MICROBIOLOGIA GERALProfa. Lúcia Schuch Boeira

GENÉTICA MICROBIANA1. Estrutura e função do material genético

Genótipo e Fenótipo DNA e Cromossomos

2. O Fluxo da Informação Genética Replicação do DNA RNA e Síntese Protéica

3. A Regulação da Expressão Gênica Bacteriana Repressão e Indução O Modelo Operon de Expressão Gênica

4. Mutação: Alteração no Material Genético A Frequência de Mutação Identificando Mutantes Identificando Carcinógenos Químicos

5. Transferência Genética e Recombinação Transformação em Bactérias Conjugação em Bactérias Transdução em Bactérias Plasmídeos e Transposons Genes e Evolução

GENÉTICA MICROBIANA

BIOTECNOLOGIA E DNA RECOMBINANTE

6. Tecnologia de DNA Recombinante– Visão Geral da Metodologia do DNA Recombinante– Ferramentas de Biotecnologia

• Seleção• Mutação• Enzimas de Restrição• Vetores• Reação em Cadeia da Polimerase

7. Técnicas de Engenharia Genética– Introdução de DNA Exógeno nas Células– Obtendo DNA– Selecionando um Clone– Fazendo um Produto Gênico

ENGENHARIA GENÉTICA, TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE, MANIPULAÇÃO GÊNICA

O que é ? é o termo utilizado para descrever algumas técnicas modernas que

estão revolucionando o campo da Biotecnologia. consiste num conjunto de técnicas e ferramentas que permite

identificar, isolar, manipular e multiplicar os genes de organismos vivos.

Estas técnicas incluem: a cultura de células, o uso de isótopos radioativos, a clonagem molecular, o aperfeiçoamento das técnicas de obtenção, purificação e manipulação

de enzimas.

TECHNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE • Refere-se a manipulação artificial de genes

• Objetivo:• introduzir novas características ou atributos fisiológicos ou

físicos em seres vivos, como por exemplo:– Tornar uma planta resistente a um herbicida

– Produção de insulina por bactérias

• Um gene de um animal vertebrado, inclusive do homem, pode ser inserido no DNA de uma bactéria , o receptor pode expressar o gene e codificar um produto comercialmente útil

TECHNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Refere-se a manipulação artificial de genes

Utiliza várias ferramentas e técnicas

FERRAMENTAS Enzimas de restrição:

Corta fragmentos de DNA em locais específicos

Ligase: Unir os fragmentos de DNA

Vetores: “Veículo” de transporte de DNA exógeno para um organismo

hospedeiro

Reação da Cadeia da Polimerase (PCR) Processo que faz várias cópias de um fragmento de DNA

Gel eletroforese Processo onde fragmentos de DNA são classificados de acordo

com o tamanho

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO É uma das ferramentas essenciais em engenharia genética

Apresentam a habilidade de cortar moléculas de DNA em sequências bastante precisas de 4 a 8 pares de bases Sítios de restrição

Utilizando um “kit” com mais de 400 enzimas de restrição que reconhecem cerca de 100 sítios de restrição os geneticitas são capazes de: Isolar DNA Sequenciar DNA Manipular gene individuais

Ferramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Ferramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Ferramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO• Quando uma enzima de restrição digere o DNA, ela produz

um corte em cada fita, podendo resultar em:– extremidades colantes ou adesivas

– extremidades cegas: sem bases despareadas.

• Cada vez que elas encontram um sítio de restrição que lhes é próprio, clivam o sítio.

Ferramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

A enzima HaeIII reconhece uma sequência de 4 nucleótidos e produz cortes simétricos ("blunt").

A enzima BamHI reconhece uma sequência de 6 nucleótidos e origina cortes assimétricos e coesivos (“sticky”).

Ferramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

1. A enzima de restrição corta a molécula de DNA de fita dupla nos sítios de restrição específicos

2. Os cortes produzem um fragmento de DNA com duas extremidades adesivas

3. Quando dois fragmentos de DNA cortados pela mesma enzima de restrição são colocados juntos, eles podem se unir pelo pareamento de bases

Ferramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃOFerramentas

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

• Tesouras moleculares

• Cortam DNA em sequências específicas– Reconhece e cliva, ou digere, somente uma

determinada sequencia de bases nucleotídicas no DNA

Ferramentas

LIGAÇÃO

• Fragmentos de DNA produzidos pelas enzimas de restrição podem ser unidos pelo processo de ligação

– Os pedaços são unidos por uma enzima denominada DNA ligase

• DNA de origens diferentes produzidos desta maneira é chamado de DNA recombinante

– DNA combinado de origens diferentes

• A utilização das ferramentas enzimas de restrição e ligação combinadas são técnicas básicas da engenharia genética.

Ferramentas

LIGAÇÃO

1. Dois pedaços de DNA são cortados usando a mesma enzima de restrição

Ferramentas

VETORES

• “Veículo” de transporte de DNA exógeno para um organismo hospedeiro

• Existe um grande número de tipos diferentes de moleculas de DNA que podem ser utilizadas como vetores

– Exemplo: plasmídeo, vírus, etc.

• A escolha de um vetor adequado depende de muitos fatores, como– Organismo que receberá o novo gene– Tamanho do DNA a ser clonado

• A inserção de um fragmento de DNA num vetor implica a utilização de enzimas de restrição e ligases.

Ferramentas

VETORES

Propriedade mais importante Auto-replicação

Uma vez no interior de uma célula, um vetor deve ser capaz de replicar-se

Tamanho que permita que eles sejam manipulados fora da célula, durante o processo de construção do DNA recombinante

Gene marcador para seleção (antibiótico, genes de proteínas fluorescentes, marcadores metabólicos ou auxotróficos)

Quando é necessário recuperar células contendo o vetor, a presença de um gene marcador no vetor pode muitas vezes facilitar o processo de seleção. Genes marcadores mais comuns: Genes para resistência a antibióticos Genes para enzimas que realizam reações facilmente identificáveis

Ferramentas

VETOR - PLASMÍDEO Ferramentas

VETOR - PLASMÍDEO Ferramentas

Esquema para a obtenção de plasmídeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima de restrição que cria extremidades coesivas.

Ao menos 5 produtos distintos podem ser formados a partir

desta mistura.

VETOR - PLASMÍDEO Ferramentas

O produto 1 é o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado no plasmídeo (vermelho).

O produto 2 é o mais danoso ao processo, pois se trata do plasmídeo vazio, fechado sem inserto. Ele é perfeitamente funcional e não pode ser descartado do processo.

O produto 3 é a circularização de vários fragmentos de DNA do doador, numa ordem qualquer. Este "lixo" não é problemático, porque não contém uma origem de replicação bacteriana. É um DNA que será perdido ao longo do tempo.

O produto 4 é a união de dois (ou mais) plasmídeos e não se replica tão rápido quando o plasmídeo vazio ou carregado com apenas um inserto, de forma que acaba desaparecendo ao longo do tempo. O último "lixo" é o plasmídeo carregado com vários insertos catenados (ligados em cadeia) ou com um inserto muito grande. É uma construção instável, também, e tende a desaparecer.

REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Amplificação de DNA

Vários procedimentos na tecnologia do DNA exigem uma grande quantidade de DNA, como:Sequenciamento de DNADNA fingerprintingClonagem de gene

Ferramentas

REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Pequenas amostras de DNA podem ser rapidamente amplificadas

Iniciando com somente um fragmento de DNA, a PCR pode ser utilizada para produzir literalmente bilhões de cópias em poucas horas

Ferramentas

PROCESSO - PCR

1. Amostra de DNA - chamada de DNA alvo

2. DNA é desnaturado (separado) pelo aquecimento a 98ºC por 5 min

3. Primer é ligado a fita de DNA

4. A amostra é resfriada a 60ºC. A enzima DNA polimerase se liga a cada uma das fitas de DNA expostos. Esta enzima sintetisa a fita complementar de DNA utilizando nucleotídeos livres.

