Post on 07-Apr-2016
Aluna: Mirian Mariko Tsutsumi
Orientador :Prof. Dr. Gonçalo A. G. PereiraCo- Orientador : Dr. Jorge M. C. Mondego
Modelagem computacional da cinética enzimática de vias metabólicas de Moniliophthora perniciosa
Apresentação do projeto
Motivação
Etapas do projeto
Cura de vias metabólicas
Resultados e Conclusão
Perspectivas
Apresentação do projeto
Motivação
Etapas do projeto
Cura de vias metabólicas
Resultados e Conclusão
Perspectivas
http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01100.html
Motivação
Motivação
Systems Biology
Kitano, H.(2002)
Softwares disponíveisJWS Online - Online Cellular Systems Modelling
Complex Pathway Simulator
Motivação
JDesigner: A Biochemical Network Layout Tool
a modeling tool for biochemical networks
Power Law Analysis and Simulation tool
Virtual Cell- Internet simulation server at NRCAM
E-Cell- project
web server for modeling and simulation of cellular systems
Biochemical Kinetics Simulator
Genoma de M. perniciosa no LGE
+/- 16.000genes 2304 genes foram
hibridizados 189 genes diferencialmente
expressos 4595 ESTs foram agrupados
1534 unigenes (522 clusters
e 1012 singlets)
Motivação
(http: //www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura)
(Rincones et al. 2008)
Dado de de microarraysmicroarrays híbrido de DNA híbrido de DNA
Diagramas estáticos
de metabolismo no do LGE
•1751 reações enzimáticas
Motivação
•2139 enzimas
•367 vias metabólicas(Karp, 2005)
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/biocyc/MP/).
Vias metabólicas de interesse para M. perniciosa
Porque escolhemos estas vias metabólicas
Motivação
Uréia
Metanol
Glicerol
GABA
Comportamento bioquímico no processo doença do patógeno ao cacau
Scarpari et al., (2005)
Metabolismo do Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo de dihidroxiacetona);
Oxidação do metanol a formaldeído
Oxidação de formaldeído II (Glutationa-dependente);
Biotrófica>>>maior expressão do gene de álcool oxidase necrotrófico (Rincones et al., 2008).
Ela oxida derivados de metanol na degradação de pectina , assim, pode sobreviver como única fonte de carbono (Rincones et al., 2008).
Presença de genes codificadores das proteínas formaldeído dehidrogenase e formato dehidrogenase, responsáveis pelo catabolismo do metanol (Rincones et al., 2008; Mondego et al., 2008)
Metabolismo do Glicerol
Degradação de glicerol I Degradação de glicerol IV
Somente essa fonte de carbono é capaz de manter in vitro o organismo na fase biotrófica (Meinhardt et al., 2005; Rincones et al., 2008)
Sustentação rítmica do crescimento deste fungo (Meinhardt et al., 2005).
Patogênese fúngica pois está envolvido na aderência e penetração (Yoder,1996)
Modificação do conteúdo de ácidos graxos quando muda de fase
Metabolismo do GABA
Degradação de 4-aminobutirato I
Degradação de 4-aminobutirato II(sendo que o primeiro GABA I exclui Ciclo TCA e Complexo dehidrogenase piruvato);
Privação do fungo a fontes de nitrogênio >>> manutenção da fase biotrófica (Rincones et al., 2008; Mondego et al., 2008).
Expressão de um gene homólogo a CLNR1 (do fungo hemibiotrófico Colletotrichum lindemuthianum )ativa as enzimas e os transportadores, que permitem absorção e catabolismo de nitrogênio de fontes secundárias (Pellier et al., 2005)
Metabolismo da Uréia
Ciclo da uréia.
