Post on 08-Jan-2017
VirologiaFonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-2&user_login=HugoSousa1
Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Detecção do genoma viral
Futuro do diagnóstico de vírus
Necessidade de equipamento e pessoal treinado
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2
TÉCNICAS
Métodos de Amplificação Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação
Métodos de Hibridização Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 3
Extração de Ácidos Nucléicos
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
4
Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Lise alcalina; Neutralização; Precipitação de Proteínas e detritos celulares; Purificação Ácidos Nucleicos
Precipitação Eluição em colunas
5
Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 6
Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 7
Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Add DNase
Add RNase
+ DNase (protein)
+ RNase (protein)
Utilização Nucleases Remoção DNA Remoção RNA
8
Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Avaliação Ácidos Nucléicos por Espectofotometria UV
Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)
9
Técnicas de Amplificação AN
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
10
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 11
Amplifica um fragmento de DNA especifico;
Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de cópias do fragmento pretendido;
Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de sequência conhecida;
Região Alvo
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 12
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
MISTURA DE REAÇÃO:
DNA
Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples com sequência complementar às sequências alvo do DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos);
Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;
Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleotídeos e estabilidade da Taq;
dNTPs: Nucleotideos livres (A, T, C, G);
Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC) que efetua a cópia da sequência alvo do DNA.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 13
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
PROCEDIMENTO
1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC);
2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC);
3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC);
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ATCCGAT (…) – 5’
5’ – (…) ATGCGTA
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 14
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
PROCEDIMENTO
4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;
FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 15
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Electroforese em Gel de Agarose:
Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu peso molecular;
DNA e RNA possuem carga elétrica negativa migram para o pólo positivo (quanto mais pequenas mais migram);
Brometo de Etídeo: corante fluorescente que se vai intercalar na dupla hélice de DNA e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV; ( cuidado=> carcinógeno!)
Amostras da PCR carregadas no gel;
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 16
17
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Pólo Positivo (+)
Pólo Negativo (-)
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Polymerase Chain Reaction
APLICAÇÕES
Detecção de sequências específicas de DNA viral Detecção AdV em amostras respiratórias Detecção EBV em biópsias Nasofaringe Detecção JCV em LCR ...
DESVANTAGENS Altamente sensível à contaminação com quantidades residuais de DNA. Falsos positivos e artefatos.
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 18
RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 19
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)
Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’3’ – (…) TGACT (…) – 5’
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 20
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 21
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 22
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 23
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com patologias Detecção variantes EBV – Associação com agressividade ...
DESVANTAGENS Todas as do PCR Sensível a contaminação por DNAses Artefactos
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 24
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos/mutações;
Diferenças de sequência de um único nucleotídeo são suficientes para que cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional diferente;
Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia simples/desnaturadas) em função da sua conformação.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 25
26
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com agressividade ...
DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Leitura gel poliacrilamida
Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 28
Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de expressão de mRNA;
Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;
Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA;
Molécula Alvo
mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’TTTTTTTTTT – 5’
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 29
Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 30
Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
VANTAGENS
Permite fazer análise quantitativa da expressão de mRNA.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31
Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
APLICAÇÕES
Expressão mRNA viral Avaliação da replicação viral
DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 33
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels
Limitations of end-point PCR: Poor precision Low sensitivity Short dynamic range Low resolution Size-based discrimination Ethidium bromide for staining does not allow
for accurate quantitation Requires post-PCR processing
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 34
35
Monitora a fluorescência emitida durante a reação de PCR como um indicador da produções de amplicons em cada ciclo de PCR;
Monitorização em tempo real;
Detecção da amplificação nos estádios precoces da reação – maior precisão;
Alvo: DNA ou RNA
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
36
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 37
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 38
39
PCR phases in linear view
Cycle #
[DNA]
ExponentialIf 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise
LinearHigh variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade.
PlateauEnd-point analysis. The reaction has stopped and if left for long – degradation of PCR products.
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Exponential
Linear
Plateau
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
40
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument.Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically
CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold
Rn – (Rn-baseline)NTC – no template controlDRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
41
CT = threshold cycle
Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual é detectado sinal
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Real Time PCR
Aplicações Quantificação carga viral Monitoração carga viral Monitoração terapêutica
VANTAGENS Amplificação monitorizada em tempo real Ausência de processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação) Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA) Rápido, específico, sensível e reprodutível Quantitativo Barato
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42
Sequenciação Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 43
Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Usada para determinar a sequência de nucleotídeos
Método de sequenciamento mais utilizado – método dideoxi
Adição de dideoxinucleotideos que terminam a reação de polimerização
3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44
45
Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 46
Técnicas de HibridizaçãoAula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
47
48
Alvo – DNA ou RNA
Utilização de sondas específicas
Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus
Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS
Técnicas de Hibridização
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 49
Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Principio da técnica Hibridização de Ácidos Nucleicos Amplificação sinal por Quimioluminescência Método semi-quantitativo
Método Hibridização amostras positivas com sondas específicas Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca Reação com anticorpo secundário conjugado com FA Adição de reagente e detecção por quimioluminescência
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50
Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
45 minutesat 65ºC
60 minutesat 65ºC
60 minutesagitação
30 minutes
15 minutes
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51
Southern Blot Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 52
Southern Blot Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 53
Hibridização em tiras Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 54
55
Hibridização em tiras
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Chips Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 56
57
Chips
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV
Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo
58
Chips
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Professor Mark Pallen
We ask the lab for a diagnosis, expecting a yes or no, but often end up
with just a maybe…
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 59
VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II