Análises moleculares - DNA

Como o mapeamento genético contribui

para a genética médica ?

•A caracterização de um gene e suas mutações

aumenta a compreensão da doença

Aplicações:

-Desenvolvimento de diagnóstico específico e

sensível por meio da detecção direta das mutações

-Identificação do risco do indivíduo em desenvolver

a doença ou transmiti-la para seus filhos

-Terapias com drogas para prevenir ou aliviar as

doenças, ou reduzir sua progressão

2 obstáculos para a obtenção de uma

quantidade suficiente de uma sequência de

DNA ou RNA:

➢Cada célula apresenta duas cópias de um

gene e alguns genes são expressos apenas em

um subgrupo de tecidos ou em baixos níveis, ou

ambos

➢Dificuldade em purificação da sequência em

questão a partir de todos os outros segmentos

da molécula de DNA ou RNA presentes na célula

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

• Processo de replicação do DNA “in vitro”

• Amplificação dos fragmentos de DNA

• Pode gerar grande quantidade de uma

sequência de interesse em poucas horas

• Componentes:

-Iniciadores (oligonucleotídeos)

-DNA polimerase (enzima + Tampão de reação + MgCl2)

-Nucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

-DNA molde

• Ciclos repetidos de desnaturação pelo calor,

hibridização com os iniciadores, e síntese de

DNA resultam em uma amplificação exponencial

do DNA alvo

• PCR: aplicação clínica para diagnóstico de

doenças

Gel de agarose

Fragmento amplificado

(DNA com carga negativa

corre em direção à eletrodo

com carga positiva)

Eletroforese

PCR / eletroforese e diagnóstico

DNA Fingerprint

DNA

Fingerprint

DNA Fingerprint

PCR-RFLP

• Polimorfismos de tamanho de fragmentos de

restrição;

• Amplificação dos fragmentos de DNA

Utiliza enzimas de restrição

Sítios de restrição

PCR-Multiplex

• Vários primers específicos em uma mesma

reação PCR;

Ex: Vários exons

Para o gene da distrofina

SNP – Single nucleotide Polimorphism

• Polimorfismos de um único nucleotídeo;

Amplificação do DNA via PCR e

análise em eletroforese a partir

do DNA amplificado

desnaturado.

Serve para detectar polimorfismos

em cadeias de DNA.

DNA heteroduplex

• Polimorfismos de um único nucleotídeo;

Amplificação de sequências de DNA via

PCR, desnaturação das sequências e

reanelamento para posterior

eletroforese.

Serve para detectar polimorfismos em

cadeias de DNA.

Ex. gel de poliacrilamida para 16S

Sequenciamento de DNA

• Utiliza alguns análogos químicos dos 4 nucleotídeos

conhecidos, chamados didesoxinucleotídeos

• Não apresentam o grupo OH na posição 3` da

desoxirribose não permitem extensão da cadeia

término da cadeia

Cada nucleotídeo marcado com

um corante fluorescente diferente

Término de cadeia

Sequenciador ABI

Eletroferograma

Sequenciamento do gene MECP2 verificar ocorrência de

mutação no DNA (proteína não será capaz de exercer sua função

biológica de forma adequada) causa da síndrome de Rett

Sequência de DNA do gene MECP2

TRADUÇÃO

Síndrome de Rett

Southern blot

• Técnica que permite localizar uma quantidade

de fragmentos de DNA de interesse em meio a

fragmentos de DNA clivados por enzimas de

restrição

• Possível determinar se uma mutação em

particular está presente ou ausente em um

paciente mutação em uma base impossibilita

a hibridização por complementariedade de

bases (sondas alelo-específicas)

Digestão do

DNA com

enzimas de

restrição

Eletroforese dos fragmentos em gel de agarose

Transferência dos

fragmentos do gel para a

membrana por

capilaridade

Hibridização com sonda marcada de fita simples

Exposição da

membrana a

filmes de raio-X

Desnaturação

do DNA

(Condições que

proporcionem o

pareamento de

bases)

Isolamento de DNA

genômico (linfócitos de

sangue, por exemplo)

Detecção de uma deleção do gene receptor de androgênio por

Southern Blot indivíduo com insensibilidade ao andrógeno

apresenta cariótipo 46,XY, mas fenotipicamente é feminino

DNA genômico digerido

por enzima de restrição e

corado com brometo de

etídeo após eletroforese

Após Southern Blot e

hibridização com uma

sonda de cDNA para o

gene receptor do

androgênio

Uso de oligonucleotídeos alelo específicos:

Detecção anemia falciforme

Permite uma identificação exata de uma sequência particular do

DNA, onde é possível distinguir homozigotos de heterozigotos

FISH

(Fluorescence in situ hibridization)

• Citogeneticistas são capazes de hibridizar as

sondas alvo ,marcadas com corantes

fluorescentes, contidas dentro de cromossomos

imobilizados em lâminas de microscopia

• Visualização de aberrações cromossômicas

Detecção da leucemia mielóide crônica

•Expansão anormal de células progenitoras hematopoiéticas

transformadas, que aumenta o número de células mielóides circulantes

•Translocação cromossômica que leva a superexpressão do proto-

oncogene BCR-ABL

•15% das leucemias

CROMOSSOMO PHILADELPHIA:

•Genes ABL e BCR são rompidos e

unidos em um novo cromossomo 22

•Abl-bcr: fosforilam muitos substratos,

ativando cascatas de sinalização que

controlam crescimento e diferenciação

proliferação descontrolada de

células-tronco hematopoiéticas

Gene ABL:

cromossomo 9

Gene BCR:

cromossomo 22

CROMOSSOMO

PHILADELPHIA: verde

+vermelho=sinal amarelo

Principais indicações de

diagnóstico pré-natal

•Idade materna avançada

•Filho anterior com aneuploidia cromossômica

•Presença de anomalia cromossômica estrutural em

um dos pais

•Histórico familiar de um distúrbio genético que pode

ser diagnosticado por análises bioquímicas ou de DNA

•Histórico familiar de um distúrbio ligado ao X

•Risco de um defeito do tubo neural

•Triagem do soro materno e exame de ultra-sonografia

Punção de vilosidades coriônicas