Resultados agropecuários mostraram que a adição de compostos nitrogenados (uréia) às árvores de cacau infectadas resulta no controle da vassoura de bruxa (http://globoruraltv.globo.com/GRural/0,27062,LTO0-4370-3168801,00.html )
Altas concentrações de uréia (logo convertido em amônia ) promove a rápida mudança de fase
Apresentação do projeto
Motivação
Etapas do projeto
Cura de vias metabólicas
Resultados e Conclusão
Perspectivas
Etapas do projeto
(1)Catalogaçãoe
avaliação dados
(2)Revisão ferramentas
MODELO
(3)Aplicaçãoda
Modelagem
(4)Análise Sensibilidade
(5)ComparaçãoModelos
(6)Refinamentodo
Modelo
‘Systems biology in practice. Concepts, implementation, and application’ de Klipp, E. et al (2005)
Coleta de dados cinéticos de organismos próximos filogeneticamente (Mondego, et al, 2008)
Laccaria bicolorCryptococus neoformansUstilago maydisCoprinopsis cinereaPhanerochaete chrysosporium
Etapas do projeto- (1 ) Catalogação & Avaliação
Etapas do projeto- (1 ) Catalogação & Avaliação
http://www.brenda-enzymes.org
Constante de Michaelis Menten (Km); Turnover (kcat); pH ótimo e faixa de pH; possíveis co-fatores e inibidores, temperatura ótima e faixa de temperatura
Etapas do projeto- (2) Revisão de ferramentas
Modelagem deterministica versus estocástica
Avaliação de Softwares disponíveis
(Lee, et.al.,2008; Alves, et. al., 2006; Gilbert, et.al.,2006)
Documentação
Interfaces gráfica
Funcionalidade
Aplicativos adicionais
Compatibilidade em SBML
Teoria de Cinética química enzimática
Sistema dinâmico contínuo Equações diferenciais ordinárias(ODEs).
Legenda para o gráfico
1) Aceleração da reação enquanto [ES] está aumentando
2) A duração deste período depende da concentração inicial do substrato e as propriedades da enzima
3) Fase relacionada com o pressuposto de estado estacionário ([ES] é constante)
4) As concentrações de ES e E são amplificadas, em relação ao [S]o, são quase desprezíveis
Fase 1: Pré-estado estacionário
Fase 2: Estado estacionário
Fase 3: Esgotamento do substrato
Comportamento da concentração dos componentes em relação ao tempo da reação de catálise enzimática.
oM
o
oM
oTcato SK
SVSKSEk
v
max
Dinâmica da reação –Michaels Menten
Etapas do projeto- (2) Revisão de ferramentas
(Cornish-Bowden,1979, Dixon,1979)
Vizualizar a plotagem gráfica das concentracoes das substâncias em relacao ao tempo
Etapas do projeto- (3)Aplicação da modelagem e (4) Análise de sensibilidade
Dependência dos resultados do modelo quando há mudança no valor dos parâmetros.
Análise da sensibilidade
Voit, O. “Computational Analysis of Biochemical Systems” 2005
Modelagem computacional
Eleger o modelo matemático mais adequado
Simulação do metabolismo do organismo
Inserir dados de parâmetros cinéticos
Explicacao detalhada no exemplo da via modelada
Literatura e banco de dados de vias metabólicas já modeladas
Etapas do projeto
•JWS Oline:http://jjj.biochem.sun.ac.za/
(5)Comparação de modelos e (6) Refinamento do modelo
•BioModels
Comparação
Refinamento
Atualizacao de dados a partir da revisao bibliográfica
Sanar equívocos e erros conceituais da modelagem
Apresentação do projeto
Motivação
Etapas do projeto
Cura de vias metabólicas
Resultados e Conclusão
Perspectivas
Contig da enzima da via de
metabolismo do BioCyc
Consulta do Genome Browser
da vassoura
Anotação manual dos dados
atualizados de Microarray e ESTs
Número de EC da enzima que não foi
identificado um Contig pelo BioCyc
Consulta do BRENDA da seqüência de aminoácidos
Busca via tBlastn em sequência de
Vassoura
Anotação manual do Contig EST ou
Singlet candidato
Exemplo de via metábólica para cura (A) e (B)
Cura de vias metabólicas
Pipeline A e B para cura de vias metabólicas
Validar e complementar os dados gerados automaticamente pelo BioCyc relação às informações de ORFs
Cura de vias metabólicas
Contig da enzima no bioCyc
Gbrowser da Vassoura
Anotação das vias com dados atualizados de microarray e estsBlast da Vassoura
Anotação das enzimas candidatas
Procurar sequências próximas
Para todas as enzimas...
