumento precoce do hematoma
ou agravamento do edema (AN; KIM; YOON, 2017). A hemorragia intracerebral
profunda ocorre principalmente nos núcleos da base e cápsula interna (35-70%),
4
tronco cerebral (5-10%) ou cerebelo (5-10%), correspondendo a dois terços da
hemorragia intracerebral espontânea, enquanto a hemorragia lobar corresponde a um
terço dos casos (AGUILAR e BROOT, 2011). Broderick et al. (1993) mostraram que o
volume de hemorragia intracerebral é um forte preditivo de mortalidade em 30 dias
para todos os locais de hemorragia intracerebral, combinado com a escala de
Glasgow. Pacientes com hemorragias parenquimais superiores a 60 mL e com escala
de Glasgow igual ou inferior a 8 apresentaram uma mortalidade prevista em 30 dias
de 91%. Além disso, 44% do total de pacientes, com volume de hemorragia tanto
superior quanto inferior a 60 mL, foram a óbito em 30 dias, sendo que a metade dos
óbitos ocorreu nos dois primeiros dias.
Estudo de Salihovic et al. (2013) mostrou que a melhor taxa de sobrevida em 6
meses ocorreu em pacientes que apresentavam um volume de hematoma de até 29
mL, enquanto a maior taxa de mortalidade ocorreu em pacientes com volumes de
hematoma maiores que 60 mL. Mais da metade dos pacientes que sobreviveram 6
meses após AVEh ficaram funcionalmente independentes, indicando que o volume de
hematoma influenciou significantemente no prognóstico no período de 6 meses.
O AVEh é uma emergência médica, sendo crucial que haja um diagnóstico
rápido e um manejo clínico eficiente do paciente, pois é comum a deterioração
neurológica ocorrer nas primeiras horas. Mais de 20% dos pacientes sofrem uma
diminuição na escala de coma de Glasgow de 2 ou mais pontos entre o atendimento
pré-hospitalar e a avaliação inicial na emergência médica. Além disso, 15% a 23%
dos pacientes demonstram deterioração contínua nas primeiras horas após a
chegada ao hospital. Assim, o risco da deterioração neurológica precoce e as altas
taxas de resultados ruins em longo prazo fazem com que seja necessário um
tratamento precoce agressivo (HEMPHILL et al., 2015).
O tratamento cirúrgico para muitos pacientes com AVEh espontâneo
permanece controverso (CHEN; ZENG; HU, 2014). A fundamentação teórica para a
retirada do hematoma gira em torno dos conceitos de prevenir uma herniação, reduzir
a pressão intracraniana, e diminuir o impacto fisiopatológico do hematoma no tecido
circundante, através da diminuição dos efeitos de massa e da toxicidade celular dos
produtos sanguíneos, como será discutido adiante (HEMPHILL et al., 2015). Ensaios
clínicos randomizados comparando a cirurgia com um tratamento conservador não
demonstraram um claro benefício a favor da intervenção cirúrgica. O momento para
5
realizar a cirurgia também permanece controverso. Ensaios prospectivos
randomizados relataram uma janela de tempo para realizar a cirurgia entre 4 a 96
horas após início dos sintomas. A análise de subgrupos em STICH II (do inglês
Surgical Trial for Intracerebral Haemorrhage II) sugeriu uma tendência de resultados
melhores para pacientes operados antes de 21 horas. Uma meta-análise de 2186
pacientes de oito ensaios de cirurgia para AVEh encontrou que a cirurgia apresentava
melhores resultados quando realizada dentro de 8 horas após a hemorragia para
pacientes com as seguintes características: volume de hematoma entre 20 a 50 mL,
escala de coma de Glasgow entre 9 e 12, pacientes entre 50 a 69 anos e que
apresentavam hematomas superficiais sem hemorragia intraventricular (CHEN;
ZENG; HU, 2014; HEMPHILL et al., 2015).
Como se pode observar, as intervenções clínicas ou cirúrgicas existentes para
tratamento do AVEh são apenas terapias sintomáticas e/ou de apoio e não são
suficientemente efetivas para melhorar os maus resultados funcionais e a alta taxa de
mortalidade. Em vista dessa realidade, uma medicina regenerativa baseada em
células-tronco, representa uma perspectiva promissora para os pacientes com AVEh
(HEMPHILL et al., 2015; MA et al., 2015). A terapia celular para AVEh será tratada no
item 1.9.1.
1.4 MODELOS PRÉ-CLÍNICOS DE AVEH
Os modelos animais mais utilizados para induzir AVEh são o da injeção de
sangue autólogo, coletado de vasos superficiais e injetado geralmente na região do
estriado, e principalmente, o modelo da injeção de colagenase bacteriana tipo IV, VII
ou XI, descrito por Rosenberg et al. em 1990. Neste modelo, a colagenase leva à
degradação do colágeno presente na lâmina basal dos vasos sanguíneos cerebrais,
provocando assim o AVEh. Um terceiro modelo existente é o da inserção de um micro
balão no núcleo caudado. No entanto, esse último modelo serve apenas para estudar
os efeitos de massa do AVEh, pois não reproduz fatores como a toxicidade dos
elementos do sangue e a ruptura da barreira hematoencefálica (BHE/unidade
neurovascular) (MANAENKO et al., 2013).
O modelo de injeção de sangue mimetiza um único grande sangramento,
mas não reproduz um sangramento espontâneo, e nem o fato de que um
sangramento pode perdurar até 24 h em alguns pacientes. Assim, esse modelo não é
6
apropriado para estudar sangramentos contínuos ou intervenções que possam afetar
o sangramento, mas é melhor para investigar mecanismos de danos hemorrágicos. Já
o modelo de injeção de colagenase (Figura 2), em que há a ruptura da lâmina basal
dos vasos sanguíneos, fazendo com que o sangue vaze para o tecido cerebral
adjacente, é mais utilizado por aqueles que querem uma hemorragia espontânea e
mais consistente (MACLELLAN et al., 2008), permitindo avaliar também a formação
do edema e as alterações histológicas resultantes da hemorragia (MANAENKO et al.,
2013).
Figura 2: Representação do modelo de injeção da colagenase, mostrando a inserção da agulha na região estriatal. A seringa contém colagenase bacteriana, que ao ser injetada degrada o colágeno presente nos vasos sanguíneos. Modificado de Huang et al.(2015).
Em estudo comparativo entre os dois principais modelos, Maclellan et al.
(2008) observaram que o modelo induzido por colagenase produzia déficts
neurológicos mais significantes, quando avaliados pelo teste da escala de déficits
neurológicos. Os dois modelos apresentaram déficit neurológico, porém com o
modelo induzido por colagenase, o déficit produzido foi significantemente maior do
que o com o modelo de injeção de sangue. A recuperação funcional também ocorreu
de maneira mais gradual com a injeção de colagenase, com os animais não
apresentado recuperação nos 28 dias de avaliação. Já os animais que receberam a
injeção de sangue mostraram recuperação no 21° dia. Também consideraram que o
modelo da injeção de colagenase era melhor para observar a ruptura da BHE,
demonstrando que a ruptura ocorria entre um período de 12 h a 2 dias após cirurgia,
7
como demostrado através de aquisição de imagens por RM realizada com contraste.
Observaram também que a perda neuronal era maior neste modelo, visto que havia
uma lesão maior na região estriatal e em regiões mais distais do hematoma, já que
ocorria uma maior difusão da colagenase pelo tecido cerebral. O modelo da
colagenase também permite a obtenção de diferentes volumes de lesão, ou seja,
diferentes graus de severidade de AVEh. Maclellan et al. (2006) trabalharam com a
injeção estriatal de três diferentes doses de colagenase. Injetaram 0,06 U, obtendo
um grau de lesão branda; 0,12 U, obtendo uma lesão moderada; e 0,18 U de
colagenase, levando a uma lesão severa. Os volumes de lesão obtidos foram
crescentes, conforme o aumento da dose injetada, sendo estatisticamente diferentes
entre si.
Beray-Berthat et al. (2010) mostraram que um volume de lesão médio inicial
(no tempo de 24h), de 48.9 mm3 em ratos, produzido pela injeção de 0,12 U de
colagenase, conduzia a um déficit neurológico por aproximadamente 2 meses nos
animais. No beam walking test, o prejuízo funcional foi observado por 35 dias,
enquanto no teste de remoção de adesivo e de escala neurológica o déficit por 56
dias. Maclellan et al. (2006) já haviam também demonstrado um déficit por 21 dias
com uma lesão produzida com essa mesma dose de colagenase e por 28 dias
quando a lesão era induzida com 0,18 U de colagenase. Em termos de desvantagens
do modelo da injeção da colagenase, tem-se o fato da mesma poder causar
inflamação, visto que é de origem bacteriana (MANAENKO et al., 2013).
Como observado, nenhum dos dois modelos reproduz com precisão todos os
aspectos da doença humana. No entanto, ambos os protocolos resultam em
tamanhos de hematoma reprodutíveis e devem continuar a ser utilizados até melhores
métodos serem desenvolvidos (TURNBULL et al., 2019). Para o estudo dessa tese,
escolheu-se utilizar o modelo da injeção da colagenase, o qual se considerou mais
pertinente por reproduzir melhor o sangramento espontâneo que ocorre durante o
AVEh e causar um maior prejuízo neurológico nos animais.
8
1.5 AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO SENSORIOMOTORA EM MODELOS ANIMAIS
Como mencionado anteriormente, a hemorragia intracerebral profunda ocorre
principalmente nos núcleos da base, mais frequentemente no putâmen (AN; KIM;
YOON, 2017), umas das regiões que fazem parte do estriado, junto com o núcleo
caudado. Nos roedores, essas duas regiões são estruturalmente fundidas,
diferentemente dos primatas (JIANG; KIM, 2018). Nos modelos animais de isquemia
cerebral e de AVEh, o córtex sensório-motor e/ou o estriado de um hemisfério são
frequentemente danificados com uma lesão severa (SCHALLERT, 2006), havendo a
perda de função de membros, concentrando assim os testes em avaliações motoras e
sensoriais (SCHAAR; BRENNEMAN; SAVITZ, 2010).
É importante que os testes funcionais sejam sensíveis para detectar as
deficiências que ocorrem após um AVE. As avaliações funcionais também oferecem a
oportunidade de monitorar os tratamentos farmacêuticos e os baseados em terapia
celular, através da observação das melhorias funcionais ao longo do tempo
(SCHAAR; BRENNEMAN; SAVITZ, 2010). Assim, com o objetivo de avaliar a perda
funcional em decorrência do AVEh e se houve ou não recuperação funcional dos
animais com a terapia celular proposta neste trabalho, foram escolhidos três
diferentes testes funcionais: Rotarod, elevated body swing test (EBST) e teste do
cilindro.
O teste do rotarod é utilizado para avaliar a coordenação motora e alterações
do equilíbrio nos roedores (SCHAAR; BRENNEMAN; SAVITZ, 2010). Este teste
consiste em colocar o animal sobre um cilindro giratório, avaliando-se o tempo que o
animal consegue se equilibrar sobre esse cilindro. Os animais com AVE demonstram
ter tempos significantemente mais curtos de permanência no cilindro. Pacientes que
sobreviveram a um AVE frequentemente sofrem de falta de coordenação motora, e
essa avaliação comportamental oferece uma abordagem para investigar déficits de
coordenação em modelo animal.
O EBST foi descrito em 1995 por Borlongan e Sanberg como um teste para
avaliar o comportamento motor assimétrico em um modelo animal de doença de
Parkinson. Logo depois disso, o EBST foi empregado pelo mesmo grupo de pesquisa
9
também em estudos animais da doença de Huntington e AVE isquêmico. A ideia
básica é que quando o animal é levantado pela cauda e mantido verticalmente, ele
balança a cabeça para a esquerda ou para a direita. Enquanto os animais saudáveis
são capazes de balançar cerca de 50% para ambos os lados, animais com uma lesão
cerebral unilateral, devem apresentar uma direção de oscilação
dominante/tendenciosa. Sugere-se que a extensão de tal atividade de oscilação
enviesada, é uma medida de lateralização do comportamento motor. Nos casos de
lesão unilateral do estriado, já foi descrito que os animais apresentam uma
preferência pelo lado contralateral da lesão.
Assimetrias no uso do membro anterior durante a exploração espontânea das
paredes de um recipiente cilíndrico são comuns após isquemia cerebral ou
hemorragia unilateral em ratos e camundongos. Essa observação foi primeiramente
descrita por Schallert et al. (2000), que relataram que o teste distinguia com sucesso
os ratos sham de ratos que sofreram AVE isquêmico, até um mês após o evento. O
teste do cilindro é um teste de exploração vertical-lateral e fornece uma maneira de
avaliar o uso espontâneo do membro anterior de um roedor e tem sido usado em
vários modelos de lesão do sistema motor. Os ratos exploram ativamente as
superfícies verticais do cilindro, elevando-se em seus membros posteriores e
explorando a superfície com seus membros anteriores e vibrissas (SCHAAR;
BRENNEMAN; SAVITZ, 2010). O uso diminuído do membro anterior comprometido
tem sido interpretado como um déficit motor (JENSEN et al., 2011). Giraldi-Guimarães
et al. (2009) observaram que no teste do cilindro, em modelo de AVE isquêmico, os
animais do grupo controle tinham preferência ao uso da pata ipsilateral à lesão,
durante um período avaliado de 28 dias. O mesmo ocorreu no trabalho de
Vasconcelos-dos-Santos et al. (2010), que demonstrou não haver recuperação
funcional para os animais com AVE isquêmico do grupo controle, por um período de
77 dias.
10
1.6 FISIOPATOLOGIA DO ACIDENTE VASCULAR ENCEFÁLICO HEMORRÁGICO
Durante uma hemorragia intracerebral, a rápida acumulação de sangue
dentro do parênquima cerebral leva à ruptura da anatomia normal e ao aumento da
pressão local. Dependendo da dinâmica de expansão do hematoma (crescimento), o
dano primário ocorre dentro de minutos a horas desde o início do sangramento e é
resultado principalmente de danos mecânicos associados ao efeito de massa
(ARONOWSKI; ZHAO, 2011). Embora mais de dois terços dos pacientes com AVEh
parem de sangrar logo após o icto, a expansão do hematoma ocorre em um terço dos
pacientes (20 a 40% dos pacientes) em 24 horas (HU et al., 2016).
Em um estudo em que se demonstrou que 22% dos pacientes tinham
expansão do hematoma, também se revelou que em 17% dos casos, a expansão
ocorreu após 6 horas ou mais do AVEh. Outro estudo mostrou que 38% dos pacientes
tiveram a expansão do hematoma dentro de 20 horas (XI; KEEP; HOFF, 2006; HUA
XI, 2012). A expansão precoce do hematoma está associada a desfechos clínicos
ruins e a taxas de mortalidade mais elevadas, em comparação quando não há
expansão. Já foi relatado que pacientes que apresentam expansão do hematoma
observada após 1 h do início da hemorragia por tomografia computadorizada
apresentaram reduções significantes na escala de coma de Glasgow e no National
Institute of Health Stroke Scale, quando comparadas com aqueles pacientes sem
crescimento do hematoma, sugerindo que intervenções que visem a reduzir tal
processo podem ser uma importante estratégia para melhorar a sobrevida e o
funcionalidade dos pacientes após o AVEh (LIM-RING e RINCON, 2017). Se o
volume da hemorragia for menor que 140 mL, muitos pacientes sobrevivem ao AVE
inicial. Entretanto, o próprio hematoma pode levar a uma lesão cerebral secundária,
resultando em déficit neurológico severo e algumas vezes em fatalidade tardia (XI;
KEEP; HOFF, 2006). Essa lesão secundária pode ser causada por uma cascata de
eventos iniciada pela lesão primária, pela resposta fisiológica ao hematoma (ex.:
inflamação) e pela liberação de componentes de coagulação (KEEP; HUA; XI, 2012).
O edema cerebral peri-hematoma se desenvolve imediatamente após o
AVEh e tem picos vários dias mais tarde. Em modelos experimentais, o pico do
edema ocorre em torno do terceiro ou quarto dia após a hemorragia, e declina
lentamente depois. Em seres humanos o edema peri-hematoma se desenvolve dentro
11
de 3 horas após o início dos sintomas e tem seu pico entre 10 e 20 dias após a
hemorragia (XI; KEEP; HOFF, 2006), tendo sido implicado como um fator contribuinte
para a deterioração neurológica tardia no AVEh (LIM-RING e RINCON, 2017). Estudo
com 17 pacientes que passaram por uma tomografia computadorizada 5 horas após o
início dos sintomas, e 1, 3 e 10 dias depois, mostrou que o tamanho do hematoma
estava reduzido significantemente no dia 10, enquanto o volume de edema aumentou
gradualmente ao longo desse tempo (HUA et al., 2007). Há várias fases da
formação do edema após o AVEh. A fase inicial envolve aumento da pressão
hidrostática e a retração do coágulo com circulação de soro do coágulo para o tecido
circundante. A segunda fase (dois primeiros dias) está relacionada com a cascata de
coagulação e a produção de trombina, e a terceira fase está relacionada com a lise
dos eritrócitos e a toxicidade da hemoglobina (XI; KEEP; HOFF, 2006).
Evidências sugerem que a hemoglobina e o ferro liberados do hematoma são
os principais contribuintes da lesão cerebral induzida por uma hemorragia
intracerebral. Injeções de eritrócitos lisados em cérebros de roedores causam lesão
cerebral, o que é mimetizado pela infusão de hemoglobina e ferro (KEEP; HUA; XI,
2012). O heme é degradado no cérebro pela heme oxigenase-1 em ferro (Figura 3),
monóxido de carbono e biliverdina, a qual é convertida em bilirrubina pela biliverdina
redutase (XI; KEEP; HOFF, 2006). Já foi encontrada uma concentração três vezes
maior de ferro não-heme na zona de peri-hematoma no cérebro após AVEh em ratos,
e este nível permaneceu elevado por pelo menos um mês (HUA et al., 2007). O
mecanismo proposto da neurotoxicidade induzida pelo heme e pelo ferro seria o da
ativação da heme oxigenase-1 e da produção de radicais livres mediados pelo ferro
via reação de Fenton (MRACSKO; VELTKAMP, 2014). Os radicais livres de oxigênio
e nitrogênio podem causar dano nas células endoteliais, ativar as vias de ativação
celular que regulam a permeabilidade da BHE (KEEP et al., 2014), assim como
induzir apoptose neuronal (DUAN et al., 2016).
Uma resposta tecidual inicial na hemorragia intracerebral é a ativação dos
mecanismos hemostáticos para limitar o sangramento. A trombina tem um papel
central na hemostasia, sendo imediatamente produzida após o AVEh para interromper
o sangramento, no entanto, ela também pode participar na lesão induzida por
hemorragia intracerebral (HU et al., 2016). Uma infusão direta no cérebro de grandes
12
doses de trombina induz infiltração de células inflamatórias, formação de cicatriz
tecidual e edema cerebral. A trombina pode ainda resultar em ativação da microglia
(KEEP; HUA; XI, 2012).
Uma reação inflamatória pronunciada ocorre após hemorragia intracerebral,
com a ativação da microglia residente, um influxo de leucócitos para o cérebro, e a
produção de mediadores inflamatórios. Os resultados de vários estudos em animais
sugerem que a inflamação tem um papel importante não só na lesão cerebral após a
hemorragia intracerebral, mas também na recuperação cerebral. A ativação da
microglia ocorre cedo após a hemorragia intracerebral, a partir de cerca de 1 h, com
picos após 3 a 7 dias, persistindo durante 3 a 4 semanas, em modelo de infusão
intracerebral de sangue autólogo em ratos (WANG, 2010; WANG; DORÉ, 2007a).
Os neutrófilos são os primeiros subtipos de leucócitos a infiltrarem-se no
cérebro hemorrágico, e estes podem danificar o tecido diretamente através da
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês reactive oxygen species),
Figura 3: Representação da fisiopatologia do AVEh. Observa-se na figura os danos cerebrais primários e secundários relacionados à hemorragia dentro do parênquima cerebral. Modificado de Mracsko e Veltkamp (2014).
