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Universidade Estadual Paulista UNESP
Jlio de Mesquita Filho
Faculdade de Cincias e Tecnologia de Presidente Prudente
Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Materiais - PosMat
CARACTERIZAO DOS CONSTITUINTES DO
LTEX E DA BORRACHA NATURAL QUE
ESTIMULAM A ANGIOGNESE
Deuber Lincon da Silva Agostini
Orientador: Prof. Dr. Aldo Eloizo Job
Presidente Prudente2009
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Deuber Lincon da Silva Agostini
CARACTERIZAO DOS CONSTITUINTES DO LTEX
E DA BORRACHA NATURAL QUE ESTIMULAM AANGIOGNESE
Dissertao apresentada como requisito obteno do ttulo de Mestre UniversidadeEstadual Paulista Jlio de Mesquita Filho Programa de Ps-Graduao em Cincia eTecnologia de Materiais, rea de concentrao deMateriais Polimricos, Hbridos e Nano-Estruturados, sob orientao do Prof. Dr. AldoEloizo Job.
Presidente Prudente2009
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Agostini, Deuber Lincon da Silva.A221c Caracterizao dos constituintes do ltex e da borracha natural
que estimulam a angiognese / Deuber Lincon da SilvaAgostini. - Presidente Prudente : [s.n], 2009.
v, 87 f. : il.
Dissertao (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,Faculdade de Cincias e Tecnologia
Orientador: Aldo Eloizo JobBanca: Ana Maria Pires, Gabriel Pinto de SouzaInclui bibliografia
1. Ltex. 2. Borracha natural. 3. Isopreno. 4. Angiognese.I. Autor. II. Ttulo. III.Presidente Prudente - Faculdade de Cincias eTecnologia.
CDD(18.ed.) 620.11
Ficha catalogrfica elaborada pela Seo Tcnica de Aquisio eTratamento da Informao Servio Tcnico de Biblioteca e
Documentao - UNESP, Cmpus de Presidente Prudente.claudia@fct.unesp.br
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tux vxxwx tw xv|A gx { xx| x xwxvxtw xv| wx t |A gt yt x x t x w||z|t xt |wtx x wxt t tt x xv|tt tt tA
Dedico este trabalho e toda a minha vida a estas pessoas
especiais que sempre acreditaram que poderamos, atravs demuito trabalho, dedicao, confiana e respeito mtuo,melhorar nossas condies de vida.
Dourival Ftima F- Flvia Diego - Clia.
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Agradecimentos
a vt|{ x vtt w|tx wx |wxt vA ct|{t vtwt wxvuxt? wxty| x v|tAW||w| xw? |vxxt x |xzttAAA `t t x|t? yt x txz|tAAA ft xxt t| txt |{t }twtA T x tw? t |x|x| {t wx xw? t |x w|wt x
w|t wx xx vtt yt t| yx|xA [}x? t t|twx x t t| yx x xutt x t yAbu|ztw? t|z? t |xxvx |{t yt? t tztwx |{t xv{tMtuxzt? wxw|vt? xxztA bu|ztw t wvx x ytv|tx txw|tw wt |wtA
Agradeo a minha famlia, Dourival, Ftima F, Flvia e Diego por acreditarem que
seria capaz de chegar a esta etapa, e pelos intensos conflitos que encontrei durante esta
jornada. A Clinha, que j faz parte da famlia a um bom tempo, obrigado por ter me
suportado por todo este tempo.
Ao Prof. Dr. Aldo Eloizo Job pela orientao neste trabalho e grande amizade. Pessoa
que tem o poder de cativar a todos e mudar a vida destas, mostrando um mundo muitomelhor. Dizem que bares no um lugar para quem quer procurar uma vida melhor,
mas se naquele ano de 2001, se no tivesse ido at o bar Marlia em Adamantina-SP
no teria conhecido esta pessoa maravilhosa, que mudou drasticamente a minha vida.
A ngela, esposa do Prof. Aldo, que sempre dava conselhos e motivao para seguir
este caminho. Agradeo tambm aos seus filhos Neto e Pepe.
Ao Prof. Dr. Giacometti pelos conhecimentos, amizade e orientao provisria
enquanto o Prof. Dr. Aldo estava realizando Ps-doutorado em Windsor-Canad.
A banca, Prof. Dr. Ana Maria Pires e Prof. Dr. Grabriel de Souza Pinto, pelo tempodedicado a correo de minha dissertao e pela contribuio na melhoria da qualidade
deste trabalho. Toda a minha considerao e amizade.
As secretrias Andressa (PosMat) e Juvanir (DFQB) pela alta eficincia e rapidez
quando precisvamos de algum documento, sempre de ultima hora.
Ao Prof. Dr. Carlos Jos Leopoldo Constantino (Cas) pela amizade, contribuio em
minha formao desde a iniciao cientifica e pelo suporte tcnico nas medidas de
Raman.
A Prof. Dr. Maria de Lourdes Corradi Custodio da Silva e seu aluno Nilson pela
caracterizao de protenas e discusso do resultado do mtodo de Bradford.
Ao Prof. Dr. Eduardo Ribeiro de Azevedo, da USP de So Carlos, pelo auxilio nas
medidas e discusses dos resultados de RMN.
Ao Prof. Dr. Adonilson dos Reis Freitas pelas medidas auxilio nas medidas e
discusses dos resultados de MEV.
Ao Prof. Dr. Pedro Iris pelas medidas de AFM.
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Ao Instituto de Fsica de So Carlos (USP) pelas medidas de raios x.
A Prof. Dr. Dbora Terezia Balogh que realizou as medidas de DMA em uma
velocidade relmpago, pois nosso equipamento estava com problemas.
Aos Professores do DFQB: Ana Maria, Carlitos, Eduardo, Francisco, Roberto, Silvio,
Tot, que tornaram o dia-a-dia no departamento muito melhor.Aos Professores da FAI: Dr. Alexandre Teixeira de Souza, Dr. Fabio Cezar Ferreira,
Dr. Patrcia Alexandra Antunes, pelas caronas, Luclia-Presidente Prudente, e pela
amizade conquistada nestes anos. Toda a minha considerao e amizade.