Para os buracos ...
Apresentação do projeto
Motivação
Etapas do projeto
Cura de vias metabólicas
Resultados e Conclusão
Perspectivas
Catalogação das enzimasResultados
EC number Nome da enzima Via metabólica
11.1.1.284
S-(hidroximetil)glutatione dehidrogenase Metanol
Oxidação de formaldeído II (glutatione-dependente)
2 1.1.3.13 Álcool oxidase MetanolOxidação de metanol para formaldeído
31.1.99.5
Glicerol-3-fosfate dehidrogenase Glicerol Degradação glicerol I e IV
4 1.2.1.2 Formato dehidrogenase MetanolOxidação de formaldeído II (glutatione-dependente)
5 1.2.1.12Gliceraldeíide-3-fosfato dehidrogenase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
6 1.2.1.16
Sucinato-semialdeíde dehidrogenase (NAD(P)(+)) GABA
4- degradação aminobutirato I e II(GABA)
7 1.2.1.24Succinato-semialdeide dehidrogenase GABA
4- degradação aminobutirate I(GABA)
8 1.11.1.6 Catalase MetanolOxidação de metanol para formaldeído
9 1.4.1.2 Glutamate dehidrogenase GABA
4- degradação aminobutirato II(GABA)
10 2.1.3.3Ornitine carbamoiltransferase
ciclo de uréia
11 2.2.1.1 Transketolase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
12 2.2.1.3 Formato dehidrogenase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
13 2.6.1.194-aminobutirate transaminase[2] GABA
4- degradação aminobutirato I e II(GABA)
14 2.7.2.3 fosfoglicerato quinase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
15 2.7.1.29 Glicerone quinase. Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
EC number Nome da enzima Via metabólica
16 2.7.1.30 Glicerol quinase GlicerolDegradação glicerol I e IV
17 3.1.2.12S-formilglutationa hidrolase Metanol
Assimilação de formaldeído II (ciclo dihidroxiacetone)
18 3.1.3.11 Frutose-bisfosfatase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
19 3.1.4.46 Glicerofosfodiester fosfodiesterase Glicerol Degradação glicerol I
20 3.5.3.1 Arginase.ciclo de uréia
21 4.1.2.13 Frutose-bifosfato aldolase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
22 4.3.2.1 Argininosucinato liaseciclo de uréia
23 4.4.1.22 S-(hidroximetil)glutationa sintase Metanol
Assimilação de formaldeído II(ciclo dihidroxiacetone)
24 5.1.3.1Ribulose-fosfato 3-epimerase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
25 5.3.1.1 Triose-fosfato isomerase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
26 5.3.1.6Ribose-5-fosfate isomerase Metanol
Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)
27 6.3.4.5Argininosuccinate sintase.
ciclo de uréia
28 6.3.4.16 Carbamoil-fosfate sintase (amônia).