13
liberando proteases pró-inflamatórias e modulando a permeabilidade da BHE. Tem
sido demonstrado que neutrófilos isolados agravam a morte de células neuronais,
induzida por excitotoxicidade ou pela privação de oxigênio e glicose. Após entrarem
no cérebro hemorrágico, os leucócitos morrem por apoptose após alguns dias. O
conteúdo dos leucócitos que morrem pode promover danos teciduais cerebrais,
estimulando microglia/macrófagos vizinhos a secretarem fatores pró-inflamatórios
tóxicos. Foi observado, em modelo pré-clínico de AVEh induzido por colagenase em
camundongos, que os neutrófilos aparecem em torno do hematoma após 4 h, com um
máximo sendo atingido em 3 dias (WANG, 2010). Wang e Doré (2007a) mostraram
que no modelo de AVEh por colagenase, a microglia se mostrou ativada entre 1 h a 2
h após injeção, tornando-se mais proeminente no dia 1, atingindo seu pico no dia 7 e
retornando ao normal no dia 21.
Estudos mostraram que a ativação de astrócitos é similar à da microglia no
modelo de AVEh, sendo maior na região próxima à lesão e diminuindo gradualmente
com a distância. Eles participam do processo inflamatório pela expressão de
metaloproteinases da matriz (MMPs, do inglês matrix metalloproteinases) após
ocorrer o AVEh, tanto no modelo de colagenase quanto no de infusão de sangue
(WANG, 2010) e são mais resistentes à lesão por danos oxidativos provocados por
ROS do que os neurônios, após indução de AVEh (WANG; DORÉ, 2007b). Diversos
estudos em modelos pré-clinicos de AVEh focaram nas MMPs 2, 3, 9 e 12,
demonstrando, por exemplo, que as MMPs 2 e 9 são ativadas dentro de 24 h após
indução do AVEh por colagenase em ratos (WANG, 2010).
O sistema complemento está envolvido nas reações imunes, incluindo lise
celular e resposta inflamatória. Os componentes de proteínas plasmáticas são
normalmente excluídos do cérebro pela BHE, mas podem entrar quando a mesma é
rompida após a hemorragia intracerebral. A ativação do complemento e a formação
do complexo de ataque à membrana (MAC, do inglês membrane attack complex)
(C5b-9) foram observadas após hemorragia intracerebral. O MAC tem seu papel na
lise dos eritrócitos e poderia, além disso, estar envolvido na liberação de hemoglobina
e de ferro, resultando em dano tecidual peri-hematoma. Além disso, o MAC pode
induzir diretamente uma lesão nos neurônios do peri-hematoma, na glia e nos vasos
sanguíneos (KEEP; HUA; XI, 2012).
14
1.7 AVALIAÇÃO DA EVOLUÇÃO DO AVEH POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA EM
MODELO ANIMAL
A RM é hoje um método de diagnóstico por imagem, estabelecido na prática
clínica e em crescente desenvolvimento. Dada à alta capacidade de diferenciar
tecidos, o espectro de aplicações se estende a todas as partes do corpo humano e
explora aspectos anatômicos e funcionais. Resumidamente, é o resultado da
interação do forte campo magnético produzido pelo equipamento com os prótons de
hidrogênio do tecido humano, criando uma condição para que se possa enviar um
pulso de radiofrequência e, após, coletar a radiofrequência modificada, através de
uma bobina ou antena receptora. Este sinal coletado é processado e convertido numa
imagem ou informação (MAZZOLA, 2009).
Após o pulso, os prótons relaxam de volta ao seu estado inicial dentro do
campo magnético do aparelho de RM. O tempo necessário para que o vetor de
magnetização longitudinal dos prótons recupere 63% do seu eixo principal é
chamada de relaxação longitudinal, sendo que as imagens obtidas nessa relaxação
são denominadas T1. Na ponderação T1, a água fica com hiposinal (escuro), a
gordura fica com hipersinal (brilhante claro), a substância branca fica clara e a
substância cinzenta fica escura. Já a relaxação transversal é o tempo necessário
para que o vetor de magnetização transversal decaia até 37% do seu eixo principal
e as imagens obtidas são denominadas T2. Na ponderação T2, a água fica com
hipersinal (brilhante claro), a gordura fica com hiposinal (escuro), a substância
branca fica escura e a substância cinzenta fica clara (TODESCATTO, 2016). Outra
sequência utilizada na RM para visualizar hemorragias é a ponderação T2*. T2* é
um tempo de relaxamento de decaimento da magnetização transversal, porém mais
curto que T2, sendo um dos principais determinantes de contraste de imagem com
sequência gradiente eco (GRE) e forma a base para muitas ressonâncias
magnéticas. Sequências ponderadas em T2* são utilizadas para representar
hemorragias, calcificações e depósitos de ferro em vários tecidos e lesões. Nesta
sequência as hemorragias e depósitos de hemosiderina apresentam sinal hipointenso
(CHAVHAN et al., 2009).
A aparência variável da hemorragia na RM depende da estrutura da
hemoglobina e de seus vários produtos de oxidação (Figura 4). Na circulação, a
15
hemoglobina alterna entre as formas oxi e desoxi-hemoglobina. À medida que o
sangue passa pelo ambiente altamente oxigenado do pulmão, o oxigênio molecular é
ligado, formando a oxi-hemoglobina. Quando o sangue então passa pelo ambiente
com menos oxigênio, o O2 é liberado, formando desoxi-hemoglobina. Para ligar
reversivelmente o oxigênio, o ferro na hemoglobina deve ser mantido no estado
ferroso reduzido (Fe2+). Quando os eritrócitos são removidos desse ambiente
oxigenado da circulação, a desoxi-hemoglobina sofre uma desnaturação para meta-
hemoglobina e o ferro heme passa para a forma Fe3+. Com a contínua desnaturação
oxidativa, a meta-hemoglobina é convertida em derivados hemicromos. Quando os
eritrócitos são lisados, a hemoglobina é quebrada em globina e ferro heme e esse
ferro é estocado na forma de ferritina (forma solúvel). Com a sobrecarga desse ferro,
forma-se a hemosiderina, que representa aglomerados insolúveis de partículas de
ferritina. A aparência do hematoma na RM depende se há elétrons desemparelhados,
isto é, se há a presença de espécie paramagnética, que é o caso da desoxi-
hemoglobina e da meta-hemoglobina, enquanto a oxi-hemoglobina e o hemicromo
são espécies diamagnéticas, isto é, não possuem elétrons desemparelhados
(BRADLEY, 1993).
Cinco estágios envolvem um hematoma nas imagens adquiridas de RM nas
sequências ponderadas de T1 e T2, conforme mostrado no quadro 1.
16
Estágio Tempo Compartimento
Estado da
Hemoglobina
Intensidade comparada no
cérebro
Imagem em
T1
Imagem em
T2
Hiperagudo <24 h Intracelular Oxi-
hemoglobina
Isointenso Levemente
hiperintenso
Agudo 1–3
dias
Intracelular Desoxi-
hemoglobina
Levemente
hipointenso
Muito
hipointenso
Subagudo
Inicial
Final
>3 dias
>7 dias
Intracelular
Extracelular
Meta-
hemoglobina
Meta-
hemoglobina
Muito
hiperintenso
Muito
hiperintenso
Muito
hipointenso
Muito
hiperintenso
Crônico
Centro
Aro
>14
dias
Extracelular
Intracelular
Hemicromo
Hemosiderina
Isointenso
Levemente
hipointenso
Levemente
híperintenso
Muito
hipointenso
Quadro 1: Quadro da evolução do hematoma como observado na ressonância magnética. Adaptado de
BRADLEY, 1993.
Durante as primeiras horas (fase hiperaguda) o hematoma consiste de uma
mistura de oxi e desoxi-hemoglobina dentro dos eritrócitos, inicialmente como um
líquido em suspensão de eritrócitos intactos. Nos dias seguintes (fase aguda) o
hematoma consiste principalmente de desoxi-hemoglobina dentro dos eritrócitos
intactos. Durante o período subagudo, que se inicia após 3 dias, a hemoglobina sofre
desnaturação oxidativa, formando a meta-hemoglobina. No estágio inicial do período
subagudo, os eritrócitos ainda estão intactos, porém no estágio final deste período (1
semana), já ocorreu a lise dessas células. Na segunda semana a microglia remove o
ferro da meta-hemoglobina extracelular, marcando o início da fase crônica, quando o
ferro heme é depositado na periferia, como um aro de hemosiderina e ferritina
(BRADLEY, 1993).
17
Del Bigio et al. (1996) compararam imagens de RM em ponderação T2 com
cortes histológicos do cérebro de ratos submetidos a hemorragia pelo método de
injeção da colagenase. Passados 30 min após a injeção de colagenase observaram
que os eritrócitos se agregavam em múltiplos locais na periferia dos feixes da
substância branca no corpo estriado, e em menor grau, ao longo do local onde foi
inserida a agulha. Após 1 h, o acúmulo de sangue ainda era descontínuo, embora o
hematoma já assumise um formato ovóide, com sangue restrito às margens dos
feixes da substância branca. No tecido cerebral, o sangue provavelmente seguiu um
caminho de menor resistência ao longo dos vasos sanguíneos ou ao longo dos
axônios. Na RM, o centro do hematoma mostrava-se hipointenso com focos dispersos
de iso e hiperintensidade e um aro hiperintenso. Após 2 h, o acúmulo de sangue era
quase contínuo, ignorando os limites microanatômicos e ocupando quase dois terços
da área do estriado. Após 12 h, havia tecido cerebral desintegrado no local do
hematoma, contendo neurônios eosinofílicos e núcleos fragmentados. Ao redor da
periferia do hematoma, estavam dispersos neutrófilos e células gliais inchadas. Após
24 h, os neutrófilos se concentraram em uma banda compacta, correspondendo a um
aro hipointenso visível na RM. O pico do edema também ocorreu com 24 h, mas se
resolveu totalmente em uma semana. A invasão do hematoma por monócitos, que se
diferenciaram subsequentemente em macrófagos, teve início em torno de 48 h.
Depois de passada uma semana, o hematoma estava resolvido e havia um aumento
dos ventrículos laterais, principalmente o do hemisfério ipsilateral à lesão, com o
centro do hematoma apresentando debris celulares. Na RM, observou-se o centro do
hematoma hiperintenso, com algumas bandas iso/hipointensas, correspondendo a
neutrófilos em degeneração. À medida que os macrófagos se deslocaram para o
hematoma, os compostos de ferro fagocitados foram degradados e o ferro foi
sequestrado na forma de hemosiderina e ferritina, aparecendo nas imagens de RM de
forma hipointensa.
Com 2 semanas, o local do hematoma consistia em uma pequena cavidade
preenchida por fluído e alguns macrófagos, sem haver neutrófilos evidentes, não
ocorrendo mudanças significativas para a terceira semana. O tecido circundante
continha muitos astrócitos reativos. Nas imagens de RM observaram-se um aro
periférico hipointenso e um centro iso/hiperintenso, correspondendo ao espaço
preenchido com fluído e alguns poucos vasos. A região estriatal apresentava uma
18
hiperintensidade irregular. O estudo concluiu que as imagens de RM se
correlacionaram bem com as mudanças histológicas no modelo experimental de
AVEh utilizado, e que dessa forma poderiam ser utilizadas para acompanhar in vivo
mudanças ocasionadas por tratamentos. (DEL BIGIO, 1996).
Oxi-hemoglobina
Desoxi-hemoglobina
Meta-hemoglobina
Hemicromo reversível
Ferritina / Hemosiderina
Figura 4: Representação da aparência da hemorragia na ressonância magnética e a estrutura da hemoglobina e seus produtos de oxidação. Nesta imagem podemos observar a aparência da hemorragia nas diversas fases de um AVEh em rato, em uma ponderação T2, correlacionado com os diferentes estruturas químicas da hemoglobina e seus produtos de oxidação. Modificado de Del Bigio et al. (1996)
19
1.8 TERAPIA CELULAR
1.8.1 Células-tronco
As células-tronco são células indiferenciadas que podem ser definidas por
duas características: (1) o potencial de autorenovação, por várias divisões celulares, o
que é um pré-requisito para a manutenção de um pool de células-tronco, (2)
capacidade de gerar células descendentes diferenciadas, em geral de múltiplas
linhagens (LOS; SKUBIS; GHAVAMI, 2019). Elas podem ser classificadas por seu
potencial regenerativo. A célula-tronco totipotente tem o potencial de se transformar
em um embrião completo (ou seja, para formar qualquer tipo de célula), inclusive em
tecidos extra-embrionários: membranas embrionárias, cordão umbilical e placenta.
Aparece com a fertilização do óvulo e desaparece quando o embrião atinge o estágio
de 16 a 32 células. Com divisões subsequentes, as células-tronco embrionárias
perdem a capacidade de gerar tecidos extra-embrionários. No entanto, elas são
capazes de se diferenciarem em células presentes nas três camadas germinativas
(ectoderme, mesoderme e endoderme), sendo chamadas pluripotentes (BRIGNIER;
GEWIRTZ, 2010).
As células-tronco pluripotentes podem ser as embrionárias (ESCs, do inglês
embryonic stem cells), obtidas a partir da massa interna dos blastocistos, possuindo a
capacidade de autorenovação, permitindo a manutenção indefinida do estado
indiferenciado in vitro (BRIGNIER; GEWIRTZ, 2010). Apesar de achados promissores,
o uso clínico disseminado de ESCs é atualmente elusivo, devido ao potencial de
imunogenicidade e tumorigenicidade. Além disso, controvérsias éticas e restrições
legais cercam o uso de ESCs (DUSCHER; WONG; MAAN, 2015). Mais recentemente
foi descrita por Takahashi e Yamanaka (2006) a possibilidade de geração de células-
tronco pluripotentes induzidas (iPSCs, do inglês induced pluripotent stem cells), em
que uma reprogramação nuclear leva a mudanças na expressão gênica que permite
que células adultas sejam reprogramadas e se tornem células-tronco pluripotentes
(BRIGNIER; GEWIRTZ, 2010). O uso de iPSCs permite a geração de populações de
células-tronco pluripotentes autólogas derivadas de tecidos adultos diferenciados,
20
evitando assim as questões éticas associadas às ESCs humanas (DUSCHER;
WONG; MAAN, 2015).
Com divisões seguintes, as células-tronco se tornam cada vez mais limitadas
na sua capacidade de se diferenciar em várias linhagens. Elas são então chamadas
de multipotentes; isto é, são capazes de gerar um número limitado de tipos celulares,
dentro de um mesmo folheto embrionário. Esta é a propriedade de células-tronco
adultas, também denominadas células-tronco somáticas ou células-tronco não
embrionárias, que são capazes de se auto-renovar durante o tempo de vida do
organismo e de gerar células filhas diferenciadas (BRIGNIER; GEWIRTZ, 2010). As
células-tronco adultas são frequentemente isoladas de medula óssea, sangue, tecido
adiposo, fígado e pele. No entanto, como consequência natural do envelhecimento, a
sua quantidade e qualidade diminui com a idade. O envelhecimento das células-
tronco afeta o seu potencial regenerativo, crescimento e divisões celulares (LOS et
al., 2019). O exemplo mais conhecido de célula-tronco adulta é a célula-tronco
hematopoiética, que está localizada no nicho da medula óssea em adultos, podendo
ser colhida a partir da medula óssea e do sangue do cordão umbilical (BRIGNIER;
GEWIRTZ, 2010).
Outro tipo de células adultas multipotentes são as células-tronco
mesenquimais (MSCs, do inglês mesenchymal stromal cells). O termo ―MSCs‖ é
usado para descrever uma população heterogênea de células estromais, que são
frequentemente caracterizadas usando critérios propostos pela Sociedade
Internacional de Terapia Celular (ISCT, do inglês International Society of Cell
Therapy) como células aderentes ao plástico, expressando um conjunto distinto de
antígenos de superfície e com a capacidade de se diferenciar in vitro em linhagens
osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas (DOMINICI et al., 2006; WILSON et al.,
2019). A população de MSCs é definida como > 95% positiva para CD105, CD73 e
CD90 e 95% negativa para CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79 ou CD19 e HLA-DR
(MESENTIER-LOURO et al., 2016). Nos humanos, essas células podem ser isoladas
de fontes como medula óssea, tecido adiposo, membrana sinovial, polpa dentária,
derme, osso trabecular, periósteo, cordão umbilical, placenta, fígado fetal e líquido
amniótico (SHIRJANG et al., 2017). Vários estudos descrevem as MSCs como células
imunoprivilegiadas ou hipoimunogênicas. Elas expressam baixos níveis de MHC
classe I e moléculas coestimulatórias CD40, CD80 e CD86 (TSE et al., 2003), assim
21
como não expressam ou expressam em níveis desprezíveis as moléculas de MHC
classe II (BLANC, 2003).
O uso das MSCs para fins clínicos tira proveito da sua fraca imunogenicidade
observada em estudos in vitro, em estudos pré-clínicos e estudos em humanos, os
quais suportam o seu uso alogênico. Em condições clínicas mais agudas para as
quais o uso da terapia com MSCs tem sido considerada, as MSCs alogênicas podem
ser a única opção, já que haveria uma limitação de tempo para a proliferação e
expansão in vitro de células autólogas (UCCELLI; MORETTA; PISTOIA, 2008).
Como mencionado, o cordão umbilical humano é uma das fontes de MSCs,
tendo comprimento médio de 50 a 60 cm, diâmetro médio de 14,42 ± 1,50 mm e peso
aproximado de cerca de 40 g. Contém duas artérias umbilicais e uma veia umbilical
embebidas em uma gelatina rica de proteoglicanos chamada de geleia de Wharton e
rodeada por uma única camada de âmnio. Um grande estoque de MSCs pode ser
encontrado em várias regiões do cordão umbilical humano (WATSON et al., 2015),
sendo ele dividido em vários compartimentos, tais como a membrana epitelial
amniótica, a região subaminiótica, a geleia de Wharton e a região perivascular em
torno dos vasos sanguíneos umbilicais, sendo que as MSCs vêm sendo isoladas de
cada um desses compartimentos (SUBRAMANIAN et al., 2015). As MSCs derivadas
de cordão umbilical tem grande capacidade de expansão e a sua extração é
considerada não invasiva, já que o cordão umbilical é frequentemente considerado
um refugo e descartado (TAGHIZADEH; CETRULO; CETRULO, 2011; WATSON et
al., 2015), manifestando poucas preocupações éticas (PALADINO et al., 2019). Além
disso, apresentam, em comparação com MSCs de tecidos adultos, um maior
comprimento de telômero, que as protege de perda prematura de viabilidade
(KALASZCZYNSKA; FERDYN, 2015).
Entre as células do cordão umbilical, as MSCs da geleia de Wharton
oferecem a melhor utilidade clínica, pois elas apresentam menor contaminação com
outros tipos celulares e podem ser geradas em grande número com pouca
manipulação, enquanto as células de outros compartimentos do cordão requerem
maior número de passagens para gerar um número adequado de células para
aplicação. Além disso, seu isolamento é simples, rápido e fácil de padronizar, são
proliferativas e têm alto potencial de diferenciação (SUBRAMANIAN et al., 2015).
22
Estas vantagens logísticas fazem a geleia de Wharton uma atraente fonte de
células-tronco para terapia celular. As hWJ-MSCs (do inglês human Wharton’s jelly
derivaded MSCs) têm sido propostas como agente terapêutico em uma ampla gama
de doenças com base em estudos em modelos animais. Nestes estudos, foi
demonstrado que elas são capazes de induzir a reparação neuronal, apresentam
propriedades imunomoduladoras, são multipotentes, e secretam vários fatores tróficos
importantes para a neuroregeneração (OPPLIGER et al., 2016).