5. Após um ciclo, existem duas cópias da amostra original

Ferramentas

PROCESSO - PCR Termociclador

Pode ser ajustado para temperatura, tempo e número de ciclos desejados

Ferramentas

PASSOS NO PROCESSO PCR

Passo 1: separar as fitas de DNA Aquecimento a 98ºC por 5 min

Passo 2: adicionar a mistura de reação Primers, nucleotídeos e a enzima DNA polimerase

Passo 3: incubação Resfriar a 60ºC e incubar por alguns minutes. Durante

este tempo, os primers se unem as fita simples de DNA. DNA polimerase sintetiza a fita complementar

Repetir várias vezes (cerca de 25 ciclos)Repetir o ciclo (aquecer e resfriar) até que cópias suficientes de DNA tenham sido produzidas

Ferramentas

REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Ciclos PCR

Nº de fitas de DNA

1 2

2 4

3 8

10 1.024

12 4.096

16 65.536

18 262.144

20 1.048.536

25 33.554.432

Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação.

Ferramentas

ELETROFORESE

Já conhecida desde 1930 Difundida em 1950-1960

Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida

Separa proteínas por cargas e peso molecular

Separa ácido nucléicos por peso molecular

Ferramentas

ELETROFORESE Os fragmentos de DNA formados com a ação das

enzimas de restrição possuem tamanhos diferentes.

A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose. Agarose: é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve

em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina.

Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado.

DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como o DNA é negativamente carregado, ele é atraído

pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.

Ferramentas

ELETROFORESE

Ferramentas

Ferramentas

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Ferramentas

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Visualização do DNA em luz ultravioleta

Ferramentas

ELETROFORESE Separa os fragmentos de DNA de acordo com

tamanho

Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores.

Ferramentas

ELETROFORESE

É possível calcular o

tamanho exato de

um dado fragmento

com base na sua

razão de migração.

Ferramentas

TÉCNICAS DE ENGENHARIA GENÉTICA Introdução de DNA exógeno nas células

Obtenção de DNA

Selecionando um clone

Fazendo um produto gênico

INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS CÉLULAS

Natureza: Os plasmídeos são geralmente transferidos entre

microrganismos de parentesco próximo por contato célula-célula, como na conjugação.

Engenharia genético: Um plasmídeo deve ser inserido em uma célula por

transformação, um processo durante o quel as células podem captar DNA do ambiente circundante.

Muitos tipos celulares não são competentes para a transformação, incluindo células: E. Coli Leveduras Mamíferos

INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS CÉLULAS

Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes de captar DNA externo):

Tratamentos químicos E.coli torna-se competente após incubação das células em uma solução de

cloreto de cálcio por um período breve

Choque térmico:

Técnicas

INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS CÉLULAS

Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes de captar DNA externo):

Tratamentos químicos E.coli torna-se competente após incubação das células em uma solução

de cloreto de cálcio por um período breve

Processo de eletroporação

Técnicas

• Utiliza uma corrente elétrica para formar poros microscópicos nas membranas celulares.

• Geralmente aplicável a todas as células

• Algumas células devem ser convertidas em protoplastos (remoção enzimática da parede celular)

INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS CÉLULAS

Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes de captar DNA externo):

Fusão de protoplastos Manipulação genética de vegetais e algas

Pistola de genes Células vegetais Dispositivo que dispara microprojéteis (partículas microscópicas de

tunstênio ou de ouro de 4 µm de diâmetro) recobertos com o DNA a ser introduzido na célula

Técnicas

INTRODUÇÃO DE DNA EXÓGENO NAS CÉLULAS

Existem vários tratamentos para tornar as células competentes (capazes de captar DNA externo):

Microinjeção Células animais

Técnicas

OBTENÇÃO DE DNA

Vimos como os genes podem ser clonados em vetores com a utilização de enzimas de restrição e como eles podem ser transformados ou transferidos para vários tipos celulares.