Aos amigos do DFQB, Aninha, Carol, Clebo, Dalton, Diogo, Efraim, Elton, Felipe,
Flavinho, Lenine, Makoto, Pirap, Priscila, Igor, Zanfa e outros igualmente
importantes, pela amizade e convivncia.
Aos amigos a Balo Mgico, Caito, da Ponta, Diogaum, Julhaum, Luizo, Paulim,
Pedro, pela hospedagem no perodo em que no havia sido contemplado com a bolsa,pelos churrascos e festas. Sem eles teria terminado esta dissertao a algum tempo.
Agradeo tambm aos amigos de Luclia, onde muitos por l no est mais, Botim,
Dudu, Duzo, Junin, Z Roberto, Boco, Lukinha, Guerinha, Fernando, os Vacari pelos
interminveis churrascos e carnavais e pela grande amizade que mesmo a distncia no
consegue terminar.
Agradeo a FAPESP e ao IMMP/MCT, pelo apoio financeiro, pois sem estas
instituies este trabalho no poderia ser realizado.
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SUMRIO
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................I
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... III
RESUMO .....................................................................................................................IV
ABSTRACT...................................................................................................................V
INTRODUO............................................................................................................. 1
OBJETIVOS................................................................................................................. 6
CAPTULO 1 - REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................. 7
1.1 - Polmeros...................................................................................... 7
1.2 - Ltex e Borracha Natural............................................................... 8
1.2.1 - Composio do ltex...........................................................11
1.2.1.1 - Partculas de borracha..............................................121.2.1.2 - Lutides e complexos de Frey-Wyssling ...................13
1.2.1.3 - Soro e constituintes inorgnicos ...............................14
1.2.2 - Clone RRIM 600..................................................................15
1.2.3 - Preservao do ltex...........................................................15
1.3 - Biomateriais..................................................................................16
CAPTULO 2 - MTODOS EXPERIMENTAIS.............................................................18
2.1 - Materiais.......................................................................................18
2.2 - Coleta do Ltex ............................................................................18
2.3 - Ltex Centrifugado .......................................................................192.4 - Preparao das Membranas de Borracha Natural........................20
2.5 - Liofilizao....................................................................................21
2.6 - Mtodos de Caracterizao..........................................................22
2.6.1 - Espectroscopia por FT-IR modo ATR..................................23
2.6.2 - Espectroscopia Raman .......................................................24
2.6.3 - Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)..............................25
2.6.4 - Difrao de raios X (DRX)...................................................26
2.6.5 - Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)........................26
2.6.6 - Microscopia de Fora Atmica (AFM) .................................28
2.6.7 - TG acoplado com infravermelho (TG/FT-IR) .......................29
2.6.8 - Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) ........................30
2.6.9 - Anlise Dinmico Mecnico (DMA) .....................................30
2.6.10 - Mtodo de Bradford...........................................................31
CAPTULO 3 - RESULTADOS E DISCUSSO...........................................................32
3.1 - Espectroscopia no infravermelho (FT-IR) no modo ATR...............32
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3.2 - Espectroscopia Raman.................................................................37
3.3 - Ressonncia magntica nuclear (RMN) .................... ...................38
3.4 - Difrao de raios X (DRX) ............................................................42
3.5 - Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV).................................43
3.6 - Microscopia de Fora Atmica (AFM)...........................................45
3.7 - Anlise Termogravimtrica (TG)...................................................47
3.8 - TG acoplado com FT-IR ...............................................................52
3.9 - Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC)..................................70
3.10 - Anlise Dinmico Mecnico (DMA) ............................................71
3.11 - Mtodo de Bradford....................................................................73
CAPTULO 4 - CONCLUSO......................................................................................76
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................81
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Lista de Figuras
Figura 1 - Estrutura qumica da parte isoprnica da borracha natural. ............................ 10Figura 2 Modelo de uma partcula de borracha em ltex envolvida por uma camada de
fosfolipdio e outra mais externa de protenas, proposto por Blackley. Adaptado de [6]... 13Figura 3 - Coleta do Ltex................................................................................................... 19Figura 4 Trs fases constituintes do ltex centrifugado................................................... 20Figura 5 Curva de DSC para resfriamento e aquecimento do ltex................................. 22Figura 6 Analisador Temogravimtrico NETZSCH modelo 209...................................... 29Figura 7 - Espectros na regio do infravermelho das amostras de ltex, F1, F2, F3, e das
membranas de borracha natural tratadas termicamente a 60, 85 e 120C, liofilizados. .... 33Figura 8 Ampliao dos espectros na regio do infravermelho das amostras de ltex, F1,
F2, F3, e das membranas de borracha natural tratadas termicamente a 60, 85 e 120C,liofilizados............................................................................................................................ 35Figura 9 Espectros Raman das amostras de Ltex, F1, F2, F3 e das membranas tratadastermicamente a 60, 85 e 120
oC, liofilizados......................................................................... 37
Figura 10 Espectro de RMN13
C DP/MAS das amostras F1, F3 e das membranas tratadasa 60, 85 e 120
oC................................................................................................................... 39
Figura 11 - Espectro de RMN13
C CP/MAS das amostras F2, F3 e das membranas tratadas
a 60, 85 e 120oC................................................................................................................... 40
Figura 12 - Espectro de RMN 1H das amostras F1, F3 e das membranas tratadas a 60, 85 e
120oC.................................................................................................................................... 41