ciclo de uréia
Fonte: BRENDA
Fonte: BRENDA
Quantidade de dados cinéticos das enzimas para organismos filogeneticamente próximos a M. perniciosa ainda deixa a desejar
Resultados
há poucos estudos e publicações públicas de experimentos em relação a fungos, principalmente filamentosos
Uso de dados cinéticos de eucariontes
Banco de dados individual do projeto
Avaliação
Enzima Contig SingletsMicroarray ESTs BestModelSv1 E-value
3.5.3.1
Contig11026_GV6_G1 - -
EST_CP02-EC-001-005-B09-UE.F
gi|164650645|gb|EDR14886.1| arginase [Laccaria bicolor S238N-H82] 6,00E-37
4.1.2.13
Contig14043_SV2_G1 -
Amarelo FoldChange B/NC:-1.24
-
gi|164640807|gb|EDR05071.1| fructose 1,6-bisphosphate aldolase [Laccaria bicolor S238N-H82] 6,00E-34
Contig12493_AV9_G1 -
Amarelo FoldChange B/NC:1.31 -
gi|46849403|dbj|BAD17911.1| fructose-bisphosphate aldolase C [Amia calva] 1,00E-31
CP02-S2-032-448-A11-UC.F_Gv6_g1 - - -
gi|164640807|gb|EDR05071.1| fructose 1,6-bisphosphate aldolase [Laccaria bicolor S238N-H82] 3,00E-21
4.3.2.1Contig2687_AV9_G1 - -
EST_CP03-EB-001-002-F02-UE.F
gi|164650003|gb|EDR14244.1| argininosuccinate lyase [Laccaria bicolor S238N-H82] 2,00E-66
Resultados
Cura das vias : Anotação manual das enzimas
Oito enzimas não possuíam ORF nas vias metabólicas em estudo
A anotação manual anterior para o BestModel anterior pode ter inserido tal dado ao final da lista de hits de forma que a leitura automática do BioCyc não pode ler e assimilar este ORF para a enzima.
Enzima Via metabólicaContig BestModel Organismo
E-value organismo
1.2.1.24 GABA I Contig8459 - Pan troglodytes 1,00E-51
6.3.4.16
Ciclo da uréia
Contig9915
gi|116508372|gb|EAU91267.1| predicted protein [Coprinopsis cinerea okayama7#130] E-value = 1e-60 Mus musculus 0.0
2.2.1.3Oxidação de formaldeído II Contig6922 -
Pichia angusta; Candida boidinii 1E-91; 2e-98
3.1.2.12Ciclo de dihidroxiacetona Contig9496 -
Saccharomyces cerevisiae 1,00E-42
E-values baixos>>>indica alta similaridade entre o predito de M. perniciosa e o gene descrito no banco de dados
Correção da via metabólica de degradação de 4-aminobutirato II (GABA)Enzima Nome
Contig OrganismoE-value organismo
1.1.1.61
4-hydroxybutyrate dehydrogenase
Contig13320
Clostridium kluyveri (strain ATCC 8527 / DSM 555 / NCIMB 10680) 6,00E-04
5.3.3.3
vinylacetyl-CoA DELTA-isomerase No hits Clostridium aminobutyricum -
1.3.99.2butyryl-CoA dehydrogenase Contig7202 Pongo pygmaeus 4,00E-51
2.8.3.8acetate CoA-transferase Contig8771 Haemophilus influenzae 3,00E-08
Resultados
E-value muito alto para definir a predição confiável de ORF
Exceto fungo (Pongo pygmaeus), todos os outros alinhamentos dá melhor hit contra bactérias, procariontes
Pacote software
Stand alone Web
SiteDeterminística Estocástica Documentação
1 BASIS x x -2 CellDesigner x x3 CellWare x x4 Gepasi/
COPASI x x
5 Dizzy/ Gillespie x x
6 Dynetica x7 E-Cell x x8 JWS Online x x -9 JDesigner/
Jarnac x x -
10 Twain x x11 PLAS x x12 PyBioS x x -13 Sycamore x x x14 WebCell x x x15 VirtualCell x x -
