Assepsia e Estabelecimento in vitro

Prof. Paulo Hercílio Viegas Rodrigues

LPVLPV--ESALQESALQ

Assepsia

• Material Vegetal:

Campo X ViveiroCampo X Viveiro

??

Assepsia

• Campo...

Está em contato direto com esporos de fungos, insetos, pequenos animais e condição climática variável (umidade alta). Substrato ou solo rico em matéria orgânica e consequentemente de micro-organismos.

Assepsia

• Viveiro...

Está isolado do ambiente externo e com poucas variações climáticas. Normalmente utiliza-se substrato tratado.

Assepsia

• Seleção do explante (material vegetal)

Partes jovens da planta;

Material sadio (visualmente).

•• Teste para detecção de viroses e outras Teste para detecção de viroses e outras enfermidades.enfermidades.

•• PhaelenopsisPhaelenopsis Rio NegroRio Negro

Kits de

Diagnóstico...

Assepsia

• Extração e Toalete do explante

Tanto para extração como para o toalete, devemos utilizar instrumental apropriado e higienizado (pinças e facas esterilizaras e uso de hipoclorito entre uma planta e outra).

Na extração cuidado para não danificar o explante; no toalete, retirar excesso de solo e partes vegetais para facilitar a pré-lavagem.

Banana

Assepsia

• Pré-lavagem do material vegetal.

Lavar em água corrente, com esponja e detergente, a fim de retirar restos de solo, insetos fixados no tecido vegetal ou qualquer fonte de inóculo de fácil remoção.

Sujidade do tecido vegetal

Conceito de “sujidade”!

D-limoneno: adstringente natural que limpa superfície vegetal.

Assepsia

•• Agentes químicosAgentes químicos:

- Álcool 70%;

- Detergentes (Twin 20);

- Produtos a base de Cloro (Ca(ClO)2; NaClONaClO) com 2% de cloro ativo;

- Produtos a base de Mercúrio (HgCl);

- Óleos essenciais !!!!!

Assepsia

• Concentração das Soluções Assépticas (NaClO).

Depende do tipo de tecidos vegetal:

- Mais tenro (suave = 5 a 15% V/V)

-- Folhas, brotações jovens e tecidos tenros...Folhas, brotações jovens e tecidos tenros...

- Consistência média (padrão = 20 a 30% V/V)

-- Ápices caulinares e ramos herbáceos...Ápices caulinares e ramos herbáceos...

- Consistência dura (concentrado = 50% V/V)

-- Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...Rizomas, ramos lenhosos e frutos/sementes...

Assepsia

• Tempo de assepsia:

-- 5 a 10 minutos;5 a 10 minutos;

- Material tenro

-- 10 a 20 minutos;10 a 20 minutos;

- Material consistência média

-- 20 a 30 minutos;20 a 30 minutos;

- Material consistência dura

Assepsia

• Concentração X Tempo

Resultados negativos!!!!!

Variar concentração e tempo!!!

Concentração Tempo (e vice-versa).

Assepsia

• Retirada da Solução e Lavagem dos explantes:

O processo com solução asséptica é realizado no interior do fluxo laminar. Após o tempo pré determinado, a solução asséptica é drenada e devem ocorrer as lavagem com água destilada esterilizada.

São realizadas 3 lavagens, ainda no interior do fluxo laminar.

Orquídeas!!

Quadro de amadurecimento da cápsula de sementes

GêneroGênero

MesesMeses

Bulbophylum

3

Calanthe

4

Cattleya

11

Coelogynes

13

Cymbidium

10

Cypripedum

3,5

Dendrobium

12

Epidendrum

3,5

Laelia

9

Masdevalia

3,5

Miltônia

9

Odontoglossum

7

Paphiopedilum

10

Phalaenopsis

6

Stanhopea

7

Wanda

20

Cápsula e sementes Orquídeas!

Protocolo de Assepsia (cápsula)

•• AssepsiaAssepsia: hipoclorito comercial 50/50 (v/v),

•• TempoTempo: 20 a 30 minutos,

• Lavagem 3 X com água autoclavada,

• Usar uma lâmina para abrir e outro instrumento

para retirar as sementes.

Germinação in vitro...

Assepsia das sementes

Protocolo de Assepsia (sementes)

•• AssepsiaAssepsia: hipoclorito comercial 30/70 (v/v),

•• TempoTempo: 20 a 30 minutos,

• Lavagem 3 X com água autoclavada,

• Usar seringa ou gase nas lavagens,

• Filtro de café...

Kit Básico!!!

Germinação in vitro...

Peculiaridades!!!

• Lavar em água corrente por 30 minutos ou “over night” (cultura com endofíticos ou de difícil desinfecção).

• Empregar o “sonicador” para fase do hipoclorito.

• Utilizar fogo após a lavagem (rizoma banana).

• Incubar no escuro inicialmente.

• Uso de antibióticos no viveiro (explante) e no meio de cultivo.

Por Meristema

• Feito em híbridos

• Espécies de alta qualidade

• Processo com custo maior

• Cuidados com a planta (número de frentes)

Cultivo in vitro Phaelenopsis

Haste Floral (nós)

Assepsia

Álcool 70 %

30 min. Solução de H2O2 (0,5 %)

15 min. Solução de H2O2 (3,0 %)

Lavar com água destilada estéril (3x)

OU

16.6 g/l dichloroisocyanuric acid Na2 (NaDCC) + Tween 20 (10 min)

Lavar com água destilada estéril (3x)

A

B

Oxidação

A: Sigma Comercial (P6793) B: MS + Vitaminas de TS + cit C: B5 (Gamborg) + BAP D: B5 (Gamborg) E: Arditti & Ernst F: Arditti & Ernst + micro + aux + cit

Cymbidium

Cattleya

INSTALAÇÕES

PLANTAS PARA VENDA