Figura 13 Difrao de raios X das fraes F2 e F3, liofilizadas. .................................... 42Figura 14 Micrografia da membrana de borracha natural tratada a 60C..................... 43Figura 15 - Micrografia da membrana de borracha natural tratada a 85C. .................... 44Figura 16 - Micrografia da membrana de borracha natural tratada a 120C ................... 45Figura 17 Micrografias por AFM das membranas tratadas a 60, 85 e 120
oC................. 46
Figura 18 Curvas de TG e DTG do ltex, das fases, F1, F2 e F3, e das membranasproduzidas a 60, 85 e 120C, liofilizados............................................................................. 48Figura 19 Imagem 3D de TG/FT-IR acoplado do ltex liofilizado. ................................. 53Figura 20 - Espectros extrados da imagem de 3D do TG/FT-IR do ltex liofilizado......... 54Figura 21 Imagem 3D de TG/FT-IR da F1 do ltex centrifugado e liofilizado................ 55
Figura 22 - Espectros extrados da imagem de 3D de TG/FT-IR da F1 do ltexcentrifugado......................................................................................................................... 56Figura 23 Imagem 3D de TG/FT-IR da F2 do ltex centrifugado e liofilizado................ 57Figura 24 - Espectros extrados da imagem de 3D de TG/FT-IR da F2 do ltex
centrifugado e liofilizado. .................................................................................................... 58Figura 25 Imagem 3D de TG/FT-IR da F3 do ltex centrifugado e liofilizado................ 59Figura 26 - Espectros extrados da imagem de 3D de TG/FT-IR da F3 do ltexcentrifugado e liofilizado. .................................................................................................... 60Figura 27 Imagem 3D de TG/FT-IR para a membrana de borracha natural obtida a 60C
liofilizada. ............................................................................................................................ 61Figura 28 - Espectros extrados da imagem de 3D do TG/FT-IR da membrana de borrachanatural obtida a 60C liofilizada.......................................................................................... 62Figura 29 - Imagem 3D de TG/FT-IR para a membrana de borracha natural obtida a 85C
liofilizada. ............................................................................................................................ 63Figura 30 Espectros extrados da imagem de 3D do TG/FT-IR da membrana de borrachanatural obtida a 85C liofilizada.......................................................................................... 64Figura 31 Imagem 3D de TG/FT-IR para a membrana de borracha natural obtida a120C liofilizada................................................................................................................... 65Figura 32 - Espectros extrados da imagem3D de TG/FT-IR para a membrana de borracha
natural obtida a 120C liofilizada........................................................................................ 66Figura 33 Absorbncia versus Temperatura (
oC), em 1643 cm
-1 para a amostra F2 e
membranas tratadas a 60 e 120oC....................................................................................... 67
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Figura 34 - Absorbncia versus Temperatura (oC), em 1588 cm
-1 para a amostra F2 e
membranas tratadas a 60 e 120oC....................................................................................... 68
Figura 35 - Absorbncia versus Temperatura (oC), em 1544 cm
-1 para a amostra F2 e
membranas tratadas a 60 e 120oC....................................................................................... 69
Figura 36 - Curva de DSC da amostra de ltex, F1, F2, F3 e das membranas de borracha
natural tratadas termicamente a 60, 85 e 120C, liofilizados.............................................. 70Figura 37 Curva de DMA das membranas tratada a 60, 85 e 120
oC............................... 72
Figura 38 Curva de Calibrao com BSA. ....................................................................... 74
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Lista de Tabelas
Tabela 1 - Composio mdia do ltex recm coletado. ..................................................... 12Tabela 2 - Principais modos vibracionais do cis 1,4-poli-isopreno.................................... 34Tabela 3 Atribuies das bandas nos espectros de FT-IR para grupos funcionais
observados nas amostras de ltex, F1, F2, F3, e das membranas de borracha naturaltratadas termicamente a 60, 85 e 120C, liofilizados. ......................................................... 36Tabela 4 Valores obtidos por meio das curvas termogravimtricas, das fases, F1, F2 e F3do ltex centrifugado e liofilizado........................................................................................ 51Tabela 5 - Atribuies das bandas caractersticas nos espectros de FT-IR extrados da
imagem 3D do ltex liofilizado. ........................................................................................... 54Tabela 6 Massa e volume de BSA para a curva de Calibrao........................................ 73Tabela 7 Valores da absorbncia para cada diluio do soro......................................... 74
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AGOSTINI, Deuber Lincon da Silva. Caracterizao do ltex e da borrachanatural que estimulam a angiognese: 2009. 87 f. Dissertao (Mestre emCincias e Tecnologia de Materiais) UNESP, Faculdade de Cincias eTecnologia, Presidente Prudente, 2008.
RESUMO
As membranas de borracha natural so usadas freqentemente como material
biolgico na induo de angiognese e neoformao. Neste trabalho foram
realizados estudos com objetivo de identificar os componentes do ltex que so
responsveis pelo processo de angiognese e neoformao. O ltex, as fases
centrifugadas do ltex e as membranas da borracha natural, tratados termicamente
em 60, 85 e 120C, foram liofilizados para a reduo de gua nos mesmos. A
caracterizao de tais materiais foi realizada por espectroscopia infravermelha (FT-
IR), micro-Raman, ressonncia magntica nuclear (NMR -
1
H e
13
C), difrao deraio x (DRX), microscopia eletrnica de varredura (MEV) e microscopia de fora
atmica (AFM), anlise do termogravimtrica (TG) acoplado com infravermelho
(TG/FT-IR), calorimetria exploratria diferencial (DSC), anlise dinmico mecnica
(DMA) e o mtodo de Bradford. Nos resultados de espectroscopia no
infravermelho, micro de Raman, NMR (1H e 13C), de raios x e TG/FT-IR; os
componentes qumicos do ltex, das fases centrifugadas do ltex e das membranas
da borracha natural foram identificados. A tcnica de TG foi utilizada para avaliar a
estabilidade trmica e os resultados mostraram que as membranas obtidas a 60oC
possuem maior estabilidade. Nos resultados de DSC notou-se que a transio vtrea
acontece em ~ -68oC, para todos os materiais que contm isopreno e a degradao
estrutural ocorrem em torno de 376oC. As transies de vtreas foram confirmadas
atravs dos resultados de DMA. O ltex centrifugado apresenta trs fases: partculas
de borracha (F1), lutides (F2) e Frey-Wyssling (F3). Nas fraes F2 e F3 o
isopreno ausente, ou apresenta pequena proporo, mas contm diversos
componentes qumicos: protenas, cidos aminados e grupos funcionais que podem
induzir o angiognese e a neoformao em tecidos biolgicos. A membrana de
borracha natural tratada termicamente a 60oC, juntamente com a frao F2, mostrou
as atividades mais elevadas de angiognese e neoformao. Alm disso, as
membranas que contm poros favorecem o processo de cicatrizao e
vascularizao.