Como os engenheiros genéticos obtêm os genes em que estão interessados ?Existem duas fontes principais:

Bibliotecas de genes contendo cópias naturais ou cópias de cDNA dos genes produzidos a partir mRNA

DNA sintético

Técnicas

OBTENÇÃO DE DNA

Biblioteca genômica

É o conjunto de bactérias albergando plasmídeos quiméricos ou recombinantes construídos a partir de DNA genômico

Técnicas

Em princípio, se cortamos um genoma de um organismo qualquer em pedaços com uma enzima e construímos uma biblioteca suficientemente grande (isto é, com muitos clones, ou bactérias, diferentes uns dos outros), teremos uma probabilidade alta de termos qualquer fragmento de DNA desejado em algum dos clones.

OBTENÇÃO DE DNA

DNA complementar (cDNA)

O cDNA é obtido a partir do mRNA por complementaridade de bases.

Técnicas

Esta transcrição em sentido inverso é conseguida através da ação da enzima viral denominada transcriptase reversa. Assim, o mRNA funciona como molde para a síntese de uma cadeia de DNA. Após a formação da cadeia de DNA, a enzima DNA polimerase atua, formando, por complementaridade, a outra cadeia de DNA a partir dos nucleótidos presentes no meio, constituindo-se uma molécula estável.

OBTENÇÃO DE DNATécnicas

OBTENÇÃO DE DNA

DNA sintético

Sintetizar o gene, nucleotídeo por nucleotídeo, na sequência desejada.

Isto é feito normalmente para genes que codificam polipeptídios ou proteínas de pequeno tamanho.

Para executar esta técnica basta conhecer a sequência de aminoácidos da proteína desejada e, com base no conhecimento do código genético, construir a sequência de nucleotídeos que corresponde exatamente à sequência de aminoácidos da proteína.

Técnicas

SELECIONANDO UM CLONE

Na clonagem, é necessário selecionar aquela célula que contenha o gene de interesse específico.

Isso é difícil, pois dentre milhões de células, apenas algumas poucas podem conter o gene desejado

Processo de seleção típico conhecido como seleção branca-azul

Nome derivado da cor das colônias bacterianas formadas no final do processo de seleção

Operon lac Ampicilina

Técnicas

SELECIONANDO UM CLONE

Seleçãopor genes de resistência a antibióticos

Técnicas

Plasmídeo vetor

SELECIONANDO UM CLONETécnicas

SELECIONANDO UM CLONETécnicas

CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE

1. Obtenção do DNA a ser clonado1. Obtenção do DNA a ser clonado

2. Preparação do vetor2. Preparação do vetor

3. Ligação do vetor com o “inserto”3. Ligação do vetor com o “inserto”

4. Transformação da bactéria4. Transformação da bactéria

5. Seleção dos clones recombinantes5. Seleção dos clones recombinantes

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém um ou mais genes. cada gene origina uma proteína, portanto ao estudarmos o

gene estamos estudando a proteína que ele codifica.

Mas o que devemos fazer para estudar o gene? Devemos introduzi-lo no material genético (no DNA)

de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em mRNA, e a tradução em proteína.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE O plasmídio é retirado das células bacterianas para que se possa

inserir o gene de estudo, para depois recolocá-lo na bactéria.

PROCESSO PASSO A PASSO:1. Os pesquisadores querem introduzir um gene humano que produz uma

proteína em uma bactéria.2. Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA

humano, o gene de interesse.3. Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para

obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).4. A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizado para clivar o

plasmídio bacteriano. Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.

5. A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase ,“cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.

6. A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).

Processo passo a passo:

APLICAÇÕES DA ENGENHARIA GENÉTICA