A respeito das propriedades imunomoduladoras, tornou-se cada vez mais
claro que, em resposta a um meio inflamatório, as MSCs preparam o microambiente
para a reparação tecidual, produzindo moléculas imunorreguladoras que modulam a
progressão da inflamação, liberando fatores de crescimento para produzir matriz
extracelular, estimulando as células progenitoras in situ a se diferenciar e repor as
células perdidas e promovendo a angiogênese (PALADINO et al., 2019). Os
receptores na superfície das MSCs são ativados por estímulos externos, e levam à
produção de vários fatores imunomoduladores (CASTRO et al., 2019). Entre esses
receptores, estão os do tipo toll (TLR, do inglês toll-like receptor), que podem ser
ativados, quando expostos a ligantes, em locais de lesão ou inflamação (SHIRJANG
et al., 2017). Como consequência, as MSCs podem inibir a ativação e a apresentação
de antígenos por células dendríticas; suprimir a ativação de células natural killer;
suprimir a resposta de macrófagos e polarizar os macrófagos em fenótipo M2;
suprimir a proliferação, a secreção de citocinas e a citotoxicidade de linfócitos T;
induzir a expansão de células T reguladoras; e diminuir a viabilidade dos linfócitos B,
afetando a secreção de anticorpos e a expressão pelos linfócitos B de moléculas
coestimulatórias (CASTRO et al., 2019).
Vários estudos sugerem que a interação entre as MSCs e o microambiente
causa a secreção de fatores solúveis por essas células. As MSCs podem responder
ao estímulo de citocinas pró-inflamatórias, tais como fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e interferon gama (IFN-γ), e secretar mediadores imunossupressores,
incluindo prostaglandina E2 (PGE2), indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), fator de
transformação do crescimento beta-1 (TGF-1) e interleucina 10 (IL-10)
(MESENTIER-LOURO et al., 2016).
23
1.9 TERAPIA CELULAR COM MSCS EM DOENÇAS NEUROLÓGICAS
Os estudos pré-clínicos indicam que além da habilidade de diferenciação em
células da linhagem mesodérmica, as MSCs secretam importantes fatores de
crescimento, citocinas e elementos de matriz extracelular que podem aumentar a
sobrevivência celular em tecidos lesionados. Estes efeitos favoráveis das MSCs foram
experimentalmente testados em vários modelos animais das principais doenças
neurológicas, incluindo AVE, doença de Huntington, doença de Parkinson, esclerose
lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e esclerose múltipla (DRELA et al., 2013). A
partir de vários estudos, ficou claro que a substituição celular não é o método de ação
mais comum das MSCs. Ao invés disso, as MSCs fornecem suporte trófico para as
células sobreviventes e modulam a natureza inflamatória do meio-ambiente, tornando-
o mais propício para as células sobreviventes (SANBERG et al., 2012). A partir de
dados pré-clínicos que já foram reunidos, parece que na grande maioria das situações
clínicas testadas, a liberação de fatores tróficos e substâncias bioativas pelas MSCs
suprimiram eficazmente a neuroinflamação, diminuíram as lesões e atenuaram os
déficits funcionais neurológicos (DRELA et al., 2013).
Estudos prévios do nosso grupo demonstraram em modelo de AVE isquêmico
uma recuperação da função motora, observada no teste de cilindro, em animais
tratados com 3 x 106 MSCs de medula óssea de ratos (BM-MSCs), um dia após
isquemia (VASCONCELOS-DOS-SANTOS et al., 2010). Em modelo de doença de
Alzheimer, BM-MSCs de ratos protegeram neurônios em cultura do estresse oxidativo
induzido por oligômeros Aβ, ocorrendo um aumento de interleucina-6 (IL-6), IL-10 e
de fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) (GODOY et al., 2018). Outro
exemplo é o estudo de Mesentier-Louro et al. (2014), em que foi investigado o
potencial terapêutico de 5 x 105 BM-MSCs de ratos injetadas dentro do corpo vítreo
em um modelo de lesão de nervo ótico, mostrando que a terapia celular protegeu e
ajudou na regeneração axonal das células ganglionares da retina (RGCs) após 16 e
28 dias da lesão do nervo. Mostraram também um aumento da expressão dos fatores
tróficos fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF-2, do inglês fibroblast growth fator
2) e interleucina 1β (IL-1β) na camada das RGCs, sugerindo uma modulação da
neuroinflamação. Em outro trabalho, Mesentier-Louro et al. (2019) mostraram que as
BM-MSCs puderam promover neuroproteção das RGCs por um período mais longo,
24
pois possibilitaram que o dobro de células sobrevivessem pelo período de 60 dias,
além de promover a regeneração dos axônios em até 0,5 mm. Já em trabalho do
nosso grupo utilizando hWJ-MSCs, também em modelo de lesão do nervo ótico,
Jordão da Silva-Junior (2018) observou que as hWJ-MSCs possibilitaram uma
sobrevivência maior das RGCs nos períodos de 14 (38%), 60 (20%) e 120 dias (10%)
quando comparado ao grupo veículo, que foi respectivamente de 20%, 10% e 5%,
além de uma significativa diferença na extensão axonal em 120 dias de tratamento.
Também demonstrou que as hWJ-MSCs aumentavam a transcrição de TNF-α e IL-6,
nos períodos iniciais à lesão e posteriormente havia uma mudança no perfil da
transcrição, com redução nos níveis de TNF-α e aumento de IL-10.
1.9.1 Terapia celular com MSCs no AVEh
Assim como em outras doenças neurológicas, a terapia celular também tem
sido usada em diversos modelos pré-clínicos de AVEh, como também em estudos
clínicos, que serão citados à frente. Em relação à origem das MSCs utilizadas nos
modelos pré-clínicos, aproximadamente 60% foram de medula óssea, 30% de fontes
como cordão umbilical, placenta e membrana amniótica e 10% de tecido adiposo,
segundo levantamento realizado por Turnbull et al. (2019). Um pouco menos de
metade desses estudos utilizou injeção intracerebral estereotáxica, seguida da
administração por via intravenosa, administração intra-arterial e por último por
administração intranasal.
Em relação aos modelos pré-clínicos de AVEh utilizados nos estudos de
terapia com MSCs, a revisão de Rosado-de-Castro et al. (2016) mostrou que entre 18
estudos pré-clínicos de terapia celular utilizando MSCs de medula óssea e 1 de
células mononucleares da medula óssea (CMMO) (fração que contém as células-
tronco hematopoiéticas), o modelo de indução por colagenase foi utilizado em 11
estudos, o de injeção de sangue autólogo em 6, e o modelo de hemorragia
subaracnóide foi empregado em 2, sendo que a maioria dos trabalhos foram
conduzidos em ratos (Figura 5). Esse levantamento também mostrou que 14
trabalhos utilizaram MSCs de ratos, enquanto 4 fizeram uso de MSCs de humanos.
25
Quanto à janela temporal da terapia com MSCs para o AVEh, diferentes
estudos tiveram resultados controversos. Por um lado, a maioria dos estudos
realizados preconizou um tratamento precoce. A administração precoce de MSCs,
especialmente na primeira semana, pode reduzir efetivamente a lesão secundária
após o AVEh, incluindo inflamação e apoptose, o que contribui para haver a
recuperação funcional, pois a lesão secundária ocorre mais frequentemente ainda na
primeira semana. Por outro lado, alguns estudos sugerem que a administração mais
tardia poderia ser benéfica no caso do AVEh, pois a lesão secundária pode ser tão
grave na primeira semana, que poderia trazer danos às células transplantadas e até
mesmo levar à morte delas, sendo que após o estágio agudo do AVEh, as MSCs
poderiam substituir os tecidos danificados e refazer a função neuronal (GAO et al.,
2018).
Figura 5: Representação gráfica dos modelos animais (A), espécies (B) e sexo dos animais utilizados (C) em estudos pré-clínicos que avaliaram o potencial de células derivadas de medula óssea para tratamento do AVEh. Modificado de Rosado-de-Castro et al. (2016).
26
Nas revisões realizadas por Rosado-de castro et al. (2016) e Turnbull et al.
(2018) a maior parte dos estudos, aproximadamente 40%, realizou a administração
das MSCs após 24 h do início da lesão, seguindo a premissa que as células podem
ajudar a modular os eventos precoces da fisiopatologia do AVEh. Interessante
observar que alguns trabalhos utilizaram tempos menores ainda, administrando as
células imediatamente após iniciar a lesão,1 h, 2 h e 6 h, já que a possibilidade de
reduzir a expansão do hematoma na fase hiperaguda poderia melhorar o prognóstico
da doença. Um desses estudos foi o de Huang et al. (2019), que demonstraram
menor volume de lesão, menor resposta inflamatória e melhor recuperação funcional
em animais submetidos à hemorragia intracerebral pelo modelo da injeção de sangue
autólogo e que receberam BM-MSCs por via intraventricular 30 minutos após lesão.
Outra pesquisa que também realizou o transplante de células na fase
hiperaguda foi o de Chen et al. (2015), que demonstraram em estudo utilizando
administração intravenosa de BM-MSCs, realizada 2 horas após provocar a lesão
hemorrágica, uma diminuição no volume de água do cérebro (menor edema) e uma
menor disfunção da BHE no grupo tratado. Além disso, verificaram a redução de
células da microglia/macrófagos e de neutrófilos no cérebro, bem como a diminuição
da expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ).
Cui et al. (2017) mostraram em estudo que utilizou o modelo de injeção de
sangue autólogo, que o transplante intravenoso de BM-MSCs e de meio condicionado
de BM-MSCs imediatamente após induzir o AVEh, reduziu o edema cerebral no
período de 6 dias e mostrou recuperação funcional nos animais no 3° dia, através da
escala de déficit neurológico e do teste de forelimb placing. O meio condicionado de
BM-MSCs também reduziu os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α na região do
perihematoma, mas manteve os níveis de IL-10 próximos ao dos animais sham. O
meio condicionado também aumentou os níveis de expressão de mRNA da proteína
43 associada ao crecimento (GAP-43), que é associada a extensão dos neuritos.
Em resumo, vários estudos que investigaram o transplante de diferentes tipos
de células-tronco em modelos animais de AVEh indicam uma melhora funcional ou
uma atenuação do hematoma. As MSCs e as células-tronco neurais (NSCs, do inglês
neural stem cell) são as mais usadas e promissoras nestes estudos. Entretanto, a
dose administrada, a rota, o intervalo de tempo, a origem das células, o tipo celular, a
27
manipulação e o índice de qualidade de cada estudo são tão divergentes, que é difícil
avaliar os efeitos terapêuticos de forma integral, continuando desconhecido qual seria
o padrão ótimo de terapia celular para o AVEh (HU et al., 2015).
Xie et al. (2016) demonstraram que o tratamento com MSCs de cordão
umbilical, por via intracerebral ou via intravenosa, forneceu um efeito neuroprotetivo
14 dias após a cirurgia, ao reduzir o volume de hematoma, ao promover a
angiogênese e a resultar em melhora do déficit neurológico.
Ma et al. (2015) mostraram em um trabalho de revisão e meta-análise de
terapia celular com células-tronco em modelo animal de AVEh, que entre 30 estudos,
todos foram realizados com um aparato esterotáxico, com localização do AVEh na
região dos núcleos da base, sendo que alguns especificaram a localização exata,
como núcleo caudado, estriado e globo pálido. Quinze pesquisas utilizaram o modelo
de injeção de sangue autólogo, oito de injeção de colagenase tipo VII e sete de
injeção do tipo IV. Esses estudos incluíam cinco diferentes tipos de células-tronco,
utilizando tanto roedores, quanto macacos. Em outro estudo de revisão realizado por
Cordeiro et al. (2015), de terapia celular em modelos de AVEh conduzidos apenas em
ratos, foram levantadas 26 metodologias diferentes utilizadas, em que o número de
células administradas variaram de 2 x 105 a 16 x 106 e o volume administrado variou
de 10 µL a 2000 µL, sem que necessariamente o volume fosse proporcional ao
número de células em suspensão. A injeção de quantidades maiores de células, como
1 x 106 células-tronco derivadas da medula óssea, foram mais efetivas
terapeuticamente do que 5 x 105 células. Em estudo utilizando 4, 8, ou 16 milhões de
células mononucleares de sangue de cordão umbilical, o volume da lesão após 14
dias foi inverso às doses administradas de células (SEGHATOLESLAM et al., 2013).
Dos 26 estudos, a maioria (nove) teve a administração de células realizada por
injeção intraparenquimal, além das seguintes outras vias utilizadas em menor número:
intra-arterial (artéria carótida), intravenosa (veias cervical, femoral, safena, da cauda)
e intraventricular (CORDEIRO; HORN, 2015).
Diferente dos estudos pré-clínicos, os estudo clínicos de tratamento de AVEh
com MSCs são ainda bastante limitados. No presente momento, consulta nos ensaios
clínicos registrados na base de dados do National Institute of Health (clinicaltrials.gov,
acesso em 25/07/2019) sobre AVEh e terapia celular com MSCs, mostrou haver
28
apenas um estudo em andamento, em etapa de recrutamento, para avaliar efeitos
adversos de diferentes doses de MSCs proveniente de medula óssea de fonte
alogênica. Entre os estudos já publicados, Chang et al. (2016) acompanhou 24
pacientes divididos em três grupos: grupo controle em que os pacientes passaram por
cirurgia para remoção do hematoma, grupo que passou pela cirurgia de remoção do
hematoma e recebeu BM-MSCs autólogas e um terceiro grupo que passou pela
cirurgia e recebeu MSCs de cordão umbilical (UC-MSCs), sendo as células
administradas na cavidade do hematoma. Os três grupos tiveram os hematomas
reabsorvidos após 3,5 meses, mas os grupos que receberam BM-MSCs e UC-MSCs
tiveram melhor resultado funcional após 5 anos. As UC-MSCs alogênicas e as BM-
MSCs autólogas foram bem toleradas, não havendo rejeição imunológica pelos
pacientes.
Outro estudo clínico que mostrou segurança e eficácia foi o de fase I/II
realizado por Tsang et al. (2017), em que injetaram por via intravenosa MSCs
autólogas de medula óssea, divididas em duas doses, cada uma em média de 4,57 x
107 células por infusão. Nesse estudo também foi observada segurança e uma
melhora nos resultados neurológicos após um ano de realizado o transplante.
Os poucos estudos clínicos realizados até agora demonstram que a terapia
celular é possível e segura, necessitando porém, mais estudos pré-clínicos e clínicos
para definir a sua eficácia em AVEh.
1.10 BIODISTRIBUIÇÃO DE CÉLULAS TRONCO APÓS TRANSPLANTE
INTRAVENOSO
Trabalho anterior do nosso grupo de pesquisa já havia demonstrado que as
CMMO marcadas com 99mTc e injetadas por via intravenosa ou intra-arterial em
animais com AVE isquêmico distribuíam-se após 2 h preferencialmente para pulmões,
seguido de rins e baço, quando observada a porcentagem de captação por grama de
tecido. Em 24 h, a maior porcentagem de captação por grama de tecido foi nos rins,
seguido pelo baço e fígado e pulmões. Uma pequena captação foi observada nos
hemisférios cerebrais, principalmente no hemisfério ipsilateral à lesão
(VASCONCELOS-DOS-SANTOS et al., 2012). Já em trabalho similar realizado,
porém, com pacientes com AVE isquêmico, a quantificação da captação feita nas
imagens de SPECT (do inglês Single Photon Emission Computed Tomography),
29
mostrou que a via intravenosa apresentou após 2 h maior captação pelo pulmão,
seguida por fígado, rins e baço. Após 24 h, a maior captação observada foi no fígado,
seguida por pulmão, rins e baço (ROSADO-DE-CASTRO et al., 2013).
Quanto às MSCs, um grande número de estudos em animais e também em
humanos vêm explorando o seu uso terapêutico por administração intravenosa, como
mencionado no item 1.9. Na maioria dos estudos a origem das MSCs não se mostra
decisiva para influenciar a sua biodistribuição, sendo que células de várias fontes de
tecidos já foram pesquisadas. As metodologias de marcação utilizadas incluem a
marcação radioativa das MSCs, marcação com corantes vitais fluorescentes, agentes
de contraste, transdução com genes repórteres ou o uso de marcadores de DNA
específicos. As metodologias de marcação foram, na maior parte, projetadas para
detectar apenas o homing de curto prazo das MSCs, não permitindo determinar se as
células detectadas se mantêm vivas (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016).
Os principais resultados comuns dos estudos de biodistribuição já realizados
mostraram que: as MSCs se distribuem para uma variedade de tecidos após injeção
intravenosa. Os sinais das células injetadas foram encontrados logo após
administração das mesmas em freqüências mais altas nos pulmões, seguidos pelo
fígado e baço, e em freqüências baixas ou muito baixas nos demais tecidos. Após os
primeiros estudos sobre homing e migração de MSCs, questões adicionais foram
abordadas sobre a sua biodistribuição, incluindo a quantificação de MSCs, seu
direcionamento preferencial para vários locais-alvo e a influência do tamanho das
MSCs na sua biodistribuição (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016).
Após a expansão em cultura, as MSCs são relativamente grandes, com
tamanho médio estimado em torno de 30 µm em suspensão (variando de 16 a 53
µm). Seu tamanho também pode variar dependendo da osmolaridade do meio de
cultura, número de passagem e/ou densidade celular durante a semeadura, bem
como das condições de cultura (bidimensional versus tridimensional). Portanto,
eventos obstrutivos durante a passagem pulmonar são esperados após a
administração intravenosa de MSCs (LEIBACHER; HENSCHLER, 2016). Na infusão
intravenosa, mais de 80% das MSCs são aprisionadas nos pulmões e menos de 1%
são detectadas no coração isquêmico, em modelo de infarto do miocárdio, ou no
cérebro (WANG et al., 2015). Outro fator que impacta no aprisionamento das células
30
nos pulmões foi demonstrado por Wang et al. (2015) que observaram que os níveis
de integrinas aumentavam acentuadamente após a expansão de MSCs em culturas
em monocamadas e que isso contribuiria para o aprisionamento das células nos
pulmões, já que possibilitariam a ligação à fibronectina e à vitronectina presentes nas
células endoteliais deste órgão. Quando utilizavam anticorpos para bloquearem as
integrinas, notaram uma redução das MSCs aprisionadas nos pulmões.
31
2. JUSTIFICATIVA
O AVEh apresenta uma elevada taxa de letalidade, com 40% de mortalidade
no primeiro mês, assim como mais anos de vida perdidos ajustados por incapacidade,
quando comparado ao AVE isquêmico. As intervenções médicas ou cirúrgicas
existentes até o momento são apenas terapias sintomáticas e/ou de suporte. Ou seja,
apesar da alta morbidade e mortalidade, não há intervenções específicas que tenham
demonstrado melhorar o desfecho clínico após AVEh.
Em vista disso, a terapia celular apresenta uma perspectiva promissora como
tratamento, sendo que as hWJ-MSCs conferem diversas vantagens, como fácil
disponibilidade, grande capacidade de expansão e efeitos imunomodulatórios já
observados em diversos estudos pré-clínicos, além da segurança clínica já
demonstrada em estudos em seres humanos. Além disso, existem poucos trabalhos
na literatura descrevendo o uso de MSCs derivadas de cordão umbilical para terapia
em modelo de AVEh, sendo que a maioria utilizou a via de administração
intracerebral. Encontrou-se apenas um trabalho que utilizou a via de administração
intravenosa (XIE et al., 2016), que apresenta mais segurança e facilidade de
aplicação, quando comparada à via intracerebral.
Dessa forma, decidiu-se avaliar pela primeira vez a eficácia do tratamento com
as hWJ-MSCs, comparando dois modelo pré-clínico de AVEh, um de grau moderado
e outro de grau severo, através da análise do volume da lesão em imagens adquiridas
por RM, pois na prática clínica o volume da lesão hemorrágica é um dos fatores que
afeta o prognóstico do paciente e uma redução do mesmo pode melhorar os
resultados funcionais pós AVEh. Ao mesmo tempo, também se escolheu avaliar duas
janelas terapêuticas diferentes, hiperaguda (1 h) e aguda (24 h), para verificar se
nesses tempos, a administração das hWJ-MSCs poderia modular os eventos
precoces da fisiopatologia do AVEh e reduzir o tamanho da lesão. Este trabalho
também avalia pela primeira vez a biodistribuição das hWJ-MSCs em modelo de
AVEh.