Palavras-chave:ltex, borracha natural, isopreno, angiognese.
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v
ABSTRACT
Natural latex and natural rubber membranes are frequently used as biomaterial in
the angiogenesis induction and neoformation of biological tissues. Our studies
aimed to study and identify the latex components that are responsible forangiogenesis and neoformation processes. The natural latex, the centrifuged latex
phases and the natural rubber membranes were thermally treated at 60, 85 and
120C and afterward all samples were lyophilized. The characterization of such
materials were carried out using infrared (FT-IR), micro Raman spectroscopy,
nuclear magnetic resonance (NMR - 1H e 13C), X-ray diffraction, scanning
electronic microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM),
thermogravimetry analysis coupled with infrared (TG/FT-IR), differential scanning
calorimeter (DSC), dynamic mechanical analysis (DMA) and the method of
Bradford. From the results of infrared and micro Raman spectroscopy, NMR (1H e13C), X-rays and TG/FT-IR the chemical components present in the latex, in the
centrifuged latex phases and in natural rubber membranes were identified. TG
technique was used to evaluate the thermal stability and results showed that
membranes obtained at 60oC present greater stability, up to 350oC. From DSC
results it was found that the glass transition happens at 68oC, for all materials
containing isoprene, and the structural degradation occurs at 376oC. Glass
transitions were confirmed also by DMA results. Centrifuged latex presents three
phases: rubber particles (F1), lutoids (F2) and Frey-Wyssling (F3). In the fractions
F2 and F3 the isoprene is absent but they contain several chemical components:
proteins, amino acids and functional groups that can induce angiogenesis and
neoformation on biological tissues. The treated membrane 60oC of natural rubber
showed the highest angiogenesis and neoformation activities. Furthermore,
membranes containing pores favor the cicatrization process and the vascularization
processes.
Keywords: latex, natural rubber, isoprene, angiogenesis.
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Introduo_______________________________________________________ 1
INTRODUO
As primeiras informaes que se tem sobre a descoberta da
Borracha Natural, data de 1743, quando em sua segunda viagem Amrica do Sul,
Cristvo Colombo viu nativos do Haiti brincando com bolas que eles faziam com
uma seiva de cor branca leitosa extrada de rvores, que os nativos chamavam de
Cau-uchu, que na lngua nativa significa a rvore que chora. Em 1745, Charles de
La Condamine apresentou e publicou os primeiros documentos referentes
borracha natural, depois de fazer muitas observaes nas amostras do material
trazido do Peru em 1736.
A reao de vulcanizao foi descoberta por Charles Goodyear em
1839 que percebeu uma sensvel mudana no estado fsico da borracha natural, de
muito plstica para elstica quando a esta era adicionado enxofre. Aps a descoberta
da vulcanizao, rapidamente a demanda de artigos feitos de borracha cresceu
muito, sendo que basicamente os produtos eram produzidos a partir da borracha
natural vinda da regio Amaznica no Brasil.
Em 1876 Henry Wiekham em sua viagem a Amrica do Sul
coletou aproximadamente 70.000 sementes das rvores produtoras do ltex de
borracha natural,Hevea brasiliensis,levando-as para a Europa e em seguida para a
sia, sendo que dez anos depois j produziam sementes em abundncia e ltex de
tima qualidade [1].
Atualmente, a borracha natural uma importante matria-prima
agrcola renovvel essencial para a manufatura de um amplo espectro de produtos
em todos os ramos da atividade humana. Considerado um produto estratgico, ao
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Introduo_______________________________________________________ 2
lado do ao e do petrleo (matrias-primas no renovveis), um dos alicerces que
sustentam o progresso da humanidade [2].
No mbito dos pases produtores, observa-se que o governo da
Malsia investe maciamente em borracha natural e a qualidade da borracha natural
produzida atende aos padres tecnolgicos mais exigentes das indstrias de
pneumticos e de artefatos, conferindo alta qualidade aos artefatos.
J se sabe que o ltex de seringueira apresenta algumas
propriedades nicas, superiores a qualquer outro polmero, mesmo seu anlogo
sinttico. A boa elasticidade, combinada com a baixa histerese mecnica, faz da
borracha natural um material importante na produo de pneus, elementos de
suspenso e pra-choques [3] e produtos leves com alta resistncia como bales,
luvas cirrgicas, preservativos [4] e em inovaes tecnolgicas como o seu uso em
argamassas para construo civil, indstria aeronutica e naval, tubos para usos em
hospitais e centros cirrgicos, compsitos condutores e materiais de alta preciso
como vlvulas e retentores. Existem inmeras patentes registradas a respeito de
artefatos de borracha natural, vrias dessas patentes so de propriedades de
empresas lderes mundiais [5,6].
Em meados da dcada de 90 iniciaram-se estudos para aplicaes
de ltex natural na rea da sade, onde ltex extrado dos clones da seringueira
Hevea brasiliensisse mostrou promissor em vrios tipos de aplicaes biomdicas
[4].
Estudos iniciais, obtidos pelo Laboratrio de Neuroqumica do
Departamento de Bioqumica e Imunologia da Universidade de So Paulo-USP de
Ribeiro Preto atravs da equipe de pesquisadores coordenados pelo Professor Dr.
