Amplificação (clonagem) dos genes e seu armazenamento

• Sistemas celulares-> bactérias, vírus, células eucarióticas;

• Sistemas acelulares-> Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

• 1985- Kary Mullis inventou a reação em cadeia da polimerase (PCR) durante uma viagem de carro ao longo da costa da Califórnia. Sua ideia foi a concepção de uma técnica genial, relativamente simples, que funciona como complemento perfeito para a clonagem gênica.

• Novas disciplinas surgiram como consequência direta da invenção da PCR-ecologia molecular, arqueologia biomolecular, ciência forense.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Bibliotecas Genômicas e de cDNA

Departamento de Biologia Celular e Molecular

Bibliotecas

São coleções de sequencias de DNA usadas para armazenar informação-> coleção de genes recombinantes.

Ex. de usos:• isolamento de um gene específico;• sequenciamento;• clonagem;• identificação de genes em diferentes especies;• análise de proteínas relacionadas;Etc...

Tipos de Bibliotecas:

Biblioteca Genômica : uma coleção de clones de DNA representando o genoma de um organismo

Biblioteca de cDNA : coleção de clones com insertos de DNA complementar (cDNA) sintetizada a partir de moleculas de mRNA de uma célula

Fontes de DNA para a Biblioteca• DNA Genomico : o DNA genômico é cortado e pequenos pedaços são clonados. Vantagem : todo o genoma é cortado e clonado em pequenos pedaços - pega toda a

sequencia. Desvantagem : vem um monte de lixo.Dois métodos:

• 1. fragmentação randômica do DNA em pequenos pedaços que são ligados a oligonucleotídeos, as pontas contêm sítios de restrição.

• 2. Fragmentos parcialmente digeridos com enzima de restrição. Pode variar o tempo de digestão ou quantidade de enzima.

• cDNA : DNA sintetizado a partir do mRNA com a transcriptase reversa.

Vantagem : somente os genes expressos são selecionados.Desvantagem : não é possivel selecionar sequencias de controle ou íntrons e

frequentemente dependem do nível de expressão gênica.

Biblioteca genômica como fazer?

Acompanhamento da Reação: visualização em eletroforese em gel de agarose

• Variando o tempo de digestão

ou quantidade de enzima

Biblioteca genômica

Biblioteca genômica

Biblioteca de cDNA

Síntese de cDNA

•oligo-dT anela na cauda poly-A.

• Síntese da primeira fita de DNA a partir do mRNA em presença da transcriptase reversa

Biblioteca de cDNA

Síntese de cDNA•Remoção da fita original de RNA com: Calor, alcali ou RNAse H.

•Formação de grampo na extremidade 3’ e extensão do grampo com DNA polimerase

•S1 nuclease (que corta bases não pareadas)

•Ligação de linkers com DNA ligase e clonagem em um vetor.

Vetores de clonagem

Vetores• São usados para amplificar uma molécula de DNA .

O DNA tem que ser inserido em um vetor de clonagem.

• Um plasmídio tem uma origem de replicação e é

capaz de replicar em bactérias.

• Os vetores são geneticamente modificados gerando: - Plasmídeos;- Fagos;- Cosmídeos- BAC’s e - YAC’s

Vetores para bibliotecas de DNA

Plasmideos• Plasmideos são circulares, dupla fita e encontrados em bactérias.

• Podem replicar idependentemente podendo ter de poucas bases a 100 Kb.

• Pode carrear fragmentos de até 10 kb

• Plasmideos tem uma origem de replicação, marcador de seleção e sitios de restrição.

• Após cultivo o clone pode ser recuperado facilmente após a lise das celulas e o fragmento de DNA ou mantido indefinitamente em glicerol a –70 0C.

Biblioteca genômica: Bacteriofago λ (Lambda)

• Para clonar insertos de 10 a 20 Kb• Bibiotecas em plasmídeos comportam insertos de até 10 Kb

O genoma do Bacteriofago λ

Biblioteca Genômica: Bacteriofago λ

Biblioteca de Cosmideo

Permite a clonagem de fragmentos de até 45 kb

BACs: Bacterial Artificial Chromosomes• Baseado nobacteriofago P1, oPlasmideo F e a região lacZdo plasmideo pUC

• É um plasmideo com baixo número de cópias

• Permite fragmentos de 50-300kb

YACs:Yeast Artificial Chromosomes

Permite insertos de até 500 kbs

YACs replicam como plasmideos em bacterias quando sem inserto de DNA.

Assim que os fragmentos são inseridos, YACs são transferidos para células, e replicam como cromossomos eucarióticos

Triagem dos clones

de interesse

Triagem do Clone RecombinanteBiblioteca de Bacteriofagos ou plasmideos

Plaqueamento da Biblioteca

Triagem por:

Sondagem por HibridizaçãoSondagem Imunológica

Hibridização• O DNA em fita simples pode parear com outro DNA

ou RNA desde que este possua região complementar.

• Técnicas que aplicam a hibridização:

– Southern blot: DNA digerido por enzima de restrição é separado em um e de eletroforese

– Northern blot: usa RNA no gel ao invés do DNA– Hibridização in situ : usando um tecido– Hibridização de colonias : detecção de clones

Processo de hibridização• O DNA é aquecido a alta temperatura ou em

presença de NaOH e desnatura. As fitas complementares a sonda anelam. Após lavagem somente as sondas ligadas ficam.

• Estringência: Qual a necessidade de homologia perfeita para que as fitas se mantenham ligadas?

DEPENDE DA ESTRINGENCIA Em BAIXA concentração de salALTA temperatura (Depende da quantidade de

GC) MAIOR a necessidade de complementariedade. • Autorradiografia. Sonda marcada

impressiona o filme de raioX.

Processo de hibridização

Processo de hibridização

Hibridização com sonda radioativa

Hibridização com sonda não radioativa

Hibridização com sonda não radioativa

Sondagem imunológica

Sondagem imunológica

Southern hybridization (DNA)

Triando uma Biblioteca: Hibridização de colônias

Hibridização de Colônias

A sonda pode ser sintetizada?

Triagem de biblioteca Genômica: II.Colônia Imunoensaio

A sonda é um anticorpo, as colônias são crescidas e a proteína recombinante é expressa

Triando uma Biblioteca Genômica: II.Colônia Imunoensaio

A quimioluminescencia também irá impressionar o filme de raio-X

Biblioteca Genomica: Bacteriofago λ

Plaques - Bacteriofago λ

Triando uma biblioteca de fago λ• Fagos recombinantes inseridos em

bactérias são plaqueados resultando

na formação de plaques;

• As partículas de fagos e o genoma

do fago são transferidos para um

filtro de nitrocelulose;

• O filtro é incubado com uma sonda

radioativa para um determinado gene;

• Fago com o gene de interesse é

identificado por autoradiografia e este

clone pode ser isolado e inoculado em

um novo hospedeiro para mais uma amplificação.