32
3. HIPÓTESE
A terapia celular com hWJ-MSCs por via intravenosa pode promover a redução
de prejuízos funcionais e de volume de lesão nos animais com AVEh moderado e
severo.
33
4. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial terapêutico da administração aguda
ou hiperaguda de hWJ-MSCs, bem como sua biodistribuição em modelo de AVEh em
dois níveis de severidade em ratos, quando administradas pela via intravenosa.
Os objetivos específicos são:
• Avaliar se há uma melhora funcional e uma redução no volume de lesão dos
animais tratados com hWJ-MSCs 24 h após início da hemorragia, em relação
aos animais do grupo veículo, em um modelo de AVEh moderado;
• Avaliar se há uma melhora funcional e uma redução no volume de lesão dos
animais tratados com hWJ-MSCs 24 horas após início da hemorragia, em
relação aos animais do grupo veículo, em um modelo de AVEh severo;
• Avaliar se há uma melhora funcional e uma redução no volume de lesão dos
animais tratados com hWJ-MSCs 1 hora após início da hemorragia, em relação
aos animais do grupo veículo, em um modelo de AVEh severo;
• Rastrear a migração das hWJ-MSCs nos modelos de AVEh moderado e
severo, injetadas 24 h após início da lesão, comparando com os grupos sham
e naive, avaliando para quais órgãos as células são distribuídas e em qual
percentual;
34
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos jovens, com aproximadamente 2 meses
de vida (média de 55 ± 7,4 dias de idade), pesando entre 240 e 345 g. A utilização
destes animais foi aprovada em 17/12/2014 através do número de referência 111/14,
pela Comissão de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica do Centro
de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sendo que toda a
parte experimental com os animais foi realizada dentro do período de validade do
protocolo aprovado. Os animais foram mantidos em caixas de dimensões de 34 x 40,5
x 17,5 cm (L x C x A), com até quatro animais por caixa em uma sala com ciclo
dia/noite de 12h/12h, com temperatura controlada e comida água ad libitum.
5.2 DESENHO EXPERIMENTAL PARA TESTE FUNCIONAL E RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA
Grupo sham: 10 animais foram designados randomicamente para o grupo sham, no
qual receberam injeção na região estriatal de solução salina (NaCl 0,9% p/v). 24 h
depois receberam 500 µL de veículo (salina tamponada com fosfato 10 mM pH 7,4
(PBS) /DNAse) pela veia da cauda. Nenhum animal morreu nos 22 dias que se
seguiram.
Grupo AVEh moderado: 24 animais receberam injeção na região estriatal de 0,1U de
colagenase. 4 animais morreram nas primeiras 24 h, restando 20 animais que foram
designados randomicamente para receber as hWJ-MSCs (10 animais) ou veículo (10
animais). Nenhuma outra morte foi registrada no período até completar 22 dias. 1
animal do grupo veículo e 2 do grupo célula não participaram do teste do Rotarod,
devido a problemas no equipamento. 2 animais do grupo MSCs foram excluídos dos
resultados do teste do cilindro, por não terem conseguido realizar o teste em todos os
tempos avaliados. 1 animal do grupo veículo foi excluído posteriormente devido à
ausência de lesão visível na imagem de RM.
35
Grupo AVEh severo 24 h: 47 ratos receberam injeção na região estriatal de 0,25 U de
colagenase. 19 animais morreram nas primeiras 24 h, restando 28 animais que foram
designados randomicamente para receber as hWJ-MSCs (14 animais) ou veículo (14
animais). 01 animal morreu 24 h após receber o veículo e nenhuma outra morte foi
registrada no período até completar 22 dias. 3 animais do grupo veículo foram
excluídos dos resultados do teste do cilindro, por não terem conseguido realizar o
teste em todos os tempos avaliados. 1 animal do grupo veículo foi excluído
posteriormente devido à localização anômala da lesão na imagem de RM.
Grupo AVEh severo 1 h: 30 ratos receberam injeção na região estriatal de 0,25 U de
colagenase. 3 animais morreram nas primeiras 24 h, restando 27 animais que foram
designados randomicamente para receber as hWJ-MSCs (14 animais) ou veículo (13
animais). 1 animal morreu 10 dias após receber veículo. 1 animal do grupo veículo foi
excluído posteriormente da análise por neuroimagem devido à presença de um
artefato na imagem de RM, que atrapalhou a quantificação do volume de lesão.
5.3 CIRURGIA
Neste trabalho foi utilizado o modelo de AVCh desenvolvido por Rosenberg et al.
(1990), com modificações, que consiste na injeção intraestrital de colagenase
bacteriana IV-S com auxílio de um esterotáxico.
Os animais foram primeiramente anestesiados com cloridrato de cetamina (100
mg/kg, Syntec, Santana de Parnaíba, Brasil) e cloridrato de xilazina (15 mg/kg,
Syntec) e analgesiados com cloridrato de tramadol (12,5 mg/kg, Cristália, Itapira,
Brasil), diluídos com solução salina (NaCl 0,9% p/v), através de injeção
intraperitoneal. Após verificação da efetividade do plano anestésico, os animais eram
posicionados no esterotáxico (Stoelting, Wood Dale, Estados Unidos) e submetidos à
tricotomia e a assepsia cirúrgica. Em seguida, era feita uma injeção intradérmica de
cloridrato de lidocaína (Cristália) (5 mg/kg) no local onde seria feita incisão na pele de
aproximadamente 1,5 cm na linha média do escalpe. O bregma era localizado e em
seguida eram encontradas as seguintes coordenadas estereotáxicas: 0,2 mm
anteroposterior e 3 mm médio-lateral. Uma cranioectomia de aproximadamente 1,5
mm de diâmetro era realizada, e após expor-se as meninges e o parênquima cerebral,
subtraia-se 6 mm da coordenada do eixo dorso-ventral e eram injetados 2 L de
36
colagenase tipo IV-S (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Estados Unidos), previamente
preparada e estocada em uma solução balanceada de Hank’s (Gibco, Grand Island,
Estados Unidos). Foram utilizadas as doses de 0,1 U (0,05 U/L) e 0,25 U (0,125
U/L) de colagenase para os modelos de AVEh moderado e severo, respectivamente.
A administração da colagenase foi executada na velocidade de 0,25 L/min utilizando
seringa de 10 L (Hamilton Company, Reno, Estados Unidos), com auxílio de uma
bomba de infusão (Harvard Apparatus, Orlando, Estados Unidos). Ao término da
infusão, a agulha foi mantida pelo tempo de 10 min, com o objetivo de evitar refluxo
do líquido. A retirada da agulha foi feita lentamente (2 mm a cada minuto), o orifício
ósseo fechado através de cimento cirúrgico e a pele colada com cola cirúrgica.
5.4 EXTRAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON E CULTIVO CELULAR
Os cordões umbilicais foram coletados após a assinatura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho, consubstanciado pelo parecer HUCFF519.235).
O nosso laboratório mantém uma coleção de células congeladas para uso e ao
chegar um novo cordão umbilical, a extração era realizada conforme descrito a seguir,
seguindo protocolo adaptado de Goldenberg et al. (2012): o cordão umbilical recolhido
era mantido sob refrigeração (Figura 6), em solução salina com 5% de glicose, por no
máximo 24 h após o parto até ser processado. Primeiramente, o cordão era lavado
com salina tamponada com fosfato 10 mM pH 7,4 (PBS, do inglês phosphate buffer
saline) para retirar o sangue dos vasos. A geleia de Wharton era então separada com
auxílio de pinça, triturada e colocada em Erlenmeyer com tampa. Adicionava-se 0,4%
de colagenase tipo II e mantinha-se por 16 h a 37°C, sob agitação lenta. Coletava-se
o material digerido, diluia-se em PBS até o dobro de volume inicial e homogenizava-
se. O material era submetido a três centrifugações consecutivas de 15 min cada,
sendo 2000 xg, 1000 xg e 500 xg, intercaladas com o descarte do sobrenadante e
nova suspensão em PBS a cada centrifugação. Após a última centrifugação,
ressuspendia-se o precipitado de células e plaqueava-se em meio DMEM low glucose
(do inglês Dulbecco’s modified Eagle médium, Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos)
suplementado com 15% de SFB (soro fetal bovino, Invitrogen) e 1% de
37
penicilina/estreptomicina (P/S) (Sigma-Aldrich). As células eram então incubadas a
37°C e 5% de CO2.
Lavagem com PBS
3X • 2000 xg
• 1000 xg
• 500 xg
Material digerido PBS
Colagenase II 16 h 37°C
Ressuspensão DMEM 15%SFB 1% P/S
Trituração
Plaqueamento DMEM 15%SFB 1% P/S 37°C/5%CO2
Tripsinização Congelamento das hWJ-MSCs
Coleta do cordão
Figura 6: Representação da extração das células mesenquimais da geleia de Wharton de cordão umbilical humano. Adaptado da descrição de Goldenberg et al. (2012).
38
As culturas eram mantidas em garrafas de 75 cm2, sendo feita a primeira troca de
meio após 4 ou 5 dias. Posteriormente, a renovação do meio ocorria a cada 2 ou 3
dias com lavagem em PBS após a primeira troca e até a primeira passagem. Ao
atingir cerca de 80-90% de confluência (aproximadamente 5 milhões de células), o
meio de cultura era descartado e a lavagem feita com PBS. Em seguida era realizada
a remoção enzimática das células aderidas ao plástico através da incubação por 5
min com solução de tripsina (0,25% de tripsina e 1 mM de EDTA, Gibco, Grand
Island, Estados Unidos) em estufa a 37°C e 5% de CO2. A tripsina era inativada com
a ressuspensão em 5 mL de meio DMEM-F12 suplementado com 15% de SFB 1% de
P/S e em seguida o conteúdo ressuspendido e centrifugado por 5 min a 300 xg. O
precipitado formado era ressupendido e plaqueado na proporção 1:3 em garrafas
(aproximadamente 1 milhão de células), caracterizando uma passagem.
As células eram mantidas congeladas na quantidade de 2 x 106 células por
criotubo em galão de nitrogênio líquido. Para a rotina da terapia celular realizada
neste trabalho as células eram utilizadas recém-descongeladas. O descongelamento
era feito com adição de DMEM-F12 com 15% SFB para ressuspensão das células,
transferidas para tubo Falcon de 15 mL e centrifugadas a 300 xg por 5 min. O meio
era descartado e as células ressuspendidas em DMEM-F12 sem soro suplementado
com glutamina e P/S. As células eram contadas e avaliada a sua viabilidade,
centrifugadas novamente, o meio descartado, e então ressuspendidas em PBS
contendo DNAse tipo 1 (15 L para cada 50 mL, Pulmozyme®, Roche, Basiléia,
Suiça). A viabilidade das células foi em média 88,68% ± 3,7. As células foram
utilizadas entre a terceira e quinta passagens.
5.5 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON
5.5.1 Imunofenotipagem das hWJ-MSCs
A caracterização das hWJ-MSCs foi realizada através da detecção de
marcadores de superfície típicos desse tipo celular por citometria de fluxo. Para isso,
as células em 3º passagem foram tripsinizadas e incubadas com os anticorpos
diluídos 1:50 em PBS 0.5% com albumina de soro bovino (BSA, do inglês bovine
serum albumine; Sigma-Aldrich) durante 20 minutos a 4ºC. Os anticorpos utilizados
39
foram: anti-CD73 conjugado com APC (cat. 560847) (BD Biosciences), anti-CD90
conjugado com PE-Cy5 (cat. 555597) (BD Biosciences), anti-CD105 conjugado com
PE (cat. 560839) (BD Biosciences) e anti-HLA-DR conjugado com PE-Cy5 (cat.
551375)(BD Biosciences). Em seguida, as células foram lavadas uma vez com PBS e
centrifugadas a 300 xg durante 5 min. O sobrenadante foi ressuspendido em 300 µL
de PBS e a leitura foi realizada no citômetro de fluxo FACSAria II (BD Biosciences).
As análises foram realizadas utilizando o software FlowJo versão X, (Flowjo LLC,
Ashland, Estados Unidos).
5.5.2 Análise de Multipotência das hWJ-MSCs
5.5.2.1 Diferenciação Condrogênica
A diferenciação em linhagem condrogênica foi realizada utilizando o StemPro
Chondrogenesis Differentiation kit (A10071-01, StemPro, Gibco) e hWJ-MSCs na 4º
passagem. Para isso, as células de uma placa de 100 mm de diâmetro a uma
confluência de 70-80% foram tripsinizadas e centrifugadas a 300 xg durante 5 min. O
pellet foi ressuspendido em meio DMEM-F12 suplementado a uma concentração de
1,6 x 107 células/mL. Em seguida, 5 µL de solução de células foram gotejados com
cuidado no meio de poços de placas de 24 poços. A micromassa de células foi
incubada a 37ºC e 5% CO2 durante 2 h e em seguida foram adicionados 290 µL de
meio de condrogênese (StemPro Osteocyte/Chondrocyte Differentation Basal Medium
suplementado com 10% StemPro Chondrogenesis Supplement e 0,5% de P/E). O
meio foi trocado a cada 2-3 dias durante 14 dias e as massas celulares foram fixadas
com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (PFA 4%) durante 30 min. Depois
de fixadas, as massas celulares foram incubadas com solução 1% de Alcian Blue
preparada em HCl 0,1 N durante 30 min, e seguidamente cortadas no criostato e
montadas em lâminas. As imagens foram adquiridas por microscopia de campo claro
em um microscópio invertido Axiovert 135 (Carl Zeiss, Estocolmo, Suécia).
5.5.2.2 Diferenciação Osteogênica
40
A diferenciação em osteócitos foi realizada utilizando o StemPro Osteogenesis
Differentiation kit (A10072-01, StemPro, Gibco). As células foram plaqueadas em
placas de 6 poços a uma densidade de 5 x 104 células por poço. Quando as células
chegaram a uma confluência de 60-70%, o meio foi trocado por meio de diferenciação
osteogênica (StemPro Osteocyte/Chondrocyte Differentation Basal Medium
suplementado com 10% StemPro Osteogenesis Supplement e 0,5% de P/S). O meio
foi trocado a cada 3-4 dias e após 7 dias as células foram fixadas com PFA 4%
durante 30 min. As células foram lavadas 2 vezes com água destilada, incubadas com
solução de Alzarin Red S 2% durante 3 min e lavadas novamente 2-3 vezes com
água destilada. As imagens foram adquiridas por microscopia de campo claro em um
microscópio invertido Axiovert 135 (Carl Zeiss).
5.5.2.3 Diferenciação Adipogênica
A diferenciação adipogênica foi realizada utilizando o StemPro Adipogenesis
Differentiation kit (A10070-01, Stempro, Gibco). As células foram plaqueadas em
placas de 6 poços a uma densidade de 1 x 105 células por poço. Quando as culturas
atingiram uma confluência de 60-70%, o meio foi trocado por meio de diferenciação
adipogênica (StemPro Adipocyte Differentation Basal Medium suplementado com
10% StemPro Adipogenesis Supplement e 0,5% de P/S). O meio foi trocado a cada 3-
4 dias e após 7 dias as células foram fixadas com PFA 4% durante 30 min. As células
foram lavadas 2 vezes com PBS e incubadas com Oil Red O, e finalmente as imagens
foram adquiridas por microscopia de campo claro em um microscópio invertido
Axiovert 135 (Carl Zeiss).
5.6 ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE CÉLULAS
As hWJ-MSCs foram administradas por injeção intravenosa na veia da cauda,
na quantidade de 3 x 106 células, suspensas em 500 L de PBS/ DNase. Nos animais
do grupo veículo e do grupo sham foram administrados 500 L de PBS/DNAse. No
modelo de AVEh moderado as células foram injetadas 24 h após cirurgia e no modelo
de AVEh severo nos tempos de 1h ou 24 h após a cirurgia.
41
5.7 PERFUSÃO TRANSCARDÍACA
Os animais foram submetidos à eutanásia, com cloridrato de cetamina e
cloridrato de xilazina, no 22º dia após a lesão e a uma perfusão transcardíaca com
infusão de solução salina 0,9%, visando à retirada de todo o sangue do sistema
vascular. Em seguida foi realizada a infusão de solução de PFA 4% em tampão
fosfato 0,1 M, para fixação do tecido. As cabeças dos animais eram armazenadas em
tubo Falcon, em solução de PFA 4%, até o dia da realização de RM.
5.8 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
Com o objetivo de analisar o volume de lesão, foram adquiridas imagens de RM
das cabeças dos animais, 22 dias após a cirurgia.
5.8.1 Ressonância Magnética – Modelo AVEh moderado
Para o modelo de AVEh moderado, as imagens foram adquiridas em um
scanner de 7 T (Varian 7T/210, Agilent Technologies, Palo Alto, Estados Unidos, do
Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem (CENABIO/UFRJ). Foram
realizadas imagens nas sequências gradiente 3D T1 e gradiente T2* axial, usando os
mesmos parâmetros geométricos: FOV = 30,7 x 30,7 x 30,7 mm com matriz de 256 x
256 x 256, voxel isotrópico de 0.12 mm.
As imagens ponderadas em T1 foram adquiridas com uma sequência gradiente
eco (GRE) com os seguintes parâmetros: TR/TE: 50/5ms, ângulo de flip = 20 graus,
17 médias; tempo de aquisição: 15 h 28 min. As imagens ponderadas em T2* foram
adquiridas com uma sequência GRE com os seguintes parâmetros: TR/TE: 500/15
ms; Flip Angle: 20º, espessura: 1 mm, 14 cortes contínuos, 40 médias, tempo de
aquisição: 1h25 min
O volume de lesão e volume dos hemisférios foram calculados com o uso do
software OsiriX versão 4.0 (Pixmeo SARL, Bernex, Suíça) por um examinador cego.
Para avaliar a lesão hemorrágica, a região de interesse (ROI, do inglês region of
interest), foi marcada em torno da lesão, em todos os cortes coronais que a mesma
42
era visível. Ao final, solicitou-se que o software integrasse todas as regiões
demarcadas, obtendo-se assim o volume total, que era calculado automaticamente
pelo próprio software.
Para calcular o volume dos hemisférios, a área de cada hemisfério foi medida
em 40 cortes coronais a partir da coordenada estereotáxica anteroposterior +2,20 mm
do bregma. Ao final, solicitou-se que o software integrasse todas as regiões
demarcadas, obtendo-se assim o volume total, calculado automaticamente pelo
próprio software. O procedimento foi realizado individualmente para cada hemisfério.
5.8.2 Ressonância Magnética – Modelo AVEh severo
Para o modelo de AVEh severo, as imagens foram adquiridas em um sistema
de Ressonância Magnética de 2 T composto por um magneto Oxford Instruments
85310HR (Oxford Instruments, Abingdon, Reino Unido) e console Bruker Avance AVIII
(Bruker-Biospin, Ettlingen, Alemanha) no Centro de Imagens e Espectroscopia In Vivo
por Ressonância Magnética (CIERMag) do Instituto de Física de São Carlos (IFSC)
da Universidade de São Paulo (USP).
Sequências 3D ponderadas em T1, T2 e T2* foram adquiridas utilizando os
mesmos parâmetros geométricos: FOV = 32 x 32 x 32 mm com matriz de 128 x 128 x
128, resultando em uma resolução espacial isotrópica de 250 µm. As imagens
ponderadas em T1 foram adquiridas com uma sequência gradiente eco (GRE) com os
seguintes parâmetros: TE/TR = 15/3,5 ms, ângulo de flip = 30 graus, largura de banda
= 15 kHz e 16 médias (tempo total de aquisição: 1h). As imagens ponderadas em T2
foram adquiridas utilizando uma sequência PSIF com os seguintes parâmetros:
TR/TE: 24/7msângulo de flip = 60 graus, largura de banda = 15 kHz e 16 médias
(tempo total de aquisição: 2h). Finalmente, as imagens ponderadas em T2* foram
adquiridas com uma sequência gradiente eco (GRE) com os seguintes parâmetros:
TE/TR = 20/10,5 ms, ângulo de flip = 5 graus, largura de banda = 15kHz e 12 médias
(tempo total de aquisição: 1 h).