Joaquim Coutinho Netto, mostraram que as membranas de borracha natural obtidas
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Introduo_______________________________________________________ 3
a temperaturas inferiores a 85C contribuem para a formao de angiognese e de
neoformao. Portanto, a temperatura de tratamento do ltex, na obteno das
membranas, o fator mais importante, pois a evaporao a baixa temperatura
preserva a conformao nativa das protenas e uma reorganizao dos constituintes
fosfolipdicos [7].
A atividade angiognica encontrada em alguns trabalhos que
estudaram as membranas de borracha natural de grande importncia, j que nas
ltimas dcadas vrios estudos foram realizados, com diversos materiais [8-17], no
sentido de se identificar substncias capazes de favorecer o processo de reparo, e
tambm a busca de substncias com atividade angiognica, pelo seu grande
potencial de aplicao clnica.
Desde sua descoberta como biomaterial, as membranas de
borracha natural, tem sido objeto de vrios estudos, sendo suas propriedades fsicas,
microarquiteturais e de biocompatibilidade determinadas inicialmente em modelos
animais, encontrando-se atualmente em fase de utilizao em humanos [18]. Este
material demonstrou ser a base de um biomaterial inovador com excelentes
resultados na cicatrizao de lceras crnicas e na reconstituio de esfagos e
tmpanos perfurados, observando a neoformao vascular evidente ao redor das
prteses, mostrando a possibilidade de neoformao tecidual [19,20], sendo que a
biocompatibilidade do ltex natural, em forma de prtese esofgica, foi investigada
e constatada, no demonstrando qualquer indcio de manifestao alrgica [21,18 ].
A biomembrana de ltex natural foi utilizada em 420 pacientes do
Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto-USP, portadores
de perfurao de tmpano, com sucesso em 98% versus 70% quando comparado
com a cirurgia convencional (implante da fscia do msculo temporal) [20]. Em
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Introduo_______________________________________________________ 4
estudos onde foi implantada a membrana de borracha natural no esfago e na parede
abdominal de ces, sendo removida uma rea de 6 a 10 cm2de tecido e substitudo
cirurgicamente por esta membrana, foi observado o poder de induo da
angiognese, bem como a promoo da adeso celular e a formao de matriz
extracelular provisional favorecendo o processo de reparao tecidual, no sendo
observado o desenvolvimento de fibrose em qualquer dos casos estudados [22].
O comportamento da membrana de borracha natural tambm foi
estudado como substituto parcial do pericrdio em 16 ces. Os animais foram
observados por 345 dias, e aps este perodo ocorreu a regenerao do pericrdio
nativo, demonstrando que o material mostrou-se adequado para a substituio
parcial do pericrdio [23]. Outro fator interessante que apesar de a sensibilidade
ao ltex ou aos seus aditivos ser um fenmeno freqente [24], os autores no
observaram em nenhum animal qualquer reao adversa.
Prteses de borracha natural foram utilizadas em diferentes
tecidos, apresentando resultados satisfatrios como prtese arterial [25]. Com o
xito das aplicaes da membrana em modelos animais, sua utilizao em humanos
foi iniciada em leses cutneas, onde foram realizados tratamentos de lceras de
perna com a utilizao da membrana de borracha natural [18]. Os pacientes eram
portadores de lceras com mais de 2 meses de instalao e maiores que 1 cm. Os
autores observaram sinais evidentes de estmulo granulao visualizada sob o
aspecto clnico e com confirmao histopatolgica, associada reduo dos
sintomas, especialmente da dor nas lceras crnicas de perna. Foi observado
tambm que a membrana de borracha natural induz a diferenciao do tecido de
cicatrizao, com aumento da deteco de fatores de crescimento como VEGF e
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Introduo_______________________________________________________ 5
TGF1, com o aumento da permeabilidade vascular que organiza a angiognese j
na 1 semana de tratamento.
Duas teses de doutorado, desenvolvidas no Departamento de
Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP, apontaram, depois de testes feitos em animais,
que possvel a recuperao de artrias cardiovasculares por meio de utilizao de
membranas de borracha natural [26].
Pesquisas recentes descobriram que o ltex de borracha natural
pode ser aplicado como um poderoso gel anti-rugas e possvel aplicao para
estimular a produo de cabelos, resultado de trabalhos desenvolvidos por
universidades e empresas nacionais. Neste tratamento houve uma reduo em cerca
de 80% das rugas na regio da testa e dos olhos, em apenas um ms [27].
Foi observado que membrana de borracha natural favorece a
cicatrizao conjuntival e a angiognese quando submetida a testes in vivo
utilizando a conjuntiva ocular em coelhos, demonstrando que o material
potencialmente um promissor recurso teraputico de reconstruo da conjuntiva
ocular [28].
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Objetivos________________________________________________________ 6
OBJETIVOS
Atravs dos estudos realizados, at o momento, sobre as
membranas de borracha natural utilizadas como biomaterial na induo deangiognese e de neoformao, notrio que este material deve ser amplamente
estudado, tanto em aplicaes clnicas, como os seus componentes indutores.
Portanto neste trabalho, est sendo apresentado estudos de caracterizao do ltex in
natura, das fases do ltex centrifugado e das membranas de borracha natural,
tratadas termicamente a 60, 85 e 120C, liofilizados, utilizando as tcnicas de
espectroscopia no infravermelho (FT-IR), Raman, Ressonncia Magntica Nuclear
(RMN), Difratometria de raios-X, microscopia eletrnica de varredura (MEV) e de
fora atmica (AFM), TG acoplado com FT-IR (TG/FT-IR), calorimetria
exploratria diferencial (DSC), anlise dinmico mecnico (DMA) e o mtodo de
Bradford, com objetivo de conhecer e dominar seus componentes indutores de
angiognese e de neoformao.