Pacote software Interfacesgráficas
Funcionalidade Aplicativosadicionais
Erros na compatibilidade
em SBML1 BASIS x x2 CellDesigner x3 CellWare x x4 Gepasi/
COPASIx x
5 Dizzy/ Gillespie x6 Dynetica x*7 E-Cell8 JWS Online x x9 JDesigner/
Jarnacx x
10 Twain11 PLAS12 PyBioS x x x13 Sycamore x x x14 WebCell x x x15 VirtualCell x x* PARA DYNETICA NÃO SE USA SBML
Revisão de pacotes de softwares simuladores
Resultados
Pacote software Disponível em:BASIS https://www.basis.ncl.ac.uk/
CellDesigner http://www.celldesigner.org/CellWare http://www.cellware.org/
Gepasi/COPASI http://www.copasi.org/Dizzy/ Gillespie http://magnet.systemsbiology.net/software/Dizzy/
Dynetica http://www.duke.edu/~you/Dynetica_page.htmE-Cell http://www.e-cell.org/
JWS Online http://jjj.biochem.sun.ac.za/JDesigner/Jarnac http://sbw.kgi.edu/software/jdesigner.htm
JSim http://nsr.bioeng.washington.edu/PLN/Software/Twain http://sbw.sourceforge.net/sbw/software/PLAS http://www.dqb.fc.ul.pt/docentes/aferreira/plas.html
PyBioS http://pybios.molgen.mpg.de/ Sycamore http://sycamore.eml.orgWebCell http://www.webcell.org/
VirtualCell http://www.nrcam.uchc.edu/
Resultados
Comparação entre simuladores em websites e stand-alone, análise da usabilidade de interfaces, funcionalidade e suporte para documentação e ferramentas de matemática.
Para tais características tem-se: Sycamore e WebCell entre os melhores para servidores na internet, já para o stand-alone elegemos CellDesigner , JDesigner e Copasi.
Modelagem matemática da Degradação de glicerol IV
Glicerol+ ATP=glicerol-3-fosfato+ ADP (1)
iATPmATPiGlic
mGlicADP
iGlicmADP
eqinv
dir
mGliciGlicmGlicPiG
eqdir
KATPPG
KKATPKKADP
KGlicPGK
KVV
ATPKKGlicKKPGATPGlic
KADPPGATPGlicV
v
1.3..1.1.3.
.
..31..
.3..
11
1
3
11
iNADmNADPiG
PmGDHAP
PiGmNADH
eqinv
dir
PmGPiGPmGiDHAP
eqdir
KNADNADH
KKNADK
KNADKPGDHAPK
KVV
NADKKPGKKDHAPNADPG
KNADHDHAPNADPGV
v
1...
1.31...
.3.1..3
..3.
3
3
322
2
333
22
Glicerol -3-fosfato+ aceptor =glicerona fosfato+aceptor reduzido (2)
Mecanismo ordenado Bi-biglicerol quinase EC 2.7.1.30Candida mycoderma (1) eglicerol -3- fosfatase EC 1.99.5Jaculus orientalis (2)
Resultados
WebSite do Sycamore para a modelagem da cinética enzimática
(http://sycamore.eml.org)
Resultados
Um exemplo de simulação para t=0s com [ATP]=[ADP]=[NAD]=[NADH2]=10,0M , [G3P]=8,0M e [Glic]=5,0M é apresentado no Gráfico 1.
Exemplo de simulação da via de Degradação de glicerol IV
0
2
4
6
8
10
12
14
0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
Tempo (s)
Con
cent
raçã
o fin
al (M
)
G3P
NAD
DHAP
NADH
Glic
ATP
ADP
Depois de 300s curvas horizontais paralelas ao eixo das abscissas
Concentrações não irão variar em relação ao tempo
E nosso estudo se limita ao tempo zero a t=300s.
Estudo da análise de sensibilidade de parâmetros cinéticos
duas velocidades V1 e V2 (V1=V_dir_1=V_inv_1 e V2=V_dir_2=V_inv_2); e três concentrações iniciais, [Glic], [G3P] e [DHAP].
