Análises Forenses

Prof.Ms.Emerson L.B.Lourenço.

Toxicologia Forense

• Definição: Ciência que detecta e identifica a presença de drogas e venenos em fluídos corpóreos, tecidos e órgãos.

Toxicologia Forense

• Funções diversas;

• Toxicologia Forense x Toxicologia Analítica;

• Várias matrizes para análises;

• Métodos químicos sofisticados (derivação química, cromatografia, espectrometria de massa);

Compostos Voláteis

• Compostos da forma liquida que podem ser detectadas por técnicas de cromatografia liquida ou gasosa, quando as matrizes podem sofrerem métodos de extração apropriados.

• Extrações Liquído-Liquído, head space, Micro extração em fase sólida e extração em fase sólida.

Substâncias Corrosivas

• Incluem ácidos minerais e bases;

• Vários agentes corrosivos são constituintes normais dos tecidos;

• Modificações das concentrações químicas no plasma podem determinar as lesões;

Metais

• Clássicos procedimentos de separação de matrizes orgânicas são utilizados para determinação de metais ( Ex: agentes químicos e oxidação térmica);

• Técnicas analíticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e ICP-MS);

• Diferentes formas de metais ( Mercúrio, dimetilmercúrio);

Componentes orgânicos não voláteis

• Drogas prescritas e ilícitas, praguicidas, produtos naturais, poluentes e compostos industriais;

• Dificuldade de Separação....

ANÁLISES

Papel da Toxicologia analíticaBIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO NO FÍGADO E MEDULA ÓSSEA

FÍGADO

CytP450 CytP450

Benzeno fenol hidroquinona

[O] [O]

MEDULA ÓSSEA

Prostaglandina sintetase

Hidroquinona radical fenoxil

(aplasia de medula )

Como determinar?

O que procurar nestas amostras?

metanfetamina

CH2 CHCH3

NCH3

H

efedrina

CH2 CHCH3

NCH3

H

OH

fenilpropanolamina

CH CHCH3

NH

H

OH

anfetamina

CH2 CHCH3

NH

H

femproporex

CH2 CHCH3

NCH2CH2CN

H

ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS

H

OH

HO

1-Androstenodiol

O

OH

BoldenonaO

OH

Cl Clostebol

OHCH3

NN

H

H

Estanozolol

OHC

O

CHH5C2

Gestrinona

OH

O

Nandrolona

O

OH

OH Oxabolona

OH

O

Trembolona

OH

O

CH2CH3

H5C2

THG

AGENTES ANABÓLICOS1. Esteróides anabólicos androgênicos

Algumas dos esteróides mais utilizados:- metandienona (Dianabol),- cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)- decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)- oxandrolona (Anavar)- enantato de metenolona (Primobolan)- estanozolol ( Winstrol)- undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinário

Efeitos tóxicos

-Coletases e tumores no fígado, mais freqüentemente com o uso de derivados C-17 alquilados. Carcinomas hepáticos associados aos E.A. não produzem metástase e regridem após a descontinuação do uso.

Agentes anabólicos1. Esteróides anabólicos androgênicos

O ciclo letal de Andreas Munzer0-10 semanas antes da competição:-Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol, hormônio da tireóide.6-10 semanas antes da competição:-2 inj. Testoviron 250mg (testosterona)-1 inj. Parabolan (Trembolona)- 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)-30 comp. Metandienona-20 doses GH-20 doses insulina3-5 semanas antes da competição:-3 inj. Masteron (Drostanolona)-2 inj. Parabolan(Trembolona)-30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)-50 comp. Stromba (Estanozolol)-2 inj. Stromba-24 doses GH-20 doses insulinaOUTROS: EPO, diuréticos

Baixas concentrações

ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS

DETECÇÃOURINA

O desafio dos anabolizantes

Conteúdo da seringa

18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona

4,9,11- trieno-3-one

i) Novo esteróide, nova “entidade química”.

ii) Sem registro de CAS.

iii) Nunca antes usado em humanos ou animais.

iv) Nunca testado em screening farmacológico.

v) Propósito único – burlar o exame de dopagem.

vi) “O” esteróide de desenho.

Esteróides de desenho

Tetraidrogestrinona – Conclusões de Catlin et al.

Designer steroids

O desafio dos anabolizantes

Caracterização do THG

“CLUB DRUGS”: Freqüentadores de festas “raves”.

• MDMA: Ecstasy, pílula do amor.• GHB: “Ecstasy líquido”.• Cetamina: Special K, Kit kat.• Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB.• LSD (Ácido, doce, ponto).• Fenciclidina: PCP. • Nitritos (Poppers).

GHB

Flunitrazepam (FNZ)Rohypnol

FNZ ilícito

Utilizadas em assaltos e estupros.Efeitos: Incapacidade de reação e amnésia retrógrada.