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Reviso Bibliogrfica_______________________________________________7
CAPTULO 1 - REVISO BIBLIOGRFICA
1.1 - Polmeros
O termo polmeros deriva do grego, Polys = muitos; Meros =
unidades de repetio, portanto significa muitas unidades de repetio, foi criada
por Berzelius, em 1832, para designar compostos de pesos moleculares mltiplos
[29]. Polmeros so substncias de alto peso molecular proveniente de reaes de
polimerizao. Isto , so provenientes da combinao qumica de um grande
nmero de molculas idnticas ou similares (monmeros) para formar uma
molcula complexa de elevado peso molecular (macromolcula). Podem ser
homopolmeros, polmeros formados por monmeros de um nico tipo de
substncia, ou copolmeros, polmeros formados por duas ou mais substncias [30].
H diversas formas de classificao dos polmeros, que
geralmente so apresentados em trs grandes categorias: termoplsticos, termofixos
e elastmeros. Esses materiais so usados amplamente em todas as reas da
engenharia, devido sua extrema versatilidade. Como exemplo de aplicao de
polmeros, citamos o uso em bases de tintas, adesivos, pneus, pra-choques de
automveis, fibras e recobrimentos de fibras ticas, de fios de alta tenso e esta
multiplicidade de aplicaes derivam essencialmente da sua facilidade de
processamento, aliado ao seu relativo baixo custo [31].
Em termos de materiais para implantes, os polmeros apresentam
uma boa alternativa, visto que, possuem propriedades mecnicas desejveis. Por
exemplo, Fukada et al. trabalhando com teflon implantado no fmur de coelhos,
constataram a formao de calo sseo em apenas duas semanas [32]. No entanto,
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Reviso Bibliogrfica_______________________________________________8
apesar de apresentar qualidades desejveis para agir como um biomaterial, se o
polmero apresentar toxidade, o processo inflamatrio se mostrar muito acentuado
provocando necrose no tecido receptor. Geralmente a toxicidade dos polmeros
considerada maior que a dos metais e das cermicas. A presena de cargas
superficiais no polmero outro fator que influencia a formao do tecido fibroso.
No caso de carga superficial positiva pode atrair eritrcitos, que possuem carga
superficial negativa; e o contato das clulas com o material potencialmente
citotxico pode destru-las [33].
1.2 - Ltex e Borracha Natural
A seringueira uma planta da famlia das Euforbiceas, que
abrange uma gama de espcies com grande interesse comercial como, por exemplo,
a mamona (Ricinus communis L.), o tungue (Aleurites) e a mandioca (Manihot)
[4,34]. Numerosas espcies botnicas espalhadas pelo planeta produzem ltex,
ocorrendo no reino das plantas em mais de 12.000 espcies pertencentes a 900
gneros. Dessas plantas laticferas aproximadamente 1.000 espcies contm
borracha [35]. Entretanto, a nica espcie que gera borracha de alta qualidade e em
condies econmicas a Hevea brasiliensis. Originria da regio setentrional da
Amrica do Sul foi climatizada em 1890 no Sri Lanka (antigo Ceilo) e na Malsia
[36]. Hoje em dia a Hevea brasiliensis cultivada nas regies tropicais da sia
(Malsia, Indonsia, Tailndia e Sri Lanka), onde 90% da produo mundial
extrada [37].
O Brasil j foi o principal produtor e exportador de borracha no
mundo, at os anos cinqenta, hoje produz apenas cerca de 1% da produo
mundial, o que insuficiente para o consumo interno, sendo necessria a
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Reviso Bibliogrfica_______________________________________________9
importao de aproximadamente 60% da borracha consumida no pas [38,39,40,41].
Contudo, o interesse pela produo de borracha natural est sendo recuperado, com
o Estado de So Paulo atuando como o maior produtor do pas [42,43]. O Estado de
So Paulo conta hoje com cerca de 45.000 hectares plantados com seringueira. Duas
regies do Estado so aptas para o cultivo desta planta: a regio do Oeste Paulista e
a regio litornea [38,42].
O ltex um sistema coloidal polifsico, sendo a parte dispersa
constituda de micelas de borracha, protenas, lutides e partculas Frey-Wyssling e
o meio dispersivo constitudo do soro aquoso [44]. As partculas Frey-Wyssling,
que ocorrem em pequena quantidade (cerca de 1%), so constitudas de
carotenides e lipdios conferindo borracha uma colorao amarelada [35,56].
A borracha natural obtida por coagulao do ltex por rvores do
gneroHeveabrasiliensis, com cerca de 10 15 metros de altura, tronco retilneo,
com dimetro aproximado de 30 centmetros. As plantaes de seringueiras
apresentam uma densidade de aproximadamente 450 rvores por hectare e comeam
a produzir aps 7 a 8 anos de plantio. A obteno de espcies de alta produtividade
conseguida atravs de processos de enxertia de borbulhas, de rvores reconhecidas
como de alta produo, em mudas obtidas a partir de sementes; estas mudas, assim
enxertadas, so denominadas clones [45].
Embora a borracha sinttica obtida do petrleo possua quase a
mesma composio qumica da borracha natural, suas propriedades fsicas so
inviveis para alguns manufaturados, como por exemplo: para luvas cirrgicas,
preservativos, pneus de automveis e revestimentos diversos [42], alm de ser uma
fonte no renovvel. A borracha natural tambm matria prima essencial para a
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fabricao de vrios artefatos em transportes, indstrias e materiais blicos
[4,42,46].
O polmero natural sintetizado pela espcie Hevea tem um peso
molecular mdio prximo a um milho. composto de aproximadamente trs
unidades trans isoprnicas, responsvel pela parte cristalina, seguidas de cerca de
10.000 unidades cis isoprnicas, responsvel pela parte amorfa, do tipo cabea-
calda [47], combinadas por ligaes 1,4 e um grupo terminal, conforme mostrado
na Figura 1. Esse grupo terminal varia com a origem da borracha [35,48]. Como a
unidade de repetio da parte cis isoprnica existe em uma proporo muito maior
que a parte trans isoprnica a borracha natural se mostra um polmero amorfo.
Figura 1 -Estrutura qumica da parte isoprnica da borracha natural.
