Post on 06-Nov-2015
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Universidade Federal de PelotasFaculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Programa de Ps-Graduao em AgronomiaCENTRO DE GENOMICA E FITOMELHORAMENTO
IntroduoIntroduo BioinformticaBioinformtica
Professores:Luciano MaiaAntonio Costa de Oliveira
id4525199 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
DesenhoDesenho de de oligosoligos
DesenhoDesenho de de primersprimers
Primer designPrimer designou
ou
Luciano Maia
DesenhoDesenho de de primersprimers
DesenhoDesenho de de iniciadoresiniciadoresou
Qual a importncia do desenho de primers na biologia molecular??
?
?
Borer et al. (1974) Stability of ribonucleic acid double-stranded helices.J Mol Biol. 15;86(4):843-53.
Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
Entalpia (H) : Energia contida num sistema
Energia livre (G) : a energia til para realizar o trabalho para se obter tal sistema-chama energia livre de Gibbs.
Entropia (S):
Lembrando.termodinamica
Entropia (S): diferena entre H e G
Depende da complexidade do sistemaMaior complexidade = menor entropiaMenor complexidade = maior entropia
....desordem
H2 + Cl2 => 2 HCl + 184,9 kJ
H = -184,9 kJ
( TC, 1 atm) (25C, 1 atm)
Exotrmica
Lembrando.termodinamica
H2 + I2 + 51,8 kJ => 2 HI
H = +51,8 k
ExotrmicaAbsorve energia
EndotrmicaLibera energia
Lembrando.termodinamica
Reao exotrmica: reao qumica que libera calorenergia final dos produtos menor que a energia inicial dos reagentesDisso se conclui que a variao de energia negativa.Exemplo: COMBUSTIVEIS
Lembrando.termodinamica
Reao Endotrmica: reao qumica que absorve calora energia final dos produtos maior que a energia inicial dos reagentes Desta forma a variao de energia positiva
H2(g) + O2(g) = H2OEnergia liberada pela reao: H
H = - 68,3 kcal/mol
Energia gasta na organizao: S S = - 11,6 kcal/mol
Energia livre (G) - Saldo de energia (energia til para realizar trabalho):
Lembrando.termodinamica
G = H T . S G = - 68,300 + 11,6G = - 56,6 kcal/mol
G = espontnea a reao H
G = espontnea a reao H S (entropia desordem)
Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
De 25 para 37C
Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
De 25 para 37C
Breslauer et al. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83(11): 37463750.
De 25 para 37C
OBTENO DE PRIMERS
...
BASEADO NAS PROPRIEDADES TERMODINAMICAS DAS CADEIAS DE NUCLEOTIDEOS, SAL E TEMPERATURAS
R = 1.987 (cal/C mol) is the molar gas constant, = 50 109 concentration of the primer in its solutionT0 = 273.15 Ct = 21.6 C is an empirical temperature correction.
t may depend to ion concentration
OBTENO DE PRIMERS
OBTENO DE PRIMERS
Figure 2. The stability of a 25 base (CTG GTC TGG ATC TGA GAA CTT CAG G) varies with K+and Mg2+ concentrations. Competitive binding of ions to DNA is observed.
Regras simples para desenho de primersRegras simples para desenho de primers
Tm vs TaDEFINIES...GENERALIZAES...
Temperature melting
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
Temperatura de anelamento.empirico.experimental
Ta = Tm 3 CTa = Tm 5 C ??!!
Devero ter entre 17-28 bases de tamanhodepende basicamente da TM e especifidade
A composio dever ter entre 40-60% de G+C (conteudo GC)exceto regies de final de UTR 3
Se possvel, a posio 3' terminar com G, C, CG ou GC:aumenta a estabilidade do emparelhamento
Regras simples para desenho de primersRegras simples para desenho de primers
TMs devero ser entre 55-65C
Se possvel, evitar que a 3 seja complementar ao 5para no formarem Loop
Se possvel, no deve haver complementaridade para no formar hairpin
Tm Primer length
G/C content GC clamp
Self-Complementary
GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC
GGCGG T A TA GTT ACCGCC G
C T AT
1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.