O volume de lesão e volume dos hemisférios foi calculado com o uso do
software Medical Image Processing, Analysis and Visualization versão 4.0 (National
43
Institute of Health – NIH) por um examinador cego. Para avaliar o volume de lesão, a
região de interesse (ROI, do inglês region of interest) foi marcada em torno da lesão,
em todos os cortes coronais que a mesma era visível. Ao final, solicitou-se que o
software integrasse todas as regiões demarcadas, obtendo-se assim o volume total,
que era calculado automaticamente pelo próprio software.
Para calcular o volume dos hemisférios, a área de cada hemisfério foi medida
em 50 cortes coronais a partir da coordenada estereotáxica anteroposterior +2,70 mm
do bregma. Ao final, solicitou-se que o software integrasse todas as regiões
demarcadas, obtendo-se assim o volume total, calculado automaticamente pelo
próprio software. O procedimento foi realizado individualmente para cada hemisfério.
5.9 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99M TC
Para avaliar a biodistribuição das hWJ-MSCs administradas intravenosamente, as
células foram marcadas com o radioisótopo tecnécio-99m (99mTc). Para cada animal,
3 x 106 hWJ-MSCs foram incubadas em 500 µL de solução de SnCl2 por 10 min à
temperaturas ambiente. Em seguida, aproximadamente 7 mCi de 99mTc foram
adicionados e a incubação continuou por mais 10 min. Após centrifugação de 500 xg
por 5 min, o sobrenadante foi descartado e as células lavadas com solução salina. O
precipitado de células foi ressuspendido em solução salina e a viabilidade das
mesmas foi avaliada usando azul de trypan. A eficiência da marcação foi calculada
pela atividade no precipitado dividida pela soma da radioatividade no precipitado mais
o sobrenadante, sendo maior que 90% em todos os casos (BARBOSA DA FONSECA
et al., 2010). A biodistribuição das células foi avaliada in vivo no tempo de 2 h após a
administração em uma gama câmara Millenium GE de duas cabeças com colimador
de alta resolução e baixa energia (General Eletric Medical Systems, Milwaukee,
Estados Unidos). Como controle de que o que estamos observando seria realmente a
distribuição corporal das hWJ-MSCs marcadas, injetamos 99mTc livre em um animal, o
qual também foi submetido à aquisição de imagem em gama câmara. Passadas 24 h,
os principais órgãos (sangue, coração, pulmões, rins, baço, fígado, estômago,
intestino, hemisfério cerebral direito, hemisfério cerebral esquerdo) foram dissecados,
pesados e a atividade medida em um contador gama (Perkin Elmer, Shelton, estados
44
Unidos). A biodistribuição foi avaliada em 3 animais em cada grupo (AVEh moderado,
AVEh severo, naive e sham).
Para calcular a % dose/grama de tecido, foi realizado o seguinte cálculo:
% dose/órgão: radiotividade medida do órgão x 100
Soma das radioatividades de todos os órgãos medidos
Em seguida:
% dose/grama de tecido: % dose/órgão
massa do órgão (g)
5.10 AVALIAÇÃO FUNCIONAL
Os animais eram sempre ambientados por no mínimo 30 min na sala de
realização de teste funcional, mantidos no escuro, com uma iluminação mínima na
sala e os testes funcionais realizados por um examinador cego
5.10.1 Rotarod
Este teste consiste em colocar o animal sobre um cilindro giratório, avaliando-
se o tempo que o animal consegue se equilibrar sobre esse cilindro. Foram realizadas
três rodadas do teste, de 7 min cada ou até que o animal se desequilibrasse, não
ultrapassando 7 min. Entre uma rodada e outra, aguardava-se 5 min. A rotação do
cilindro era crescente, até atingir 37 rpm. Esse teste foi realizado nos tempos de -2
(pré-teste), 3, 7, 14 e 20 dias nos modelos de AVEh moderado e AVEh severo 24 h
Para avaliação dos animais do modelo de AVEh severo que receberam injeção 1 h
após início do hematoma, realizou-se o rotarod três dias consecutivos antes da
cirurgia (pré-teste) e após nos dias 3,14 e 21.
5.10.2 Elevated body swing test
O animal era suspenso pela cauda e era observado o comportamento de
rotacionar a cabeça e elevar o corpo para um lado. Um swing era contado sempre
45
que o animal movia sua cabeça mais de 10° para fora do eixo vertical, para a direita
ou esquerda. Antes de o próximo swing ser contado, o animal devia retornar para a
posição vertical. O teste consistia em contar 20 swings, intercalados a cada 5. Foi
realizado nos seguintes tempos: -1 (pré-teste), 1 (antes de realizar a administração
IV), 8, 15 e 21 dias para os grupos sham, veículo e hWJ-MSCs nos modelos AVEh
moderado e AVEh severo 24 h. Para avaliação dos animais do modelo de AVEh
severo que receberam injeção 1 h após início do hematoma, realizou-se o body swing
apenas no tempo de 21 dias.
5.10.3 Teste do cilindro
O animal era colocado dentro do cilindro com as medidas de 20 cm x 30 cm
(D x A). Eram contados 20 eventos, dentro de no máximo 20 min. Caso não
ocorressem os 20 eventos neste tempo, o teste era encerrado com um número menor
destes. Os eventos correspondiam ao número de vezes que o animal se apoiava com
a pata direita (contralateral à lesão), com a pata esquerda (ipsilateral à lesão) ou com
ambas na parede do cilindro. O teste somente era contabilizado se ocorressem pelo
menos 10 eventos. Ao final era utilizada a seguinte fórmula:
% de assimetria = [I/(I+C+B)] – [C/(I+C+B)], onde:
I = uso da pata ipsilateral (esquerda)
C = uso da pata contralateral (direita)
B = uso de ambas patas
O teste foi realizado nos dias -1 (pré-teste), 4, 8, 15 e 21 dias após cirurgia para os
grupos sham, salina e hWJ-MSCs nos modelos AVEh moderado e AVEh severo 24
h.
5.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad
Prism versão 6.01 (GraphPad Prism, Inc., San Diego, Estados Unidos). Os dados
foram expressos como média ± SD, ou como média ± SEM. Foram utilizados os
seguintes testes estatísticos: análise de variância de dois fatores (ANOVA), com teste
de comparação múltipla de Tukey, ANOVA com teste de comparação múltipla de
46
Bonferroni ou teste t de Student, após confirmação da normalidade com teste
D’Agostino-Pearson. As diferenças observadas foram consideradas significantes
quando p < 0,05.
47
6. RESULTADOS
6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS MSCS DA GELEIA DE WHARTON
Todos os experimentos realizados neste trabalho foram conduzidos utilizando
hWJ-MSCs derivadas do cordão umbilical de um único doador. As células deste
cordão foram caracterizadas como mesenquimais tanto através da imunofenotipagem,
demonstrando a expressão dos marcadores CD73, CD90 e CD105 (≥95%) e baixa
expressão do marcador HLA-DR (≤2%), quanto através da diferenciação nas
linhagens celulares adipogênica, osteogência e condrogênica, conforme mostram as
figuras 7 e 8.
Figura 7: Caracterização das MSCs de cordão umbilical por imunofenotipagem. Análise
por citometria de fluxo demonstrou que as células estromais mesenquimais do cordão
umbilical utilizadas neste estudo eram CD73 (99,8%) (A), CD90 (98,9%) (B) e CD105
(99,7%)(C) positivas e HLA-DR (D) negativas. n = 1.
A B
C D
48
6.2 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO
A coordenação motora e as alterações do equilíbrio foram avaliadas através do
tempo de permanência dos animais no Rotarod. Para o modelo de AVEh moderado,
não foram observadas diferenças significativas entre os grupos hWJ-MSCs, sham e
veículo ao longo dos 20 dias de avaliação (Figura 9).
Linhagem adipogênica Linhagem condrogênica Linhagem osteogênica
100um 100um 100um
Figura 8: Diferenciação das hWJ-MSCs em linhagens celulares mesodérmicas. Fotomicrografias demonstrando a marcação da linhagem condrogênica com Alcian Blue, adipogênica com Oil Red e osteogênica com Alzarin Red. Barras de escala correspondem a 50 µm.
49
Figura 9: Teste do Rotarod no AVEh moderado. Não houve diferença entre os grupos no modelo de AVEh moderado. Veículo n=8; hWJ-MSCs n = 8; sham n= 10. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
Outro teste utilizado de alterações motoras foi o EBST. Na avaliação do EBST,
no modelo de AVEh moderado, foi observada diferença significativa entre os grupos
sham e veículo apenas no tempo de 8 dias, com recuperação espontânea posterior,
não havendo prejuízo funcional nos demais tempos (Figura 10).
50
Figura 10: Elevated body swing test no AVEh moderado. Foi observada diferença significativa no modelo de AVEh moderado apenas entre o grupo sham e salina no tempo de 8 dias. Veículo n = 9, hWJ-MSCs n = 10, sham n = 10; ** = ρ < 0,01 (comparação entre os grupos veículo e sham); Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
No teste do cilindro, não houve diferença significativa entre os grupos salina e
sham no modelo de AVEh moderado em nenhum dos tempos avaliados, havendo no
entanto uma diferença entre os grupos hWJ-MSCs e sham nos tempos de 4 e 21 dias.
Este teste demonstrou não ser eficaz para avaliar o prejuízo funcional dos animais do
modelo de AVEh moderado, tendo ocorrido uma variabilidade grande nos resultados
entre os animais, além de alguns animais terem seus resultados descartados para
análise estatística, pois não cooperaram na realização do teste em algumas datas
avaliadas (Figura 11).
51
Figura 11: Teste do cilindro no AVEh moderado. Não foi detectado prejuízo funcional no grupo veículo quando comparado ao grupo sham, porém houve maior assimetria no grupo hWJ-MSCs nos tempos de 4 e 21 dias. Veículo n=9; hWJ-MSCs n = 8, sham n= 10; † = comparação entre os grupos MSCs e sham. † = ρ < 0,05, Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
6.3 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH MODERADO
Para avaliarmos se a terapia celular levaria a uma redução do volume de lesão,
realizamos a aquisição de imagens por RM de todos os animais (cabeças fixadas) dos
grupos veículo e hWJ-MSCs, no 22º dia após a cirurgia. Após a obtenção da imagem,
calculamos individualmente o volume da lesão em cada corte coronal na sequência
T1 eco 3D que apresentava lesão. Em seguida, solicitamos ao software para integrar
os valores e calcular o volume total da lesão. A figura 12 mostra imagens
representativas da lesão na região do estriado nos eixos axial, coronal e sagital em
um animal veículo e em um animal tratado com hWJ-MSCs, os quais apresentaram
um volume de lesão próximo da média de seu respectivo grupo. A extensão da lesão
no grupo veículo foi de +2,25 ± 0,36 mm a -2,47 ± 0,15 mm em relação ao bregma e
no grupo hWJ-MSCs de + 2,39 ± 0,21 mm a -2,04 ± 0,38 mm em relação ao bregma.
52
O contorno em vermelho demonstra a região de interesse (ROI) marcada para
posterior cálculo do volume (figura 13). A análise do volume de lesão nos animais dos
grupos veículo e hWJ-MSCs demonstrou diferença significativa entre os grupos. A
média de volume da lesão no grupo veículo foi de 10,5 mm3 (DP = 2,36) e no grupo
hWJ-MSCs foi de 7,6 mm3 (DP = 3,08) (p = 0,0390, teste t de Student).
AV
Eh +
Ve
ícu
lo
AV
Eh +
hW
J-M
SCs
Figura 12: Volume de lesão nos animais com AVEh moderado. Imagens representativas de cortes axiais (A,D), coronais (B,E) e sagitais (C, F) obtidos em equipamento de RM com uma sequência T1 echo 3D. Grupo veículo (A,B,C,) e grupo hWJ-MSCs (D, E, F).
53
Vo
lum
e d
e l
es
ão
(m
m3)
A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J -M S C s
0
5
1 0
1 5
*
Figura 13: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh moderado. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas, nos grupos veículo (n= 9) e hWJ-MSCs (n = 10). (*) p = 0,0390; Teste t de Student; média do grupo veículo = 10,5 ± 2,27 mm
3; média do grupo hWJ-MSCs = 7,6 ± 3,1
mm3. Os dados mostrados no gráfico representam valores individuais, com as médias e o desvios
padrão. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana
A figura 14 representa a lesão no eixo coronal na sequência T2*. A
desvantagem dessa sequência é que, ocasionalmente, o tamanho da lesão, é
impreciso devido aos artefatos que causam perda de sinal no limite das lesões
C
54
(MIRZA E GOKHALE, 2017). Assim, optou-se em realizar a medida de volume
apenas na sequência T1, evitando superdimensionar o volume de lesão.
6.4 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH MODERADO
Com o intuito de analisar se a terapia celular ajudaria a reduzir a atrofia do
hemisfério lesado, realizamos a medida de volume em 40 cortes de cada amostra,
através da marcação manual do ROI e posterior integração, obtendo o valor total do
volume de cada hemisfério. A avaliação realizada do volume dos hemisférios
esquerdo e direito nos grupos veículo e hWJ-MSCs mostrou uma diferença
significativa entre os dois hemisférios, em ambos os grupos experimentais, com o
hemisfério esquerdo (ipsilateral à lesão) aproximadamente 5% menor do que o direito
(Figura 15). No entanto, ao calcularmos a razão entre o volume do hemisfério
ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral (%ipsilateral/contralateral)
não observamos diferença estatisticamente significativa entre os grupos (Figura 16).
Ao calcularmos o percentual do volume de lesão em relação ao volume do hemisfério
ipsilateral observamos um valor médio ligeiramente menor do grupo hWJ-MSCs
quando comparado ao veículo, porém sem haver diferença significativa entre os
grupos.
A B
Figura 14: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh moderado em uma sequência T2*. Grupo veículo (A) e grupo hWJ-MSCs (B). Corte no eixo coronal.
55
Vo
lum
e d
os
he
mis
fério
s n
o g
ru
po
ve
ícu
lo
(mm
3)
H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
3 0 0
3 2 0
3 4 0
* *
Vo
lum
e d
os
he
mis
fério
s n
o g
ru
po
hW
J-M
SC
s
(mm
3)
H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
3 0 0
3 2 0
* * *
B
A
Figura 15: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh moderado. Grupos veículo (n=9) (A) e hWJ-MSCs (n=10) (B). (**) p = 0,0063; (***) p = 0,0002; Grupo Veículo (hemisfério contralateral = 285,8 ± 19,13 mm
3; hemisfério ipsilateral = 271,6 ± 17,71 mm
3); grupo hWJ-
MSCs (hemisfério contralateral = 271,9 ± 8,67 mm3; hemisfério ipsilateral = 256,6 ± 7,21). Os dados
mostrados no gráfico representam valores individuais. Teste t pareado.
A B
56
% d
e v
olu
me
he
mis
fério
ip
sil
ate
ra
l /
co
ntr
ala
tera
l
A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J - M S C s
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
1 0 5
1 1 0%
Vo
lum
e d
e l
es
ão
/
vo
lum
e h
em
isfé
rio
ip
sil
ate
ra
l
A V E h + v e íc u lo A V E h + h W J - M S C s
0
2
4
6
8
A
B
Figura 16: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh moderado.(A) Determinação do percentual do volume do hemisfério ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral dos grupos veículo (média= 95,6 ± 4,04) e hWJ-MSCs (média=94,5 ±2,85). (B) Determinação do % do volume de lesão em relação ao volume do hemisfério ipsilateral nos animais com AVEh moderado dos grupos veículo (média=3,86 ± 0,82) e hWJ-MSCs (média=2,99 ± 1,13). Teste t não pareado. Veículo: n = 9, hWJ-MSCs: n = 10. Os dados mostrados no gráfico representam
valores individuais. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
57
6.5 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 24 H
No modelo de AVEh severo tratado 24 h após a cirurgia, observamos um
prejuízo funcional no grupo veículo, quando comparado ao grupo sham, nos tempos
de 3 e 7 dias (Figura 17) no teste do Rotarod. No tempo de 3 dias, também
observamos que ocorreu diferença siginificativa entre o grupo hWJ-MSCs e sham,
mostrando que logo após a cirurgia ocorre um déficit motor tanto no grupo tratado
quanto no grupo veículo, e que só depois passa a ocorrer uma recuperação de ambos
os grupos, sugerindo que os animais do grupo hWJ-MSCs se recuperaram um pouco
mais rápido, visto que no tempo de 7 dias só houve diferença siginificativa entre o
grupo sham e veículo.
Figura 17: Teste do Rotarod no AVEh severo 24 h. Houve um prejuízo funcional nos tempos de 3 e 7 dias para o grupo veículo e apenas no dia 3 para o grupo hWJ-MSCs. Veículo n = 14; hWJ-MSCs n = 12, sham n= 10. # = comparação entre os grupos salina e sham; † = comparação entre os grupos hWJ-MSC e sham. † = ρ < 0,05, †† = ρ < 0,01, ### = ρ < 0,001; Two-way ANOVA com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimaisda geleia de Wharton humana.
58
No EBST do modelo de AVEh severo tratado 24 h após a cirurgia (Figura 18)
observamos um prejuízo funcional em todos os tempos avaliados, sem haver
recuperação no grupo veículo, nos 21 dias analisados. O grupo hWJ-MSCs também
foi diferente do grupo sham em todos os tempos.
T e m p o (d ia s )
% E
lev
aç
ão
pa
ra
a d
ire
ita
-1 1 815
21
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A V E h + V e íc u lo (n = 1 4 )
S h a m (n = 1 0 )
A V E h + h W J -M S C s (n = 1 2 )
# # # #
† †† † †
# # # # # ## # # #
D ia 0
C iru rg ia
D ia 1
In jeção
† †
Figura 18: Elevated body swing test no AVEh severo 24 h. Observou-se diferença significativa dos grupos veículo e hWJ-MSCs em relação ao grupo sham em todos os tempos avaliados. Veículo n = 14; hWJ-MSCs n = 12, sham n = 10. # = comparação entre os grupos veículo e sham; † = comparação entre os grupos hWJ-MSC e sham. † = ρ < 0,05, ### = ρ < 0,001, #### = ρ < 0,0001; Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
No teste do cilindro, observamos também um prejuízo funcional do grupo
veículo em todos os tempos avaliados, com diferença significativa em relação ao
grupo sham (Figura 19). O grupo hWJ-MSCs mostrou diferença significativa em
relação ao grupo sham no tempo de 8 dias, sugerindo uma menor assimetria nos
59
demais tempos avaliados. Ressalta-se que os animais que não conseguiram fazer o
teste em todos os tempos, foram desconsiderados na análise estatística.
Figura 19: Teste do cilindro no AVEh severo 24 h. Não foi observada recuperação funcional no modelo de AVEh severo. Veículo n = 11, hWJ-MSCs n = 12, sham n= 10. # = comparação entre os grupos veículo e sham; † = comparação entre os grupos hWJ-MSCs e sham. † = ρ < 0,05, ## = p < 0,01, #### = ρ < 0,0001, Two-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
6.6 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 24H
Para avaliarmos se a terapia celular levaria a uma redução do volume de lesão
também no AVEh severo tratado em 24 h, nós realizamos a aquisição de imagens por
RM de todos os animais dos grupos veículo e hWJ-MSCs, no 22º dia após a cirurgia.
Realizamos o procedimento conforme já descrito anteriormente, com a diferença de
que utilizamos outro scanner de RM para a aquisição das imagens. A figura 20 mostra
60
imagens representativas da lesão na região do estriado nos eixos axial, coronal e
sagital em um animal veículo e um animal hWJ-MSCs, que apresentaram um volume
de lesão próximo da média de seu respectivo grupo. A extensão da lesão no grupo
veículo foi +2,09 ± 0,22 a -3,12 ± 0,19 mm em relação ao bregma e no grupo hWJ-
MSCs foi de + 2,5 ± 0,28 a -2,64 ± 0,24 mm em relação ao bregma. O contorno em
vermelho demonstra a região de interesse (ROI) marcada para posterior cálculo do
volume (Figura 21). A análise do volume de lesão nos animais dos grupos veículo e
hWJ-MSCs não demonstrou diferença significativa entre os grupos, quando avaliadas
as imagens na sequência T1 echo 3D (Figura 21). A média de volume da lesão no
grupo veículo foi de 20,16 mm3 (DP = 2,625) e no grupo hWJ-MSCs foi de 20,88 mm3
(DP = 2,763). A figura 22 mostra a lesão no eixo coronal na sequência T2*.