Para o primeiro caso, a exemplo no gráfico 2, além das concentrações dos co-fatores fixos temos [G3P] e [DHAP] fixas, enquanto variamos de 0 a 10M a concentração do glicerol
Resultados
A aplicação da análise de sensibilidade consiste em avaliar o quanto o modelo cinético proposto é dependente dessas variáveis
Cinco incógnitas:
Para limite de t=300s, coletou-se a concentração dos metabólitos ao final desse tempo em função da variação da concentração inicial de um único metabólito.
Análise de Sensibilidade para Glicerol
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Concentração inicial de Glicerol (M)
Con
cent
raçã
o fin
al (M
)
G3P
DHAP
Glic
Análise de Sensibilidade de Glicerol-3-fosfato
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Concentração inicial de Glicerol-3-fosfato (M)
Con
cent
raçã
o fin
al (M
)
G3P
Glic
DHAP
Análise da Sensibilidade para Dihidroxiacetonafosfato
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Concentração inicial de Dihidroxiacetonafosfato (M)
Con
cent
raçã
o fin
al (M
)
G3P
Glic
DHAP
Gráfico 2:curvas G3P e DHAP nítida inclinação
Gráfico 4: curvas GLIC e G3P sutil declividade
A modificação da concentração inicial de GLIC provoca uma alteração maior nas concentrações finais das demais substâncias em comparação com a modificação da concentração de DHAP
Resultados
Análise da Sensibilidade para Velocidades de cada reação da via metabólica
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 10.0
Razão entre V1 e V2
Conc
entra
ção
final
(M)
G3P
DHAP
Glic
Quando V1/V2 < 0, 5, o sistema é robusto e as curvas das concentrações dos metabólicos possuem pouca inclinação e são paralelas entre si
No entanto, para V1/V2 >0,5, teremos as curvas com coeficientes angulares altos..
A partir da proporção 1:2 entre as velocidades da primeira e da segunda reação ,teremos diminuição de dihidroxiacetonafosfato.
É crescente para GLIC e G3P, ao decorrer do tempo de 10s, e decresce para o DHAP
Glicerol quinase (GK) é reversível.
Resultados
G3P pode também dar origem a triacilgliceróis pela via do ácido fosfatídico. Supondo que G3P dehidrogenase tenha uma expressão muito menor que GK (V2<V1), haverá acúmulo de G3P, que então seria convertido a triacilgliceróis ou a glicerol pela ação de GPP.
glicerol fosfatase, GPP exerce a “reversão” da fosforilação efetuada pela GK.
GK e GPP teriam as mesmas propriedades cinéticas, gerando um equilíbrio entre glicerol e G3P.
No nosso modelo biológico (infecção de M. perniciosa no cacaueiro), ocorre acúmulo de glicerol (Scarpari et al., 2005)
Esse glicerol “em excesso” provavelmente é convertido rapidamente a G3P. A partir desse ponto, G3P pode ser utilizado para a produção de DHAP que no fim do processo gerará G3P, metabólito da via glicolítica.
Análise do comportamento da via modelada no contexto do metabolismo lipídico
Apresentação do projeto
Motivação
Etapas do projeto
Cura de vias metabólicas
Resultados e Conclusão
Perspectivas
Ampliar o número de vias metabólicas modeladas e refinar todos os nossos modelos para que possa ser possível avaliar a metodologia aplicada e realizar a interpretação bioquímica da patogênese
Perspectivas
Indicar futuros experimentos funcionais no laboratório
Trabalho atual....
Modelagem do Metabolismo Central de Nitrogênio (CNM)
α-cetoglutarato Glutamato Glutamina
NAD+NADH + NH4
+
GOGAT (-2,11)
GS (-2,08)NADPH-GDH
NAD-GDH (3,6)
NH4+ + ATP
ADP + Pi
Legenda:
Reprimido biotrófico
Via metabólica do CNM
Induzido biotrófico
Dúvidas ?