2)Self Dimer : Dmero de primers senso2)Self Dimer : Dmero de primers senso
3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso
Self-Complementary
GGCGGT ATG ATCCCGCTA GTT AC
GGCGG T A TA GTT ACCGCC G
C T AT
G: a energia requerida para quebrar a estrutura secundria.Valores de G muito negativos indicam grampos estveis e indesejados
3end Hairpin: G -2 kcal/molInternal hairpin: G -3 kcal/mol
1)Hairpins : formado por interaes dentro do primer.
3end Self Dimer: G -5 kcal/molInternal Self Dimer: G -6 kcal/mol
3end Crossf Dimer: G -5 kcal/molInternal Cross Dimer: G -6 kcal/mol
2)Self Dimer : Dmero de primers senso
3)Cross Dimer: Dmero de primers antisenso
>seqncia_exemploATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCATCGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGAGGATTTGGGCGAGGDGATATCGGAGGGCGGGA
Viso geral do desenho Viso geral do desenho de de primerprimer
GGDGATATCGGAGGGCGGGA
>sequenciaexemplo
REGIO AMPLIFICADA
PRIMER FOWARD PRIMER REVERSE
Desenho de primersDesenho de primers
PROGRAMAS ON-LINE http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Padro ouro
Facilidade de usoDisponibilidade on line
ROZEN, S.; SKALETSKY, H. Primer3 on the WWW for general users and forbiologist programmers. Methods in molecular biology, v.132, p.365-386, 2000.
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
PROGRAMAS ON-LINE (2)http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
1) Localizar sequencia
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
2) Identificar posicoes alvo na sequencia, onde o primer dever flanquear
start stop Accession Locus O1815258 1818561 NM_001063247.11815258 1815581 exon + CDS 324 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1816286 1816530 exon + CDS 245 bp1816531 1816611 intron + 81 bp1816612 1816765 exon + CDS 154 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1817043 1817257 exon + CDS 215 bp1817258 1817350 intron + 93 bp1817351 1817468 exon + CDS 118 bp1817469 1817684 intron + 216 bp1817685 1817895 exon + CDS 211 bp1817896 1818132 intron + 237 bp1818133 1818194 exon + CDS 62 bp1818195 1818305 intron + 111 bp1818306 1818524 exon + CDS 219 bp1818525 1818561 exon + UTR 37 bp
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
>gi|115466225:1-1585 Oryza sativa (japonica cultivar-group) Os06g0133900 (Os06g0133900) mRNA, complete cdsATGGCGGCGACCATGGCGTCCAACGCCGCGGCTGCGGCGGCGGTGTCCCTGGACCAGGCCGTGGCGGCGT CGGCGGCGTTCTCGTCGCGGAAGCAGCTGCGGCTGCCCGCCGCGGCGCGCGGGGGGATGCGGGTGCGGGT GCGGGCGCGGGGGCGGCGGGAGGCGGTGGTGGTGGCGTCCGCGTCGTCGTCGTCGGTGGCAGCGCCGGCG GCGAAGGCGGAGGAGATCGTGCTCCAGCCCATCAGGGAGATCTCCGGGGCGGTTCAGCTGCCAGGGTCCA AGTCGCTCTCCAACAGGATCCTCCTCCTCTCCGCCCTCTCCGAGGGCACAACAGTGGTGGACAACTTGCT GAACAGTGAGGATGTTCACTACATGCTTGAGGCCCTGAAAGCCCTCGGGCTCTCTGTGGAAGCAGATAAA GTTGCAAAAAGAGCTGTAGTCGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTTCCTGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAAG TGCAACTCTTCTTGGGGAACGCTGGAACTGCAATGCGACCATTGACAGCAGCCGTGACTGCTGCTGGTGG AAATGCAACTTATGTGCTTGATGGAGTGCCACGAATGAGGGAGAGACCGATTGGTGACTTGGTTGTCGGG TTGAAACAACTTGGTGCGGATGTCGACTGTTTCCTTGGCACTGAATGCCCACCTGTTCGTGTCAAGGGAA TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT
3) Sequencia
TTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCT GATGGCTGCTCCTTTGGCCCTTGGGGATGTGGAGATCGAAATCATTGACAAACTAATCTCCATTCCTTAC GTTGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAGGCAGAGCATTCTGATAGTTGGGACAGAT TCTATATTAAGGGAGGGCAGAAGTACAAATCTCCTGGAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGC GAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATCACTGGAGGCACTGTGACAGTTCAAGGTTGTGGTACGACCAGT TTGCAGGGTGATGTCAAATTTGCTGAGGTACTTGAGATGATGGGAGCAAAGGTTACATGGACTGACACCA GTGTAACCGTAACTGGTCCACCACGTGAGCCTTATGGGAAGAAACACCTGAAAGCTGTTGATGTCAACAT GAACAAAATGCCTGATGTTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTGCACTCTTCGCTGATGGTCCAACTGCTATC AGAGATGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAAACCGAAAGGATGGTTGCAATTCGGACCGAGCTAACAAAGC TGGGAGCATCGGTTGAAGAAGGTCCTGACTACTGCATCATCACCCCACCGGAGAAGCTGAACATCACGGC AATCGACACCTACGATGATCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTCGCTGCCTGCGCCGACGTGCCCGTG ACGATCAGGGACCCTGGTTGCACCCGCAAGACCTTCCCCAACTACTTCGACGTTCTAAGCACTTTCGTCA GGAACTGAACTGAGCTTTTAAAAGAGTGAGGTCTAGGTTCTGTTG
A) Sem especificar uma regio alvoA) Sem especificar uma regio alvo
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
4) Inserir (copiar/colar) sequencia na pagina do Primer3
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
5) Configurar informaes/restries para o Primer3
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
6) Resultado (Parte 1)
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
6) Resultado (Parte 2)
B) Especificar uma regio alvoB) Especificar uma regio alvo
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
start stop Accession Locus O1815258 1818561 NM_001063247.11815258 1815581 exon + CDS 324 bp1815582 1816285 intron + 704 bp1816286 1816530 exon + CDS 245 bp1816531 1816611 intron + 81 bp1816612 1816765 exon + CDS 154 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1816766 1817042 intron + 277 bp1817043 1817257 exon + CDS 215 bp1817258 1817350 intron + 93 bp1817351 1817468 exon + CDS 118 bp1817469 1817684 intron + 216 bp1817685 1817895 exon + CDS 211 bp1817896 1818132 intron + 237 bp1818133 1818194 exon + CDS 62 bp1818195 1818305 intron + 111 bp1818306 1818524 exon + CDS 219 bp1818525 1818561 exon + UTR 37 bp
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
1) Especificando uma regio
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
2) Resultado (Parte 1)
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
2) Resultado (Parte 2)
Desenho de primers Desenho de primers Exemplo como usar Exemplo como usar Primer3Primer3
Especificando uma regiao para ser flanqueada
Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
2) Resultado (Parte 3)
Desenho de primersDesenho de primers
PROGRAMAS stand-alone
Vector NTI
Facilidade de usoDisponibilidade programa livre
Desenho de primersDesenho de primers
Vector NTI
1) Obter sequencia gravar em arquivo fasta
Desenho de primersDesenho de primers
Vector NTI
2) Abrir arquivo fasta contendo no Vector
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
3) Interface do arquivo carregado no VectorNTI
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
4) Selecao de uma regiao para o desenho de primers
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
5) Menu para localizao de Primers
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
6) Menu para localizao de Primers
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
7) Resultados (1)
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
7) Resultados (2)
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
7) Resultados (3)
Selecionando uma regiao para localizar primers no Vector
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI
1) Marcar regiao Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI1) Marcar regiao Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
Desenho de primers Desenho de primers -- VectorNTIVectorNTI2) Resultado Start = 324 End = 324 + 704 = 1.028
?????
lucianoc.maia@gmail.com