61
AV
Eh +
Ve
ícu
lo
AV
Eh +
hW
J-M
SCs
Figura 20: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 24 h. Cortes axiais (A,D), coronais (B,E) e sagitais (C,F) obtidos em uma sequência T1 echo 3D. Grupo veículo (A, B, C,) e hWJ-MSCs (D, E, F).
62
Vo
lum
e d
e l
es
ão
(m
m3)
A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J -M S C s
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
Figura 21: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 24 h. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas dos volumes da lesão nos grupos veículo (n = 14) e hWJ-MSCs (n = 12). Não houve diferença significativa entre os grupos. Média do grupo veículo = 20,16 ± 2,625 mm
3;
média do grupo hWJ-MSCs = 20,88 ± 2,763 mm3. Os dados mostrados no gráfico representam valores
individuais. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
C
63
6.7 VOLUME DOS HEMISFÉRIOS NO AVEH SEVERO 24 H
Com o intuito de analisar se a terapia celular ajudaria a manter o volume
normal do hemisfério lesado no modelo severo tratado em 24 h, realizamos a medida
em 50 cortes de cada amostra, através da marcação manual do ROI e posterior
integração, obtendo o valor total do volume de cada hemisfério. A avaliação realizada
do volume dos hemisférios esquerdo e direito nos grupos veículo e hWJ-MSCs
mostrou uma diferença significativa entre os dois hemisférios, em ambos os grupos
experimentais, com o hemisfério ipsilateral à lesão aproximadamente 5% menor do
que o contralateral (Figura 23). Não observamos diferença estatisticamente
significativa entre os grupos quando calculamos o % do volume do hemisfério
ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral (%ipsilateral/contralateral)
ou ao calcularmos o percentual do volume de lesão em relação ao volume do
hemisfério ipsilateral (Figura 24).
B A
Figura 22: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh severo 24h em uma sequência T2*. Grupo veículo (A) e grupo hWJ-MSCs (B). Corte no eixo coronal.
64
Vo
lum
e d
o h
em
isfé
rio
gru
po
ve
ícu
lo
(m
m3
)
H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l
2 5 0
3 0 0
3 5 0
4 0 0 ****V
olu
me
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he
mis
fério
gru
po
hW
J-M
SC
s
(m
m3
)
H e m is fé r io c o n tra la te ra l H e m is fé r io ip s ila te ra l
2 5 0
3 0 0
3 5 0
4 0 0 ****
A
B
Figura 23: Avaliação do volume dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh severo 24 h. Grupos veículo (n = 11) (A) e hWJ-MSCs (n = 12) (B) (****) p = < 0,0001 (***). Grupo Veículo (hemisfério contralateral = 320,8 ± 24,41 mm
3; hemisfério ipsilateral = 304,5 ± 23,42 mm
3); grupo hWJ-
MSCs (hemisfério contralateral = 337,7 ± 18,46 mm3; hemisfério ipsilateral = 322,5 ± 20,31). Os dados
mostrados no gráfico representam valores individuais, as médias e desvios padrão. Teste t pareado.
65
% d
e V
olu
me
he
mis
fério
ip
sil
ate
ra
l /
co
ntr
ala
tera
l
V e íc u lo h W J -M S C s
8 0
8 5
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9 5
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1 0 5
1 1 0%
Vo
lum
e d
e l
es
ão
/
he
mis
fério
ip
sil
ate
ra
l
V e íc u lo h W J -M S C s
0
5
1 0
1 5
A
B
Figura 24: Avaliação dos hemisférios cerebrais nos animais com AVEh severo 24 h.(A) Determinação do percentual do volume do hemisfério ipsilateral em relação ao volume do hemisfério contralateral dos grupos veículo (média = 94,97 ± 0,6895) e hWJ-MSCs (média = 95,48 ± 0,5908). (B) Determinação do % do volume de lesão em relação ao volume do hemisfério ipsilateral nos animais com AVEh severo 24 h dos grupos veículo (média = 6,536 ± 0,8112) e hWJ-MSCs (média = 6,564 ± 0,9331). Teste t não pareado. Veículo: n = 14, hWJ-MSCs: n = 12. Os dados mostrados no gráfico representam valores individuais, as médias e os desvios padrão hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
66
6.8 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1 H
Decidimos avaliar se os animais tratados com hWJ-MSCs apenas 1 h após a
injeção da colagenase, ainda na fase hiperaguda da hemorragia, apresentariam uma
maior recuperação funcional. Realizamos o teste do Rotarod, modificando o pré-teste.
Fizemos 3 dias consecutivos de pré-teste, para assim conserguimos obter uma
otimização do tempo máximo de permanência dos animais sobre o cilindro antes da
cirurgia. Após a cirurgia, os dois grupos mostraram uma queda no tempo de
permanência sobre o cilindro, porém mostrando uma recuperação similar ao longo do
tempo para os grupos veículo e hWJ-MSCs (Figura 25-A). Já o teste do EBST foi
realizado apenas no dia 21 após a cirurgia, não sendo nesse tempo detectada
diferença entre os grupos (Figura 25-B).
67
T e m p o (d ia s )
Te
mp
o p
ara
ca
ir (
s)
-3 -2 -1 314
21
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
D ia 0 C iru g ia + In je çã o
A V E h + h W J -M S C s (n = 1 4 )
A V E h + V e íc u lo (n = 1 2 )
% E
lev
aç
ão
pa
ra
dir
eit
a
AV
Eh
+ h
WJ-M
SC
s
AV
Eh
+ V
eíc
ulo
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A V E h + h W J -M S C s (n = 1 0 )
A V E h + V e íc u lo (n = 1 2 )
A
B
Figura 25: Avaliação funcional dos animais AVEh severo que receberam injeção 1 h após cirurgia. Não há diferença significativa entre os grupos veículo (n = 12) e hWJ-MSCs (n = 14) no teste do Rotarod (A). Também não foi observada diferença no Elevated body swing test no 21º dia após a cirurgia (B); veículo (n = 12) e hWJ-MSCs (n =10). Os dados mostrados no gráfico representam a média ± S.E.M. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais de geleia de Wharton humana.
68
6.9 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE LESÃO NOS ANIMAIS COM AVEH SEVERO 1H
Para avaliarmos se a terapia celular promoveria uma redução do volume de
lesão quando realizada ainda na fase hiperaguda da hemorragia, tratamos os animais
1 h após terminar a injeção da colagenase e realizamos a aquisição de imagens por
RM de todos os animais no 22º dia após a cirurgia. Realizamos o procedimento
conforme já descrito anteriormente, com a diferença de que utilizamos também o
scanner 2T de RM para a aquisição das imagens. A figura 26 mostra imagens
representativas da lesão na região do estriado nos eixos axial, coronal e sagital em
um animal veículo e um animal hWJ-MSCs, que apresentaram um volume de lesão
próximo da média de seu respectivo grupo. O contorno em vermelho demonstra a
região de interesse (ROI) marcada para posterior cálculo do volume (Figura 27). A
análise do volume de lesão nos animais dos grupos veículo e hWJ-MSCs não
demonstrou diferença significativa entre os grupos, quando avaliadas as imagens na
sequência T1 echo 3D. A média de volume da lesão no grupo veículo foi de 23,82
mm3 (DP = 1,969) e no grupo hWJ-MSCs foi de 32,83 mm3 (DP = 5,853). Observa-se
no gráfico que dois valores (89,19 e 76,56 mm3) do grupo hWJ-MSCs ficaram
discrepantes em relação ao restante do grupo. Realizou-se então o teste estatístico
de ROUT para verificação de valores outliers. Como resultado, os dois valores foram
detectados como outliers. Caso os dois valores sejam retirados, a média do grupo
muda para 24,48 mm3 (DP =1,53), mas continua não havendo diferença significativa
no volume de lesão entre os grupos hWJ-MSCs e veículo. A figura 28 mostra a lesão
no eixo coronal na sequência T2*.
69
AV
Eh +
Veí
culo
A
VEh
+ h
WJ-
MSC
s
Figura 26: Volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h. Cortes axial (A,D), coronal (B,E) e sagital (C,F) obtidos em uma sequência T1 echo 3D. Grupo veículo (A, B, C,) e hWJ-MSCs (D, E, F)..
70
Vo
lum
e d
e l
es
ão
(m
m3)
A V E h + V e íc u lo A V E h + h W J -M S C s
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 27: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas dos volumes das lesões, nos grupos veículo (n= 14) e hWJ-MSCs (n = 11). Não houve diferença significativa entre os grupos. Média do grupo veículo = 23,82 ± 1,969 mm
3; média do grupo hWJ-MSCs = 32,83 ± 5,853 mm
3.Os dados mostrados no gráfico representam
valores individuais, as médias e os desvios padrão. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
C
71
Decidimos comparar então o volume de lesão entre os grupos tratados e
veículo 1 h versus 24 h (Figura 29), não havendo diferença entre os grupos,
mantendo-se como esperado um volume médio similar entre os grupos veículos 1 h e
24 h.
Vo
lum
e d
e l
es
ão
(m
m3)
AV
Eh
+ v
eíc
ulo
24 h
AV
Eh
+ v
eíc
ulo
1 h
AV
Eh
+ h
WJ-M
SC
s 2
4 h
AV
Eh
+h
WJ-
MS
Cs 1
h
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 29: Avaliação do volume de lesão nos animais com AVEh severo 1 h versus 24 h. Representação da região de interesse (ROI) marcada em vermelho (A e B). A = grupo veículo e B = hWJ-MSCs. A figura C representa o gráfico das medidas, nos grupos veículo (n = 14) e hWJ-MSCs (n = 11). Não houve diferença significativa entre os grupos. Os dados mostrados no gráfico representam valores individuais. hWJ-MSCs = células estromais mesenquimais da geleia de Wharton humana.
B A
Figura 28: Representação do volume de hematoma residual nos animais com AVEh severo 1h em uma sequência T2*. Grupo veículo (A) e grupo hWJ-MSCs (B). Corte no eixo coronal.
72
6.10 BIODISTRIBUIÇÃO ATRAVÉS DA MARCAÇÃO DE CÉLULAS COM 99M TC
A biodistribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99mTc administradas
intravenosamente foi avaliada em 2 h, por imagem realizada em uma gama câmara e
em 24 h, através de contagem da radioatividade residual em contador gama. A figura
30 mostra a captação das células marcadas com 99mTc, 2 h após injeção, nos
pulmões, rins e fígado, de forma similar nos animais AVEh moderado, AVEh severo,
sham e naive. Como controle, também injetamos 99mTc livre em um animal, onde
observamos uma captação característica de 99mTc livre (no estômago e sistema
urinário), diferente da captação das hWJ-MSCs marcadas. A avaliação realizada após
24 h através da dissecação dos órgãos e posterior contagem da radioatividade
residual demonstrou uma captação maior nos pulmões, rins, baço e fígado, similar
nos três grupos (Figura 31). Quando analisamos separadamente os hemisférios
cerebrais, comparando os hemisférios ipsilateral à lesão e contralateral dentro de
cada grupo, observamos uma maior radioatividade residual no hemisfério ipsilateral à
lesão do que no contralateral, apenas nos grupos AVEh. Não observamos diferenças
entre os dois hemisférios nos grupos sham e naive.
Ao normalizamos o resultado da captação do hemisfério ipsilateral pela
captação do hemisfério contralateral e comparar os quatro grupos (Figura 32), apenas
o grupo AVEh severo demonstrou ser significantemente diferente em relação ao
grupos AVEh moderado, sham e naive.
73
Figura 30: Representação da imagem de corpo inteiro dos animais que receberam hWJ-MSCs marcadas com
99mTc. AVEh moderado que recebeu hWJ-MSCs-
99mTc (A), AVEh severo que recebeu
hWJ-MSCs-99m
Tc (B), sham que recebeu hWJ-MSCs-99m
Tc (C), e naive que recebeu hWJ-MSCs-99m
Tc (D) demonstrando a biodistribuição das MSCs marcadas com 99m
Tc 2 h após a injeção intravenosa. Pode-se observar a captação nos pulmões, fígado e rins. A figura E mostra o animal que recebeu tecnécio livre, presente no estômago e bexiga
AVEh moderado AVEh severo Sham
Naive Tecnécio livre
74
A V E h M o d e r a d o
% D
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cid
o
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l
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0 .4
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1 .0
2 0
4 0
6 0
S h a m
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A V E h S e v e r o
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0 .0 0
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0 .0 6
0 .0 8H e m is fé r io c o n tra la te ra l
H e m is fé r io ip s ila te ra l
***
A
B
Figura 31: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m
Tc. Análise da distribuição das hWJ-MSCs marcadas com
99m Tc 24 h após a injeção intravenosa nos animais AVEh moderado e AVEh
severo, em comparação aos grupos sham e naive, em diversos órgãos (A) e nos hemisférios cerebrais (B). n= 3 por grupo. A radioatividade está expressa como % de dose por grama de tecido. * = comparação entre os hemisférios cerebrais contralateral e ipsilateral à lesão. Two-way ANOVA, com pós teste de Bonferroni. Os dados representam a média ± SD.
75
Figura 32: Distribuição das hWJ-MSCs marcadas com 99m
Tc nos hemisférios cerebrais. Análise da distribuição das hWJ-MSCs marcadas com
99m Tc 24 h após a injeção intravenosa nos animais
AVEh moderado e AVEh severo, em comparação aos grupos sham e naive nos hemisférios cerebrais. n = 3 por grupo. * = comparação da captação do hemisfério ipsilateral / captação do hemisfério contralateral entre os 4 grupos. One-way ANOVA, com pós teste de Tukey. Os dados representam a média ± SD.
76
7. DISCUSSÃO
O AVEh está associado a altas taxas de letalidade e morbidade, sendo que
diversos estudos pré-clínicos já demonstraram o efeito benéfico de terapias celulares
com MSCs de diversas fontes em modelos experimentais de AVEh. Poucos estudos,
no entanto, avaliaram o efeito terapêutico de hWJ-MSCs em modelos de AVEh, sendo
que a maioria desses estudos utilizou a via intracerebral para a administração das
células. Apenas um estudo comparou as vias intravenosa e intracerebral para o
transplante de hWJ-MSCs no AVEh, com resultados que indicaram que ambas as
formas de administração das células são benéficas (XIE et al., 2016).
Nesse estudo, utilizamos as hWJ-MSCs recém-descongeladas, que
apresentaram uma viabilidade média de 88%, visto que no futuro da prática clínica
esse seria um cenário mais viável. A grande maioria dos ensaios clínicos utilizam
MSCs alogênicas provenientes de criobancos e recém-descongeladas (GALIPEAU e
SENSÉBE, 2018), tornando interessante que estudos pré-clínicos utilizem da mesma
metodologia. Meta-análise de Satani et al. (2019) mostrou que na comparação do
uso BM-MSCs frescas versus descongeladas em modelos de AVE isquêmico, as
células descongeladas apresentaram um escore similar ou até mesmo superior em
resultados de melhora sensório motora. No trabalho de Cruz et al. (2015) comparando
o uso de células recém-descongeladas versus células cultivadas continuamente, em
modelo de inflamação alérgica das vias aéreas, foi observado que as células recém-
descongeladas foram tão efetivas quanto as células de cultura. No nosso grupo de
pesquisa, trabalho de Vasconcelos-dos-Santos (2011) já havia estudado o uso de
CMMOs inviáveis, aquecidas a 80°C, injetadas em ratos em modelo de AVE
isquêmico, e que apresentaram recuperação funcional ao realizar teste do cilindro.
7.1 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O VOLUME DE LESÃO EM
ANIMAIS COM AVEH
O tamanho inicial do hematoma e a sua expansão são fatores que afetam o
prognóstico do paciente. Como o volume inicial e a localização do hematoma são
fatores que não podem ser modificados, terapias que ajudem a impedir a expansão
77
do hematoma ou que acelerem sua remoção/absorção são oportunidades para
reduzir o volume final do AVEh e assim melhorar o prognóstico do paciente.
Nós hipotetizamos que a administração intravenosa das hWJ-MSCs na fase
aguda do modelo de AVEh moderado seria capaz de reduzir o tamanho do
hematoma. Através da análise do volume de lesão em imagens de RM nós
demonstramos que a terapia celular foi capaz de reduzir o tamanho do hematoma,
quando avaliado já em fase crônica. Kim et al. (2015) demonstraram em estudo
utilizando injeção de 0,2 U de colagenase e transplante de MSCs de sangue de
cordão umbilical, uma redução de volume de lesão, através de método histológico,
após 4 semanas depois da cirurgia, corroborando nosso resultado. As MSCs são
descritas por conduzir a efeitos imunomodulatórios, agindo principalmente por ação
parácrina, o que poderia explicar, pelo em menos em parte, a redução do hematoma.
Essa ação benéfica das hWJ-MSCs com a redução do volume de lesão mostra que a
injeção intravenosa, além da vantagem de ser um procedimento menos invasivo,
quando comparado a outros tipos de administração, também mostrou-se eficaz no
tratamento neste modelo de AVEh moderado.
Sanada et al. (2012) mostraram que MSCs derivadas de medula óssea, fígado,
cérebro e pulmão, eram capazes de secretar o fator de coagulação VIII. No trabalho
de Christy et al. (2017) foi mostrado que as MSCs extraídas de tecido adiposo
expressaram fator tecidual, um potente ativador da cascata de coagulação, e
apresentaram atividade procoagulante na presença de sangue ou plasma. George et
al. (2018) também estudaram o efeito procoagulante de MSCs de diversas fontes
teciduais, inclusive de cordão umbilical. Todas as MSCs testadas expressaram
atividade procoagulante que se correlacionou com a expressão do fator tecidual. O
tempo de coagulação e o tempo de formação de trombina diminuíram com o aumento
da formação tecidual.
Huang et al. (2019) mostraram uma redução no volume de lesão após
injeção intraventricular de 1 x 106 células / kg e 2 x 105 células / kg de BM-MSCs em
modelo de injeção de sangue autólogo. Ao mesmo tempo, houve uma redução na
resposta inflamatória, 21 dias após injeção de BM-MSCs, através da diminuição da
expressão das citocinas IL-1-α, IL-6 e IFN-γ na dose de 2 x 105 células / kg de BM-
MSCs. Por outro lado, em trabalho prévio do nosso grupo de pesquisa, Jordão da
78
Silva-Junior (2018) demonstrou que as hWJ-MSCs aumentavam a transcrição de
citocinas descritas classicamente como pró-inflamatórias na retina, nos períodos
iniciais à lesão (1 dia), como TNF-α e IL-6.
Como já citado anteriormente, Del Bigio et al. (1996) haviam mostrado que a
infiltração de macrófagos no hematoma ocorria 48 h após a injeção de colagenase.
Sabe-se que os macrófagos levam a uma reação inflamatória em cascata, conduzindo
a uma revascularização e ao reparo em locais lesionados (LO SICCO et al., 2017).
Em um ambiente inflamatório, como o produzido durante as fases iniciais de um
processo de cicatrização, a atividade parácrina das MSCs é modulada, promovendo
uma troca funcional de macrófagos de um estado pró-inflamatório (M1) para um anti-
inflamatório (M2). Os macrófagos M2 possuem a capacidade de facilitar a reparação e
regeneração de tecidos. Entre os fatores responsáveis pelos efeitos parácrinos das
MSCs, as vesículas extracelulares (VEs) foram recentemente descritas como
participantes na comunicação célula a célula, servindo como veículo para a
transferência entre células de proteínas de membrana e citosólicas, lipídios e
informações genéticas (LO SICCO et al., 2017). Os estudos de Lo Sicco et al. (2017)
demonstraram que VEs extraídas a partir de AD-MSCs dispararam a proliferação e
polarização de macrófagos do fenótipo M1 para o M2 (CD36, CD51 e CD206
positivos). Essas VEs promoveram a redução de IL-6 e o aumento de IL-10 em
modelo de lesão muscular induzida por cardiotoxina.