Os constituintes no borracha do ltex so protenas, aminocidos,
carboidratos, lipdios, cidos nuclicos e outros constituintes inorgnicos [49]. Os
principais componentes ao redor da membrana do ltex so os lipdios que
apresentam importante papel no tempo de estabilidade mecnica do ltex
estabilizado em amnia [50].
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1.2.1 - Composio do ltex
Este tpico sobre os constituintes do ltex foi retirado da Tese da
Profa. Dra. Marcia Maria Rippel [6], orientada pelo Prof. Dr. Fernando Galembeck,
vencedora do Premio CAPES de Melhor Tese na rea de Qumica, no ano 2005. Os
constituintes do ltex estavam muito bem descritos, por este motivo no foi
modificado ou resumido para no perder a qualidade apresentada e teve grande
contribuio nesta dissertao, pois foi possvel comparar com os resultados
obtidos.
O ltex composto por uma complexa mistura de diferentes
componentes, incluindo macromolculas. Um dos componentes majoritrios do
ltex o cis e/ou trans poli-isopreno. Outros constituintes presentes no ltex e
relatados em estudos fitoqumicos so: polissacardeos, flavanides, lipdeos,
fosfolipdios e protenas, ficou comprovado tambm a existncia de alcanos, cetonas
triterpnicas, triterpenides, acares e cidos graxos [51]. Sabe-se que o
polisopreno um dos componentes de todas as espcies laticferas, porm aelucidao dos outros constituintes necessita de estudos mais aprofundados [52].
O ltex de Hevea brasiliensis um sistema polidisperso, no qual
partculas negativamente carregadas de vrios tipos esto suspensas em um soro.
Trs tipos de partculas predominam: partculas de borracha que constituem 30 a
45% (em massa) do ltex, os lutides que constituem 10 a 20% e os chamados
complexos de Frey-Wyssling (FW) [apud. 53,6]. O soro no qual as partculas esto
dispersas chamado de soro C.
O ltex recm coletado tem pH na faixa de 6,0 a 7,0 e densidade
de 0,975 e 0,980 g/cm3e viscosidade varivel, principalmente se o ltex for diludo
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em gua em virtude do intumescimento e ruptura dos lutides [apud. 54,6]. A
composio mdia do ltex natural recm coletado apresentada na Tabela 1.
Tabela 1-Composio mdia do ltex recm coletado.
Constituinte % em massa no ltex
Borracha 25-45Protena 1-1,8
Carboidratos 1-2Lipdios neutros 0,4-1,1Lipdeos polares 0,5-0,6
Inorgnicos 0,4-0,6Aminocidos, aminas, etc. 0,4-0,6
gua 49-71
1.2.1.1 - Partculas de borracha
As partculas de borracha natural contm centenas de molculas
de hidrocarboneto e envolvida por um filme de protenas e fosfolipdios, que lhe
confere carga negativa promovendo estabilidade coloidal das partculas. O dimetro
das partculas de borracha pode variar de 5 nm at 3.000 nm, chegando em alguns
casos at a 5.000 nm ou 6.000 nm [apud. 55,56,57]. Aproximadamente 27% do
contedo total de protenas no ltex recm coletado esto adsorvidos na superfcie
das partculas de borracha e acredita-se que parte das protenas estejam no interior
das partculas [58,6]. Esta camada de protenas adsorvida que conferem
estabilidade as partculas de ltex estabilizado com amnia, devido a sua carga
negativa.
A presena de longas cadeias de hidrocarbonetos nas molculas de
fosfolipdios faz com que tenha forte atividade de superfcie, sendo fortemente
adsorvidos na superfcie das partculas de borracha: as cadeias de hidrocarbonetos
ficam ancoradas na borracha e os grupos de cabea polar na fase aquosa. Assim
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possvel explicar a forte adsoro de protenas na superfcie das partculas
considerando que os fosfolipdios tm carga positiva, enquanto as protenas tm
carga negativa, levando a associao inica entre dois tipos de molculas [6,54].
Assim podemos representar em um modelo proposto por Blackley [54], conforme a
Figura 2.
Figura 2 Modelo de uma partcula de borracha em ltex envolvida por uma camada defosfolipdio e outra mais externa de protenas, proposto por Blackley.
Adaptado de [6].
1.2.1.2 - Lutides e complexos de Frey-Wyssling
Os lutides formam o segundo componente principal do ltex de
Hevea brasiliensis. Eles so constitudos de protenas (solveis e insolveis),
fosfolipdios e sais minerais [54, apud. 59], ligados ou circundados por membranas
e so, na mdia, muito maiores em tamanho do que as partculas de borracha. Eles
tm de 2.000 a 5.000 nm de dimetro, ligados por uma membrana de cerca de 8 nm
de espessura tambm com carga negativa.
O contedo dos lutides chamado soro B, contm vrios ctions,
principalmente clcio, magnsio, potssio e cobre [apud. 60] e protenas catinicas
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que tem ao floculante muito rpida sobre partculas de borracha no ltex,
resultando na formao de microflocos.
Os complexos de Frey-Wyssling so constitudos de carotenides
e lipdios conferindo borracha sua colorao, mais ou menos amarela [54,58].
Estes complexos so aproximadamente esfricos, tendo um tamanho que varia de
3.000 a 6.000 nm de dimetro e so ligados por uma dupla membrana. Acredita-se
que estes complexos tenham uma funo vital nas atividades metablicas, sendo
possveis stios da biossntese da borracha.
Os lutides e complexos de Frey-Wyssling dissolvem quando o
ltex recm coletado estabilizado com amnia, de tal forma que temos no ltex
amoniacal um sistema de duas fases, constituindo das partculas de borracha e do
soro [5, apud.55].