WWW.DEA.GOV

GHBGama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL).

GHBDefinição:

• Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL.• Natural em SNC de mamíferos.• Estrutura similar ao neurotransmissor GABA.• Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e estupros).• Líquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro.• Popularizado na década de 1980 - realçar o efeito do etanol .• Uso crescente por todo o país.• Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento para narcolepsia.• Alguns congêneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol (solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).

GHBMecanismo de ação:

Receptores só no SNC, principalmente hipocampo.

• Liga-se fracamente em receptor GABA b.

• Depressor do SNC.

• Provoca liberação de opióides endógenos.

GHB• Farmacocinética:• Início de ação: 15-30 min e pico plasmático em 25-45 min.• Metabolizado em CO2 .

• GBL é convertido à GHB por via não enzimática.• 1-4 butanediol é convertido à GHB pela álcool desidrogenase.• Efeito Bifásico. A ingestão concomitante de etanol, leva a uma inibição competitiva pela álcool desidrogenase, retardando a metabolização do 1-4 butanediol. Assim, pode haver uma depressão inicial do nível de consciência seguido por uma melhora quando o etanol é metabolizado e logo em seguida evolução para coma com a disponibilização da álcool desidrogenase.

DOB - (Cápsula do vento)

(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina

www.baladacerta.com.br surforeggae.ig.com.br

DOB - (Cápsula do vento)

(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina

Derivado anfetamínico acrescido de um átomo de bromo

( responsável por potencializar o efeito da droga e por aumentar o tempo de ação).

Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967. Cápsula transparente com capacidade de 500 mg que contém cerca

de 1 a 1,5 mg da substância.

Cocaína(3%)

N

C

O

CH3

OO CH3

CO

Éster metil ecgonina (15-35%)

N

C

CH3

OO CH3

OH

Ecgonina(1-8%)

N

C

CH3

O

OH

OH

Norcocaína(2-6%)

N

C

O

OO CH3

CO

H

Benzoilecgonina (15-50%)

N

C

O

CH3

O

CO

OH

Amostras

PRAGUICIDAS

• a) Derivados do ácido fosfórico.• b) Derivados do ácido tiofosfórico.• c) Derivados do ácido ditiofosfórico.• d) Derivados do ácido fosfônico.

Derivados do ácido fosfórico.

Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfós, Monocrotofós.

Derivados do ácido Tiofosfórico.

Ex: Cloropirifós,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metílico

Derivados do ácido Ditiofosfórico.

Ex:Azinfós,etion,forato,malation,tiometon

Derivados do ácido Fosfônico.

Ex:Triclorfon

Oral, respiratória e dérmica.

BiotransformaçãoOxidação

Ligação ao sitio enzimático

x

Ácido Carbâmico

Aldicarb,Carbaril,Carbofuran

INSETICIDAS ORGANOCLORADOS

São compostos de estruturas cíclicas, bastante lipofílicos e altamente resistentes aos mecanismos de decomposição do ambiente.Os principais organoclorados com atividade inseticida são:

• a) Hexaclodienos e análogos.• b) DDT e análogos.• c) Ciclodienos.• d) Dodecacloro e clordecone.

DDT

2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO

DDT

Aldrin Dieldrin

CICLODIENOS

PIRETRÓIDES

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICAS

-A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de

operações unitárias necessárias para que determinada substância

(analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.

Típicas operações em preparação de amostras:

1) Liberação dos analitos da amostra

2) Remoção de interferentes endógenos

3) Técnicas de extração

4) Aumento da seletividade e sensibilidade

1) Liberação dos analitos da matriz

-Como se encontra o analito na matriz?

-conjugado/livre

-matriz?

BIOTRANSFORMAÇÃOMaconha - 9THC

Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC)

CH3

OCH3

CH3

OH

C5H11

Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOHC

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OO ác ido glicurônico

SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS

-Hidrólise

-Alcalina

-Ácida

-Enzimática

HIDRÓLISE ALCALINA -Exemplo

Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OO ác ido glicurônico

Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

60°C

NaOH

HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA

-Vantagens:

-processo mais rápido

-custo baixo

- Desvantagens:

-degradação de analitos não estáveis

p.ex. benzodiazepínicos

HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA

Cl

N

N

OCH3

Cl

N

O

H

CH3

Diazepam Benzofenona

HCl

100°C

15 min.

Benzodiazepínicos

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

Esteróides Anabólicosconjugados

Esteróides Anabólicoslivres

Beta glucuronidase

55°C

1 hora

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA -Vantagens:

-não degrada os analitos

- Desvantagens:

-custo mais alto

-maior tempo de reação

-controle mais rigoroso das condições

-enzimas podem ser inibidas por substâncias

presentes nas amostras

-aconselhável o uso de controle

OUTRAS AMOSTRASP. ex: cabelo

-Matriz complexa-como retirar os analitos do cabelo?