CD36 é um receptor scavanger tipo B, expresso na superfície de diversos
tipos celulares: plaquetas, células endoteliais microvasculares,
monócitos/macrófagos, células dendríticas, adipócitos, células de músculo estriado e
células hematopoiéticas (GONG et al., 2017). Fang et al. (2014) mostraram que
pacientes com deficiência na expressão de CD36 apresentaram um volume de
hematoma maior 7 dias após hemorragia nos núcleos da base, do que pacientes não
deficientes em CD36, com uma taxa de absorção de hematoma menor para os CD36
deficientes. Obtiveram o mesmo resultado em modelo animal de injeção de sangue
autólogo, mostrando que o CD36 promove a redução do hematoma. Zhao et al.
(2009) já haviam mostrado que microglia/macrófagos utilizavam o CD36 para
promover a fagocitose dos eritrócitos, via receptor ativado por proliferadores de
peroxissoma gama (PPARγ), e que o aumento da sua expressão resultou em uma
resolução mais rápida do hematoma e uma melhora na recuperação funcional após
79
AVEh, reduzindo os danos cerebrais secundários, já que ajuda a remover o sangue
intraparenquimal.
Wang et al. (2012) observaram a redução no volume de lesão ao realizarem
tratamento com BM-MSCs nos animais que sofreram lesão via injeção da colagenase,
demonstrando também que as BM-MSCs promoveram proteção neuronal através da
maior expressão da proteína de neurofilamento NF200 e do marcador astrocitário
proteína glial fibrilar ácida (GFAP, do inglês glial fibrillary acidic protein). Também
mostraram um maior número de células BrdU positivas na região do peri-hematoma,
demonstrando interação das BM-MSCs com o tecido cerebral danificado e a
proliferação celular das células transplantadas, assim como um menor número de
células caspase-3 positivas na região do peri-hematoma, evidenciando que as BM-
MSCs atenuaram a apoptose celular, quando comparado ao grupo controle.
Liao et al. (2009) mostraram que o tratamento com injeção intracerebral de
MSCs extraídas de cordão umbilical em AVEh, produzido através do modelo de
injeção da colagenase, promovia uma melhora na angiogênese e na escala
neurológica, assim como uma redução no volume de lesão. Verificaram que havia um
aumento siginificativo da densidade vascular na zona peri-hematoma em 14 dias de
tratamento. Além disso, a maioria dos vasos continha MSCs transplantadas
incorporadas na vasculatura cerebral. Mostraram também uma redução de ROS, um
dos principais responsáveis pelos danos cerebrais no AVEh, na zona do peri-
hematoma, 3 dias após a injeção das células. Demonstraram in vitro uma
transdiferenciação das MSCs em células endotoliais, na presença de VEGF e do fator
de crescimento de fibroblasto básico (bFGF).
Em outro grupo de animais realizamos a injeção de 0,25 U de colagenase o
que gerou um AVEh com um volume duas vezes maior do que o moderado. Nesse
grupo, ao analisarmos o volume de lesão dos animais do grupo AVEh severo que
receberam tratamento com hWJ-MSCs em 24 h, não encontramos o mesmo resultado
do grupo AVEh moderado, isto é, não houve redução no volume de lesão e os
volumes médios do grupo tratado e veículo foram iguais no tempo de 22 dias após a
cirurgia. Não realizamos uma comparação estatística dos volumes médios obtidos nos
dois modelos (moderado e severo) devido ao fato das imagens terem sido adquiridas
em dois scanners de ressonância magnética diferentes. No entanto, mesmo
80
observando visualmente os cortes, é nítido que o modelo severo teve um volume
maior de lesão do que o modelo de grau moderado, assim como também o fato de ter
havido uma maior expansão da hemorragia. Apesar dessa diferença de volume, nós
utilizamos a mesma quantidade de células (3 x 106) para ambos os modelos, e este
pode ter sido o fator de não termos também observado uma redução de volume de
lesão no grupo hWJ-MSCs no AVEh severo. George et al. (2018) demonstraram que
a atividade procoagulante de BM-MSCs, MSCs de fluído amniótico e AD-MSCs
decaía conforme a diluição da concentração celular, mostrando ser um efeito dose
dependente. Assim, talvez fosse necessário um aumento na dose de hWJ-MSCs para
obtermos um resultado similar ao obtido no AVEh moderado para a redução do
volume de lesão.
Choi et al. (2018) demonstraram que a injeção de MSCs extraídas de placenta
humana, 1h após indução da hemorragia através de injeção de colagenase, foi capaz
de aumentar a expressão das proteínas de junção ocludente zônula-1 e ocludina, 24 h
após cirurgia. Esse efeito foi associado com redução de volume de hematoma,
sugerindo que o aumento da expressão dessas proteínas de junção ocludente
reduziriam a permeabilidade da BHE e os danos endoteliais, fazendo uma espécie de
bloqueio do vazamento de componentes do sangue para o parênquima cerebral e
atenuando assim os danos secundários. Quando nós avaliamos o efeito da terapia
celular na fase hiperaguda (1 h), não encontramos diferença significativa no volume
de lesão. No entanto, a dose de colagenase utilizada por Choi et al. (2018) para
provocar o hematoma foi de 0,1 U, enquanto nós testamos o efeito na fase
hiperaguda apenas nos animais do modelo severo, ou seja, que receberam 0,25 U de
colagenase na região estriatal. Esse fato está de acordo com a hipótese de que o
volume inicial do hematoma influencie o efeito das MSCs sobre a redução do
hematoma.
7.2 AVALIAÇÃO DA TERAPIA COM HWJ-MSCS SOBRE O PREJUÍZO FUNCIONAL
DOS ANIMAIS COM AVEH
A avaliação funcional dos animais do grupo AVEh moderado mostrou que
houve prejuízo funcional apenas no EBST no tempo de 8 dias, sem haver diferenças
significativas nos testes do rotarod e do cilindro. Maclellan et al. (2006) haviam
81
testado três diferentes doses de colagenase tipo IV: 0,06 U (grupo brando); 0,12 U
(grupo moderado) e 0,18 U (grupo severo), fazendo uso de uma bateria de testes
funcionais. Diferente do nosso resultado, eles observaram que no conjunto de testes,
os grupos brando e moderado, que usaram doses de colagenase inferior e um pouco
superior ao que usamos no nosso grupo moderado (0,1 U), ocorreram diferenças
significativas em relação ao grupo sham. No entanto, essas diferenças não foram em
todos os tempos, como por exemplo, no teste do cilindro, em que não foi observada
diferença entre o grupo brando e sham no tempo de 3 dias, ou no teste de remoção
de adesivo, no qual a diferença ocorreu apenas nos dias 1 e 3 após lesão, não
havendo prejuízo detectável nos demais tempos. Uma das questões a serem
consideradas é de que o déficit depende da localização da lesão. Assim, danos em
regiões mais laterais do estriado rostral causam prejuízos severos e crônicos na
língua e nos membros anteriores, atingindo o movimento, enquanto danos na região
medial do estriado causam alterações leves ou não crônicas do movimento (PISA e
SCHRANZ, 1988; MACLELLAN et al., 2006). O AVEh muitas vezes também cruza os
limites funcionais, podendo causar danos ao corpo caloso, cápsula interna e estriado,
sendo que uma variedade de déficits pode ocorrer (MACLELLAN et al., 2006).
É possível que no nosso modelo de AVEh moderado, a lesão não tenha
atingido a área que afete de forma mais efetiva o movimento em todos os animais,
causando inclusive uma variabilidade grande de resultados entre eles. Como
mencionado anteriormente, o sangue provavelmente segue um caminho de menor
resistência ao longo dos vasos sanguíneos ou ao longo dos axônios, podendo haver
diferenças inclusive devido ao diferente peso/tamanho dos animais, embora tenhamos
utilizado animais dentro de uma faixa de peso/tamanho neste estudo. Importante
ressaltar que na literatura existem pequenas diferenças nas coordenadas
estereotáxicas utilizadas no modelo de injeção da colagenase, mesmo sendo todas
na região estriatal.
Por outro lado, quando avaliamos o prejuízo funcional do modelo de AVEh
severo, tivemos resultados mais consistentes, sem recuperação funcional dos animais
no EBST e no teste do cilindro em 21 dias de avaliação e com déficits nos tempos de
3 e 7 dias no teste do rotarod. É possível observar nas figuras 20 e 26, referentes ao
modelo severo, que a extensão da lesão foi maior, inclusive em direção à região mais
lateral do estriado. Liu et al. (2018) realizaram um estudo comparativo entre a lesão
82
provocada pela injeção da colagenase nas coordenadas estereotáxicas igual à
utilizada neste trabalho (3,0 mm médio lateral, 0,2 mm anteroposterior, 6,0 mm dorso
ventral) com a injeção em uma coordenada no estriado que se aproximava mais da
cápsula interna (IC) (3,7 mm médio lateral, 2,0 mm anteroposterior, 6,0 mm dorso
ventral). A extensão da lesão no modelo que atingia a cápsula interna foi de + 1,0 a -
3,0 mm em relação ao bregma, no 28º dia após a cirurgia, muito próxima à extensão
da lesão do grupo veículo que obtivemos no AVEh severo, que foi de 2,1 a -3,12 mm
em relação ao bregma no 22º dia após a cirurgia. Para Liu et al. (2018), os resultados
funcionais do teste de escala neurológica e teste do cilindro foram mais permanentes
no grupo IC do que no grupo que recebeu colagenase nas mesmas coordenadas
estereotáxicas do nosso modelo.
Matsushita et al. (2013) fez comparação similar em camundongos.
Primeiramente, mostraram que os animais com volumes de hematoma até 5 mm3
sobreviviam por 4 semanas. Já naqueles animais com volumes de hematomas
maiores, foi demostrando que nos animais em que a lesão não se aproximava tanto
da cápsula interna, a taxa de sobrevivência era de 100%, enquanto naqueles em que
a lesão atingia a cápsula interna, a taxa de sobrevivência caía para aproximadamente
55%. Além disso, a invasão do hematoma na cápsula interna também causou maior
prejuízo funcional nos animais. A lesão na cápsula interna, área que contém as fibras
nervosas dos neurônios motores superiores descendentes e neurônios sensoriais
ascendentes, já foi reconhecida como evento chave na hemiparesia motora após
AVEh (MATSUSHITA et al., 2013).
Quanto à terapia com as hWJ-MSCs, observamos que o grupo tratado 24 h
não foi diferente do grupo sham nos tempos de 4, 15 e 21 dias no teste do cilindro e
sugerindo um melhor resultado no rotarod no último tempo avaliado. Talvez uma
avaliação mais longa pudesse a vir detectar diferenças significativas entre os grupos.
Kim et al.(2015) mostraram que no teste do cilindro o grupo MSCs apresentou melhor
resultado que o grupo controle apenas na 4º semana de tratamento.
Não foi possível avaliar se havia redução na mortalidade dos animais, visto que
os mesmos morrem quase todos nas primeiras 24 h, sendo então que os grupos só
são definidos com os animais sobreviventes. Quanto à terapia na fase hiperaguda,
também não foi detectada diferença funcional ou na mortalidade em relação ao grupo
83
veículo. Huang et al. (2019) mostraram que a injeção de BM-MSCs apenas 30 min
após o AVEh resultou em uma diminuição na assimetria no uso das patas no teste do
cilindro, já no 3º dia após o tratamento. No entanto, a via de administração utilizada foi
a intraventricular, ao invés da sistêmica. Zhang et al. (2015) e Ding et al. (2017)
demonstraram melhora na escala de déficit neurológico 1 dia e 3 dias após o
transplante de células, respectivamente. No entanto, nesses trabalhos a injeção de
células também foi intracerebral, diretamente no local da lesão. Já Wang et al. (2012)
mostraram uma melhora na escala de déficit neurológico após 7 dias de tratamento,
que foi realizado 1 hora após AVEh através de injeção na veia da cauda,
acompanhado de uma aumento da expressão do fator estimulador de colônias
granulocitárias (G-CSF) no tecido cerebral na região do perihematoma, citocina que
estaria associada à redução de edema e assim à melhora da função neurológica. Os
demais trabalhos encontrados que fizeram administração de células em menos de 24
h não realizaram testes funcionais, demonstrando melhoras em outros parâmetros,
como por exemplo, redução de edema, diminuição de citocinas pró-inflamatórias e
aumento nos níveis da proteína zônula-1 da BHE.
7.3 7.3 BIODISTRIBUIÇÃO DAS HWJ-MSCS EM ANIMAIS COM AVEH
Os nossos resultados de biodistribuição demonstraram que as hWJ-MSCs se
dirigem em grande quantidade para os pulmões logo após a injeção (2 h) e
permanecem lá em maior quantidade, assim como nos rins e fígado nas primeiras 24
h. Como o nosso marcador foi o Tc99m, um radioisótopo que possui um tempo de
meia-vida de 6 h, não foi possível realizar o rastreamento em período superior a 24 h.
O primeiro obstáculo para as MSCs que são transplantadas pela via intravenosa é o
leito capilar pulmonar (LEIBACHER e HENSCHLER, 2016). Lee et al. (2009)
demonstraram que a injeção intravenosa de 2 x 106 MSCs de medula óssea humana
(hBM-MSCs) desapareciam da circulação de camundongos naive 5 min após a
injeção. De 2% a 3% das células reapareceram na circulação após um período de
cerca de 10 minutos, aparentemente após a liberação dos pulmões. Após 15 min,
aproximadamente 83% das células estavam nos pulmões, enquanto apenas um
baixíssimo percentual foi identificado em outros tecidos. Após 24 h, apenas metade
das células estavam presas nos pulmões. As células que desapareceram nos
84
pulmões não apareceram em números significativos nos outros seis tecidos
analisados (cérebro, coração, fígado, pâncreas, baço e rim), havendo 0,04% em 48 h
e 0,01% em 96 h nos demais tecidos analisados, diferente do nosso modelo em que
observamos captação das células também nos rins, fígado e baço, inclusive nos
animais naive. Também mostraram que havia um aumento de aproximadamento 40
vezes na transcrição do RNA para a proteína do gene 6 estimulada por TNF (TSG-6,
do inglês TNF-stimulated gene 6 protein), no pulmão de animais naive avaliados 10 h
após a infusão de hBM-MSCs humanas. A TSG-6 é uma proteína conhecida por
apresentar forte ação anti-inflamatória. Quando as células foram injetadas em animais
de modelo de infarto do miocárdio, verificaram que havia esse mesmo aumento da
TSG-6 no pulmão dos animais, sendo que foi verificada uma redução do tamanho do
infarto nos animais que receberam o transplante de células. Nos animais que
receberam células knockdown para o gene de TSG-6, não foi observada melhora na
resposta inflamatória, no tamanho do infarto e nas funções cardíacas dos animais. Os
resultados indicaram que as hBM-MSCs retidas no pulmão eram ativadas para
secretar TSG-6, e que este suprimiu a resposta inflamatória excessiva de forma a
diminuir danos proteolíticos no coração e a cicatriz fibrótica.
Além da possível ativação para secretar TSG-6 no pulmão, outro possível
modo de ação das MSCs seria através da interação delas com as células do sistema
imune. Já foi observada a co-localização de MSCs com macrófagos residentes do
pulmão e que induziram a produção de IL-10 e diminuíram a quantidade de TNF-α e
IL-6 circulantes. As MSCs também parecem inibir a migração de neutrófilos do
sangue para os tecidos (NÉMETH et al., 2009).
Além do pulmão, também observamos uma acentuada captação das hWJ-
MSCs pelo baço 24 h após a injeção das células marcadas. O baço desempenha um
papel importante no turnover dos eritrócitos, na imunidade adaptativa, na produção de
anticorpos e na mobilização de monócitos após lesão tecidual. Igualmente importante
é a resposta aguda à inflamação induzida por trauma, em que o baço inicia a
produção de TNF-α, principalmente por macrófagos residentes, e por sua vez
influencia o recrutamento de células imunes para os tecidos inflamados (BADNER et
al., 2018). Recentemente foi demonstrado por Badner et al. (2018) em modelo de
lesão traumática da medula espinhal que quando MSCs extraídas de cordão umbilical
foram transplantadas por via intravenosa 1 h após a lesão, houve uma redução
85
significativa no volume da lesão, da hemorragia parenquimatosa e um aumento nos
níveis plasmáticos de IL-10, 1 dia após o transplante, quando comparado ao grupo
veículo. Quando o experimento foi repetido na ausência de baço (esplenectomia),
esses efeitos mediados pelas MSCs de cordão umbilical foram perdidos, sugerindo
que o baço é um importante alvo e local dos efeitos das MSCs, quando injetadas
sistemicamente, e que o TNF-α liberado pelo baço teria um importante papel na
ativação das MSCs.
Em relação à migração para os hemisférios cerebrais, apesar da baixa
captação, conseguimos observar que no modelo de AVEh severo, quando comparado
aos grupos AVEh moderado, sham e naive, a migração tem uma preferência pelo
hemisfério lesado. Evidências sugerem que as MSCs migram para órgãos específicos
de maneira semelhante aos leucócitos. Elas aderem às células endoteliais no sistema
vascular e transmigram através do endotélio vascular, direcionando-se para áreas de
lesão seguindo um gradiente de quimiocinas, como o receptor de quimiocina CXCR4,
e o fator derivado de célula estromal 1 (SDF-1) (FABIAN et al., 2017).
Embora o número de células que migre para o hemisfério ipsilateral possa ser
baixo, o resultado pode indicar que a inflamação ativa pode mudar o comportamento
de homing de aprisionar as células em sítios não específicos para um recrutamento
específico (LEIBACHER e HENSCHLER, 2016).
86
8. CONCLUSÕES
Neste trabalho demonstramos que a terapia celular com as hWJ-MSCs reduziu o
volume de lesão no modelo de AVEh moderado, quando comparado ao grupo veículo.
Porém, não conseguimos demonstrar um prejuízo funcional permanente nesses
animais, não tendo sido possível assim avaliar os efeitos benéficos das hWJ-MSCs
nesse modelo. A terapia celular com hWJ-MSCs no modelo de AVEh severo, em 1 h
e 24 h após AVEh, não reduziu o volume de lesão, quando comparado ao grupo
veículo. Foi possível detectar prejuízo funcional permanente no modelo de AVEh
severo nos teste do EBST e no teste do cilindro, porém a terapia celular em 24 h, não
foi capaz de demonstrar efeitos benéficos sobre os déficits funcionais nestes testes
Os resultados obtidos no AVEh severo sugerem que a eficácia da administração
intravenosa de hWJ-MSCs parece depender do volume inicial do hematoma.
Também observamos que a maior parte das hWJ-MSCs migram para pulmão,
rins, fígado e baço nas primeiras 24 h, nos modelos de AVEh moderado e severo, e
nos dois modelos observamos uma maior captação das hWJ-MSCs marcadas com
99m Tc no hemisfério ipsilateral à lesão do que no hemisfério direito, indicando uma
possível migração de hWJ-MSCs em direção à lesão. A presença de um percentual
elevado de hWJ-MSCs nos pulmões e baço, em 24 horas após a injeção das células
marcadas com 99mTc, sugere que haja mecanismos sistêmicos, além de mecanismos
locais, que possam estar envolvidos nos seus efeitos terapêuticos.
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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AN, S. J.; KIM, T. J.; YOON, B. Epidemiology , Risk Factors , and Clinical Features of Intracerebral Hemorrhage: An Update. Journal of Stroke, v. 19, n. 1, p. 3–10, 2017.
ARONOWSKI, J.; ZHAO, X. Molecular pathophysiology of cerebral hemorrhage: Secondary brain injury. Stroke, v. 42, n. 6, p. 1781–1786, 2011.
BADNER, A. et al. Splenic involvement in umbilical cord matrix-derived mesenchymal stromal cell- mediated effects following traumatic spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation, v. 15, n. 219, p. 1–12, 2018.