-digestão da matriz (solução de NaOH 1M e temperatura 70°C

durante 20 minutos)

substâncias estáveis (THC, anfetaminas)

OUTRAS AMOSTRASP. ex: cabelo

-E para substâncias não estáveis?

P.ex. cocaína

N

C

O

CH3

OO CH3

CO

-Incubação em solução ácida ou metanol durante 18 horas a 50°C

2) Remoção de interferentes endógenos

Uma matriz biológica consiste de

muitos componentes, como proteínas,

lipídios, carboidratos que podem interferir

na análise.

2) Remoção de interferentes endógenos

A) Precipitação de proteínas:

A remoção de proteínas por desnaturação ou precipitação é muitas

vezes necessária principalmente em amostras como sangue total ou

plasma. A principal razão de remover proteínas é que elas podem

precipitar em contato com a fase móvel, obstruindo a coluna de

HPLC.

Métodos de precipitação:

a) com ácidos ( p.ex. ácido tricloroacético e ácido

perclórico)

-formam sais insolúveis com a forma catiônica

das proteínas em meio ácido

b) com solventes orgânicos

-solventes que são miscíveis em água como acetona,

metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a

solubilidade de proteínas.

Métodos de precipitação:

c) com sais metálicos: proteínas também podem ser

removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou

cobre em condições alcalinas.

-não : analitos que complexam com metais.

b) sulfato de amônio: O sulfato de amônio é um

precipitante relativamente ineficiente: < 75% das

proteínas são removidas com a adição de 1,5mL de sol.

Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser

possível injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.

Precipitação de pigmentos e sais biliares

Pigmentos urinários e sais biliares podem produzir altos

“backgrounds”que podem interferir na quantificação de analitos. A

remoção desses compostos com extensos esquemas de extração

podem ser relativamente difíceis ou demorados. Sua remoção pode

ser feita preferencialmente por precipitação com sais de chumbo.

3) Técnicas de extração

-Extração líquido-líquido (LLE)-Extração em fase sólida (SPE)-Extração por head space (HS)-Micro extração em fase sólida (SPME)

EXTRAÇÃO(líquido-líquido)

urina

Solvente orgânico

urinaDrogas/ metabólitos

Agitação

Centrifugação Separação da fase orgânica extrato

EXTRAÇÃO(líquido-líquido)

INFLUÊNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE

• substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

H+

OH-ácido 11-nor-delta -

9-THC-COOH

Forma ionizada

Forma não-

ionizadaC

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OO

EXTRAÇÃO(líquido-líquido)

INFLUÊNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE

• substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas

Anfetamina

H+

OH-

Forma ionizada

Forma não-ionizada

CH2 CHCH3

NH

H

CH2 CHCH3

N+H

H

H

CH2 CHCH3

NH

H

EXTRAÇÃO(líquido-líquido)

EFEITO “SALTING OUT” = molécula de água

+ NaCl (cloreto de sódio)

Na+ Cl-

CH2 CHCH3

NH

H

CH2 CHCH3

NH

H

2mL Metanol +2mL tampão

fosfato

1

2,5mL Amostra + 2,5mL água +

PI + 2mL tampão fosfato

BEPIInterf.COC

2

3mL água +3mL HCl (0,1M), secagem (5min) + 9mL metanol

3

2mL diclorometano/ isopropanol / NH3 (80:20:2)

4

EXTRAÇÃO(fase sólida)

Tipos de colunas (SPE)

-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)

SiC8

Octil

SiPH

Fenil

SiCHCiclohexil

Tipos de colunas (SPE)

-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)

Si C N

H O

CNCianopropil

Si NH

H

H

O

NH2

Aminopropil

Si O

OH

O

HH

NH

2OHDiol

Tipos de colunas (SPE)

-INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática)

SiC

O

O- +NH3 RCBA

Ácido carboxílico

Si

SO3- +NH3

SCXÁcido

benzenosulfônico

Si N+(CH3)3-SO3 R

SAXTrimetil

aminopropil

EXTRAÇÃO

Benzoilecgonina -metabólito da

cocaína

H+

OH- Forma ionizada

Forma ionizada

CO

O

N

C

CH3

OOH

+H

CO

O

N

C

CH3

OOH

CO

O

N

C

CH3

OO-

EXTRAÇÃO(fase sólida)

SO3-+H

CO

O

N

C

CH3

OOH

EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS

Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI

ESTUFA 70°C 30 min GC

seringa

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

61 2 3 4 5

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)-Fibras comercialmente disponíveis:

Fase estacionária eespessura do filme

Abreviação Aplicação geral

Polidimetilsiloxano(100um)

PDMS Compostos não-polares, voláteis

Polidimetilsiloxano(30um)

PDMS Não-polares,voláteis e semi-

voláteisPolidimetilsiloxano

(7um)PDMS Não-polares, semi

e não voláteisPolidimetilsiloxano-

divinilbenzeno (65um)PDMS-DVB Polar

Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral,voláteis

Carboxeno-polidimetilsiloxano

(75um, 85um)

CAR-PDMS Voláteis

Carbowax-divinilbenzeno (65um,

75um)

CW-DVB Polar, voláteis

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:

-Dimensões da fibra (comprimento, espessura);-Tipo de fibra;-Temperatura de extração;-Efeito da matriz (presença de sal, pH);-Velocidade de agitação;-Tempo de extração.

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

-Influência do tempo de extração:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

-Influência da temperatura de extração:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)-Influência da concentração de sal:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)-Influência do pH:

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

Vantagens da SPME sobre a SPE e extração líquido-líquido:

-simplicidade-prático-rápido-extração sem utilização de solventes-pode ser automatizado.

4) Aumento da seletividade e sensibilidade

-Derivação

Objetivo:

-melhorar as condições cromatográficas

(GC)

-aumentar a sensibilidade

-Derivação

Ex. opiáceos

O

H

OHHO

N.CH3

HH

OO

N.CH3

H

Si

CH3

CH3

CH3

OSiCH3

CH3

CH3

BSTFA

70°C 20 min

Aumento da volatilidade (melhora das condições cromatográficas (GC)

-Derivação

Ex. benzoilecgonina

Aumento da sensibilidade para detectores ECD

N

C

CH3

OO H

O CO

N

C

CH3

OO CH2CF2CF3

O CO

PFP/PFPA

70°C 20 min

MATRIZES BIOLÓGICAS• URINA• SANGUE• AR EXALADO

MATRIZES ALTERNATIVAS:• SALIVA• CABELO• MECÔNIO• UNHA• SUOR

URINA Néfron

URINACARACTERÍSTICAS:

• Coleta não invasiva• Disponibilidade de grandes volumes de amostra• Concentração alta• Facilidade da análise (baixo custo)• Possibilidade de adulteração da amostra• Período de detecção: alguns dias• Detecção de uso eventual

SANGUECARACTERÍSTICAS:

• Coleta invasiva• Necessidade de profissional treinado • Matriz relativamente complexa• Período de detecção: algumas horas• Correlação com estado clínico• Maior dificuldade de adulteração

SALIVA

SALIVACARACTERÍSTICAS:

• Coleta não-invasiva• Facilidade na coleta• Coleta sob vigilância e em campo aberto • Correlação com concentração sangüínea• Período de detecção: algumas horas• Pouco volume de amostra• Concentração baixa

CABELOCARACTERÍSTICAS:

• Coleta não-invasiva• Período de detecção: meses

– Retrospectiva e cronológica• Detecção: uso intenso• Disponibilidade: ????• Adulteração: difícil• Possibilidade de contaminação• Baixa concentração• Matriz complexa -dificuldade na análise

CABELO

1 cm

2 cm

3 cm

4 cm

5 cm

6 cm

7 cm

8 cm

9 cm

10 cm

MECÔNIO CARACTERÍSTICAS:

•Exposição fetal•Coleta não-invasiva•Matriz complexa -dificuldade na análise•Período de detecção: meses•Disponibilidade •Possibilidade de contaminação

UNHA

UNHA

CARACTERÍSTICAS:

•Coleta não-invasiva•Baixa concentração•Dificuldade na análise•Período de detecção: meses•Uso intenso•Disponibilidade???? •Adulteração: difícil•Possibilidade de contaminação

SUOR

CARACTERÍSTICAS:

• Coleta não-invasiva• Coleta através de adesivos “patch”• Baixa concentração• Dificuldade na análise• Não existem muitos estudos• Monitorar pacientes em tratamento

Aumento da seletividade e sensibilidade

-Derivação

Objetivo:

-melhorar as condições cromatográficas

(GC)

-aumentar a sensibilidade

-Derivação

Ex. opiáceos

O

H

OHHO

N.CH3

HH

OO

N.CH3

H

Si

CH3

CH3

CH3

OSiCH3

CH3

CH3

BSTFA

70°C 20 min

Aumento da volatilidade (melhora das condições cromatográficas (GC)

-Derivação

Ex. benzoilecgonina

Aumento da sensibilidade para detectores ECD

N

C

CH3

OO H

O CO

N

C

CH3

OO CH2CF2CF3

O CO

PFP/PFPA

70°C 20 min

Técnicas de extração e detecção em amostras biológicas de acordo com a

estrutura química das moléculas

DERIVAÇÃO