BARBOSA DA FONSECA, L. M. et al. Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic stroke after intra-arterial injection. Experimental Neurology, v. 221, n. 1, p. 122–128, 2010.
BERAY-BERTHAT, V. et al. Long-term histological and behavioural characterisation of a collagenase-induced model of intracerebral haemorrhage in rats. Journal of Neuroscience Methods, v. 191, n. 2, p. 180–190, 2010.
BLANC, K. LE. Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells. Cytotherapy, v. 5, n. 6, p. 485–489, 2003.
BORLONGAN, C. V.; SANBERG, P. Elevated body swing test: A new behavioral parameter for rats with 6- hydroxydopamine- induced hemiparkinsonism. The Journal of Neuroscience, v. 17, n. 7, p. 5372–5378, 1995.
BRADLEY, G. MR Appearance. Radiology, v. 189, p. 15–26, 1993.
BRIGNIER, A. C.; GEWIRTZ, A. M. Embryonic and adult stem cell therapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 125, n. 2, p. 336–344, 2010.
BRODERICK, J. P. et al. Volume of Intracerebral Hemorrhage A Powerful and Easy-to-Use Predictor of 30-Day Mortality. Stroke, v. 24, p. 987–993, 1993.
CASTRO, L. L. DE et al. Current understanding of the immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells. Journal of Molecular Medicine, v. 97, p. 605–618, 2019.
CHANG, Z. et al. Cell therapy for cerebral hemorrhage: Five year follow-up report. Experimental and Therapeutic Medicine, v. 12, p. 3535–3540, 2016.
CHAVHAN, G. B. et al. Principles, Techniques, and Applications of T2 * - based MR Imaging and Its Special Applications. RadioGraphics, v. 8, n. 62983, p. 1433–1449, 2009.
CHEN, S. et al. An Update on Inflammation in the Acute Phase of Intracerebral Hemorrhage. Translational Stroke Research, v. 6, p. 4–8, 2015.
CHEN, S.; ZENG, L.; HU, Z. Progressing haemorrhagic stroke: categories, causes, mechanisms and managements. Journal of Neurology, p. 1–18, 2014.
CHOI, B. Y. et al. Human Placenta-Derived Mesenchymal Stem Cells Reduce
88
Mortality and Hematoma Size in a Rat Intracerebral Hemorrhage Model in an Acute Phase. Stem Cells International, v. 2018, p. 1–10, 2018.
CHRISTENSEN, M. C.; MAYER, S.; FERRAN, J. Quality of Life After Intracerebral Hemorrhage Results of the Factor Seven for Acute Hemorrhagic Stroke (FAST) Trial. Stroke, v. 40, n. 5, p. 1667–1682, 2009.
CHRISTY, B. A. et al. Procoagulant activity of human mesenchymal stem cells. J Trauma Acute Care Surg, v. 83, n. 1, p. 164–169, 2017.
CORDEIRO, M. F.; HORN, A. P. Stem cell therapy in intracerebral hemorrhage rat model. World Journal of Stem Cells, v. 7, n. 3, p. 618–29, 2015.
COUPLAND, A. P. et al. The definition of stroke. Journal of the Royal Society of Medicine, v. 110, n. 1, p. 9–12, 2017.
CRUZ, F. F. et al. Freshly Thawed and Continuously Cultured Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Comparably Ameliorate Allergic Airways Inflammation in Immunocompetent Mice. Stem Cells Translational Medicine, v. 4, p. 615–624, 2015.
CUI, C. et al. Intraparenchymal treatment with bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium exerts neuroprotection following intracerebral hemorrhage. Molecular Medicine Reports, v. 15, p. 2374–2382, 2017.
DASTUR, C. K.; YU, W. Current management of spontaneous intracerebral haemorrhage. Stroke and Vascular Neurology, v. 2, p. 21–29, 2017.
DATASUS. Estatísticas vitais, Mortalidade - 1996 a 2017, pela CID-10: banco de dados.Disponível em http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?sim/cnv/obt10uf.def. Acesso em: 18/07/19. DE CARVALHO, J. J. F. et al. Stroke epidemiology, patterns of management, and outcomes in Fortaleza, Brazil: A hospital-based multicenter prospective study. Stroke, v. 42, n. 12, p. 3341–3346, 2011.
DEL BIGIO et al. Experimental intracerebral hemorrhage in rats. Stroke, v.27, n.12,p. 2312 – 2320, 1996.
DING, R. et al. Molecules and Cells Therapeutic Benefits of Mesenchymal Stromal Cells in a Rat Model of Hemoglobin-Induced Hypertensive Intracerebral Hemorrhage. Molecules and Cells, v. 40, n. 2, p. 133–142, 2017.
DOMINICI, M. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells . The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, v. 8, n. 4, p. 315–317, 2006.
DRELA, K. et al. Human mesenchymal stem cells in the treatment of neurological diseases. Acta Neurobiologiae Experimentalis, v. 73, p. 38–56, 2013.
DUAN, X. et al. Intracerebral Hemorrhage, Oxidative Stress, and Antioxidant Therapy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2016, p. 1–17, 2016.
DUSCHER, D.; WONG, V. W.; MAAN, N. Stem Cells in Wound Healing : The Future of
89
Regenerative Medicine ? Gerontology, v. 62, p. 216–225, 2015.
FABIAN, C. et al. Distribution pattern following systemic mesenchymal stem cell injection depends on the age of the recipient and neuronal health. Stem Cell Research & Therapy, v. 8, n. 85, p. 1–10, 2017.
FANG, H. et al. CD36-Mediated Hematoma Absorption following Intracerebral Hemorrhage: Negative Regulation by TLR4 Signaling. The Journal of Immunology, v. 192, n. 12, p. 5984–5992, 2014.
FEIGIN, V. L. et al. Update on the Global Burden of Ischemic and Hemorrhagic Stroke in 1990-2013: The GBD 2013 Study. Neuroepidemiology, v. 45, n. 3, p. 161–176, 2015.
FEIGIN, V. L.; NORRVING, B.; MENSAH, G. A. Global Burden of Stroke. p. 439–449, 2017.
GALIPEAU, J., SENSÉBE, L. Perspective Mesenchymal Stromal Cells : Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell, v. 22, n. 6, p. 824–833, 2018.
GAO, L. et al. Stem Cell Therapy: A Promising Therapeutic Method for Intracerebral Hemorrhage. Cell Transplantation, v. 27, n. 12, p. 1809–1824, 2018.
GEORGE, M. J. et al. Clinical Cellular Therapeutics Accelerate Clot Formation. Stem Cells Translational Medicine, v. 7, p. 731–739, 2018.
GIRALDI-GUIMARÃES, A. et al. Treatment with bone marrow mononuclear cells induces functional recovery and decreases neurodegeneration after sensorimotor cortical ischemia in rats. Brain Research, v. 1266, p. 108–120, 2009.
GODOY, M. A. DE et al. Mesenchymal stem cells and cell-derived extracellular vesicles protect hippocampal neurons from oxidative stress and synapse damage induced by amyloid-B oligomers. J. Biol. Chem, v. 293, p. 1957–1975, 2018.
GONG, Q. et al. CD36 Gene Polymorphisms Are Associated with Intracerebral Hemorrhage Susceptibility in a Han Chinese Population. BioMed Research International, v. 2017, p. 1–7, 2017.
HEMPHILL, J. C. et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage: A Guideline for Healthcare Professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke, v. 46, n. 7, p. 2032–2060, 2015.
HU, X. et al. Oxidative Stress in Intracerebral Hemorrhage: Sources , Mechanisms , and Therapeutic Targets. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2016, p. 1–12, 2016.
HUA, Y. et al. Brain injury after intracerebral hemorrhage: The role of thrombin and iron. Stroke, v. 38, n. 2 PART 2, p. 759–762, 2007.
HUANG, P. et al. Safety and Efficacy of Intraventricular Delivery of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Hemorrhagic Stroke Model. Scientific Reports, v. 9, n. 1, p. 1–9, 2019.
90
JENSEN, M. B. et al. Behavioral outcome measures used for human neural stem cell transplantation in rat stroke models. Neurology International, v. 3, p. 35–39, 2011.
JIANG, H.; KIM, H. F. Anatomical Inputs From the Sensory and Value Structures to the Tail of the Rat Striatum. Frontiers in Neuroanatomy, v. 12, n. May, p. 1–17, 2018.
JOHNSON, C.O. Global, regional, and national burden of stroke, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurol., v.18, p.439–58, 2019.
JORDÃO DA SILVA-JUNIOR, A. Investigação dos efeitos e mecanismos moleculares envolvidos na terapia com células mesenquimais estromais humanas em um modelo de lesão no nervo óptico. Tese de Doutorado, p. 207, 2018.
KALASZCZYNSKA, I.; FERDYN, K. Wharton ’ s Jelly Derived Mesenchymal Stem Cells: Future of Regenerative Medicine ? Recent Findings and Clinical Significance. BioMed Research International, v. 2015, p. 1–11, 2015.
KATAN, M.; LUFT, A. Global Burden of Stroke. Seminars in Neurology, v. 38, p. 208–211, 2018.
KEEP, R. F. et al. Vascular disruption and blood – brain barrier dysfunction in intracerebral hemorrhage. Fluids and Barriers Of the CNS, v. 11, p. 1–13, 2014.
KEEP, R. F.; HUA, Y.; XI, G. Intracerebral haemorrhage: Mechanisms of injury and therapeutic targets. The Lancet Neurology, v. 11, n. 8, p. 720–731, 2012.
KIM, K. et al. The Effect of Human Umbilical Cord Blood- Derived Mesenchymal Stem Cells in a Collagenase- Induced Intracerebral Hemorrhage Rat Model. Experimental Neurobiology, v. 24, n. 2, p. 146–155, 2015.
LEIBACHER, J.; HENSCHLER, R. Biodistribution, migration and homing of systemically applied mesenchymal stem / stromal cells. Stem Cell Research & Therapy, v. 7, p. 1–12, 2016.
LIM-HING, K.; RINCON, F. Secondary Hematoma expansion and Perihemorrhagic edema after intracerebral Hemorrhage : From Bench work to Practical Aspects. Frontiers in Neurology, v. 8, n. April, p. 1–12, 2017.
LIU, Y. et al. Characterization of Axon Damage, Neurological Deficits , and Histopathology in Two Experimental Models of Intracerebral Hemorrhage. Frontiers in Neuroscience, v. 12, p. 1–15, 2018.
LO SICCO ET AL. Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles as Mediators of Anti-Inflammatory Effects: Endorsement of Macrophage Polarization. Stem Cells Translational Medicine, v. 6, p. 1018–1028, 2017.
LOS, M. J.; SKUBIS, A.; GHAVAMI, S. Stem Cells. In: LOS, M.; HUDECKI, A.; WIECHEC, E. (Eds.). . Stem Cells and Biomaterials for Regenerative Medicine. 1. ed. [s.l.] Elsevier Inc., 2019. p. 5–16.
MA, X. et al. Stem cell-based therapies for intracerebral hemorrhage in animal model: a meta-analysis. Neurol Sci, p. 1311–1317, 2015.
91
MACLELLAN, C. L. et al. Gauging recovery after hemorrhagic stroke in rats : implications for cytoprotection studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, v. 26, p. 1031–1042, 2006.
MACLELLAN, C. L. et al. Intracerebral hemorrhage models in rat : comparing collagenase to blood infusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, v. 28, p. 516–525, 2008.
MANAENKO, A. et al. Comparison of Different Preclinical Models of Intracerebral Hemorrhage. Acta Neurochir Suppl., v. 111, p. 9–14, 2013.
MATSUSHITA, H. et al. MRI-Based Analysis of Intracerebral Hemorrhage in Mice Reveals Relationship between Hematoma Expansion and the Severity of Symptoms. Plos, v. 8, n. 7, p. 1–9, 2013.
MAZZOLA, A. A. Ressonância magnética: princípios de formação da imagem e aplicações em imagem funcional. Revista Brasileira de Física Médica, v. 3, n. 1, p. 117–129, 2009.
MESENTIER-LOURO, L. A. et al. Distribution of Mesenchymal Stem Cells and Effects on Neuronal Survival and Axon Regeneration after Optic Nerve Crush and Cell Therapy. PLoS ONE, v. 9, n. 10, p. e110722, 2014.
MESENTIER-LOURO, L. A. et al. Bone Marrow-Derived Cells as a Therapeutic Approach to Optic Nerve Diseases. Stem Cells International, v. 2016, p. 1–16, 2016.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância de Doenças e Agravos não Transmissíveis e Promoção da Saúde. Saúde Brasil 2018 uma análise de situação de saúde e das doenças e agravos crônicos: desafios e perspectivas/Ministério da Saúde. Brasília: Ministério da Saúde, 2019. 424 p.
MRACSKO, E.; VELTKAMP, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience, v. 8, n. November, p. 388, 2014.
NÉMETH, K. et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E2—dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine, v. 15, n. 1, p. 42–49, 2009.
OPPLIGER, B. et al. Intranasal Delivery of Umbilical Cord - derived Mesenchymal Stem Cells Preserves Myelination in Perinatal Brain Damage. Stem cells and development, v. 25, n. 16, p. 1–34, 2016.
PALADINO, F. V. et al. Review Article The Immunomodulatory Potential of Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem / Stromal Cells. Stem Cells International, v. 2019, p. 1–7, 2019.
PISA, M.; SCHRANZ, J. A. Dissociable Motor Roles of the Rat ’ s Striatum Conform to a Somatotopic Model. BMC Neuroscienceehavioral, v. 102, n. 3, p. 429–440, 1988.
ROSADO-DE-CASTRO, P. H. et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative Medicine, v. 8, n. 2, p. 145–155, 2013.
92
ROSADO-DE-CASTRO, P. H. et al. Review of Preclinical and Clinical Studies of Bone Marrow-Derived Cell Therapies for Intracerebral Hemorrhage. Stem Cells International, v. 2016, p. 1–18, 2016.
ROSENBERG, G. A et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke, v. 21, n. 5, p. 801–807, 1990.
SACCO, R. L. et al. AHA/ASA Expert Consensus Document An Updated Definition of Stroke for the 21st Century. Stroke, v. 44, n. 7, p. 2064–2089, 2013.
SALIHOVIC, D.; SMAJLOVI; IBRAHIMAGI, O. Does the Volume and Localization of Intracerebral Hematoma Affect Short-Term Prognosis of Patients with Intracerebral Hemorrhage? ISRN Neuroscience, v. 2013, n. March 2008, p. 10–13, 2013.
SANADA, C. et al. Mesenchymal Stem Cells Contribute to Endogenous FVIII: c Production. Cellular Physiology, v. 228, p. 1010–1016, 2012.
SANBERG, P. R. et al. Neurological disorders and the potential role for stem cells as a therapy. British Medical Bulletin, v. 101, p. 163–181, 2012.
SATANI, N. et al. World-Wide Efficacy of Bone Marrow Derived Mesenchymal Stromal Cells in Preclinical Ischemic Stroke Models: Systematic Review and. Frontiers in Neurology, v. 10, n. April, 2019.
SCHAAR, K. L.; BRENNEMAN, M. M.; SAVITZ, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Experimental & Translational Stroke Medicine, v. 2, n. 13, p. 1–11, 2010.
SCHALLERT, T. et al. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology, v. 39, p. 777–787, 2000.
SCHALLERT, T. Behavioral Tests for Preclinical Intervention Assessment. The American Society for Experimental NeuroTherapeutics, v. 3, n. October, p. 497–504, 2006.
SEGHATOLESLAM, M. et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood-mononuclear cells dose-dependently relieve neurologic deficits in rat intracerebral hemorrhage model. Annals of Anatomy, v. 195, n. 1, p. 39–49, 2013.
SHIRJANG, S. et al. Toll-like receptors as a key regulator of mesenchymal stem cell function : An up-to-date review. Cellular Immunology, v. 315, p. 1–10, 2017.
SUBRAMANIAN, A. et al. Comparative Characterization of Cells from the Various Compartments of the Human Umbilical Cord Shows that the Wharton’s Jelly Compartment Provides the Best Source of Clinically Utilizable Mesenchymal Stem. PLoS ONE, v. 10, n. 6, p. 1–25, 2015.
TAGHIZADEH, R. R.; CETRULO, K. J.; CETRULO, C. L. Wharton’s Jelly stem cells: Future clinical applications. Placenta, v. 32, n. SUPPL. 4, p. 311–315, 2011.
TAKAHASHI, K.; YAMANAKA, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, v. 126, n.4, p.663 -
673, 2006.
93
TSANG, K. S. et al. Phase Ⅰ/Ⅱ randomized controlled trial of autologous bone
marrow-derived mesenchymal stem cell therapy for chronic stroke. World Journal of Stem Cells, v. 9, n. 8, p. 133–143, 2017.
TSE, W. T. et al. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation. Transplantantion, v. 172, n. 5, p. 389–397, 2003.
TODESCATTO, T. Ressonância Magnética. Clube dos Editores, 2016 (ebook)
TURNBULL, M. T. et al. Mesenchymal stem cells for hemorrhagic stroke : status of preclinical and clinical research. Regenerative Medicine, v. 4, n. 10, p. 1–10, 2019.
UCCELLI, A.; MORETTA, L.; PISTOIA, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol, v. 8, n. 9, p. 726–736, 2008.
VAN ASCH, C. J. et al. Incidence, case fatality, and functional outcome of intracerebral haemorrhage over time, according to age, sex, and ethnic origin: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology, v. 9, n. 2, p. 167–176, 2010.
VASCONCELOS-DOS-SANTOS, A. Terapia com células de medula óssea em modelo de acidente vascular encefálico isquêmico. [s.l: s.n.].
VASCONCELOS-DOS-SANTOS, A. et al. Intravenous and intra-arterial administration of bone marrow mononuclear cells after focal cerebral ischemia: Is there a difference in biodistribution and efficacy? Stem Cell Research, v. 9, n. 1, p. 1–8, 2012.
VASCONCELOS-DOS-SANTOS, A. DE et al. Therapeutic window for treatment of cortical ischemia with bone marrow-derived cells in rats. Brain Research, v. 1306, p. 149–158, 2010.
WANG, J. Preclinical and clinical research on inflammation after intracerebral hemorrhage. Inflammation, v. 92, n. 4, p. 463–477, 2010.
WANG, J.; DORÉ, S. Inflammation after intracerebral hemorrhage. Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism, v. 27, n. 5, p. 894–908, 2007a.
WANG, J.; DORÉ, S. Heme oxygenase-1 exacerbates early brain injury after intracerebral haemorrhage. Brain, v. 130, n. 6, p. 1643–1652, 2007b.
WANG, S. et al. Excess Integrins Cause Lung Entrapment of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells, v. 33, p. 3315–3326, 2015.
WANG, S. P. et al. Therapeutic effect of mesenchymal stem cells in rats with intracerebral hemorrhage: Reduced apoptosis and enhanced neuroprotection. Molecular Medicine Reports, v. 6, n. 4, p. 848–854, 2012.
WATSON, N. et al. Discarded Wharton jelly of the human umbilical cord: A viable
94
source for mesenchymal stromal cells. Cytotherapy, v. 17, n. 1, p. 18–24, 2015.
WILSON, A. et al. Multiplicity of Mesenchymal Stromal Cells: Finding the Right Route to Therapy. Frontiers in Immunology, v. 10, p. 1–8, 2019.
XI, G.; KEEP, R. F.; HOFF, J. T. Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage. The Lancet. Neurology, v. 5, n. 1, p. 53–63, 2006.
XIE, J. et al. Intracerebral and Intravenous Transplantation Represents a Favorable Approach for Application of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stromal Cells in Intracerebral Hemorrhage Rats. Medical Science Monitor, v. 22, p. 3552–3561, 2016.
ZHANG, Q. et al. Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation combined with minimally invasive hematoma aspiration on intracerebral hemorrhage in rats. Am J Transl Res, v. 7, n. 11, p. 2176–2186, 2015.
ZHAO, X. et al. Hematoma Resolution as a Therapeutic Target The Role of Microglia/Macrophages. Stroke, v. 40, n. 3, p. 92–94, 2009.