1.2.1.3 - Soro e constituintes inorgnicos
O soro do ltex natural tem densidade de 1,020 g/cm3 e contm
diferentes espcies qumicas como carboidratos, eletrlitos, protenas e
aminocidos. O principal carboidrato encontrado o quebrachitol (ou 1-metil
inositol) e at o momento no se sabe qual a sua funo biolgica no ltex. A
principal implicao dos carboidratos no ltex que estes so oxidados
microbiologicamente a cidos volteis (frmico, actico e propinico) se o ltex no
adequadamente preservado e uma medida da qualidade do ltex [54].
O soro do ltex contm, alm de protenas, bases nitrogenadas
como colina, alm de aminocidos, nions inorgnicos (fosfatos e carbonatos), sais
minerais encontrados no soro B e mais outros de rubdio, mangans, sdio, potssio,
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cobre, magnsio, ferro e zinco [13,27]. Estes elementos so absorvidos do solo,
transportados na seiva e participam de reaes que envolvem a biossntese do ltex
[5].
1.2.2 - Clone RRIM 600
O ltex usado neste trabalho foi colhido de rvores da seringueira
Hevea brasiliensis, clone RRIM 600, o mais plantado na regio do Planalto do
Estado de So Paulo, por apresentar bom desempenho e vigor na produo. um
clone secundrio desenvolvido pelo Rubber Research Institute of Malaysia RRIM.Apresenta rvores altas, com caule vertical e de rpido crescimento quando jovem.
A alta produo seu ponto de destaque, sendo um dos que apresenta maior
produtividade de borracha seca [42].
Todas as rvores de um mesmo clone, sob as mesmas condies
ambientais, apresentam baixa variabilidade. Outro ponto importante a considerar no
clone a uniformidade das propriedades do ltex. Para propsitos industriais
especficos, ele mais bem apreciado, considerando essa uniformidade essencial
[42].
1.2.3 - Preservao do ltex
A estabilizao do ltex atravs de aditivos decorre da necessidade
de se evitar o processo de coagulao espontnea, em que se observa a formao de
uma fase superior coagulada e uma fase inferior aquosa e clara. Vrias hipteses
[54] explicam o porqu de este processo ocorrer rapidamente, em questo de horas.
A primeira considera a ao de microorganismos reagindo com compostos no
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borracha, diminuindo seu poder de estabilizao. A segunda hiptese atribui esse
efeito liberao de nions de cidos graxos atravs da hidrlise de vrias
substncias lipdicas presentes no ltex. Estes nions so ento adsorvidos na
superfcie das partculas de borracha, possivelmente removendo parte das protenas
adsorvidas. Estes nions ento interagem com ctions metlicos divalentes como
clcio e magnsio, presentes no ltex ou gradualmente liberados de complexos pela
ao de enzimas.
Dois fatos so considerados com estas teorias: o pH reduzido
durante a coagulao espontnea, de 6 para 5 e este processo pode ser acelerado
pela adio de pequenas quantidades de sabes carboxilados. Como se pode esperar,
grandes quantidades de sabo retardam este efeito de coagulao. Isto justificado
pela dependncia da concentrao de clcio e magnsio presentes no ltex. Alm
disso, o tempo no qual o ltex pode ser mantido sem coagular muito aumentado se
estes ctions so removidos.
O preservativo mais utilizado a amnia, quando se necessita
preservar o ltex a longo prazo, sem a adio de preservativos auxiliares. A amnia
um bactericida muito eficiente em concentraes acima de 0,35% em massa,
enquanto que baixas concentraes, 0,05% em massa, podem acelerar o crescimento
de bactrias, devido ao aumento do pH de 6,5 para 8, pH este ideal para a
multiplicao de muitas formas comuns de bactrias [6].
1.3 - Biomateriais
Um biomaterial definido como uma substncia ou combinao
de duas ou mais substncias, farmacologicamente inertes, de origem sinttica ou
orgnica, capaz de ser utilizado por um perodo de tempo, como parte ou todo de
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Reviso Bibliogrfica_______________________________________________17
um sistema, para melhorar, aumentar ou substituir, parcial ou inteiramente tecidos,
rgos ou funes do corpo humano [61,62]. A classificao dos biomateriais
depende da sua natureza qumica, dividindo-se em biomateriais naturais que se
subdividem homlogos (quando originados do prprio indivduo, como o caso das
pontes de safena), autlogos (quando originados de outras pessoas) e heterlogos
(quando originados de animais e aproveitados em implantes ou cirurgias) ou
biomateriais sintticos que incluem implantes cirrgicos, e que se dividem em
metlicos (ferrosos e no ferrosos), cermicos, polmeros e compsitos, e que
venham a substituir parcial ou integralmente a funo original dos materiais
biolgicos [63].
As principais caractersticas dos biomateriais so
biocompatibilidade, no ser txico nem carcinognico, apresentar bioestabilidade,
propriedades mecnicas adequadas, peso e densidade adequados, ter custo
relativamente baixo, ser reprodutvel e de fcil fabricao. Com a experincia no
uso destes materiais atravs dos anos, chegou-se a concluso que biomateriais
modernos no devem ter apenas a funo de preenchimento de espao [63]. Devem
estar associados a uma resposta biolgica particular, disparada por sinais originados
em nvel molecular que incluem: correntes eltricas, distribuio eletrnica,
conformao molecular, estado de agregao ou propriedades fsico-qumicas locais
particulares [64], caractersticas estas que podem ser introduzidas por arranjos
especiais de grupos funcionais sobre uma estrutura polimrica, reaes de
reticulao, propriedades particulares de superfcie e arranjos macromoleculares.
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Mtodos Experimentais_____________________________________________18
CAPTULO 2 - MTODOS EXPERIMENTAIS
2.1 - Materiais
Toda vidraria foi, primeiro, lavada antes de ser utilizada para cada
experimento, com soluo sulfocrmica, em seguida com gua e detergente neutro e
enxaguada em gua corrente. Por ltimo foi feito um enxge com gua deionizada
e seca em estufa.
2.2 - Coleta do Ltex
O ltex de borracha natural est contido no sistema de vasos
lactferos situados no crtex da rvore, formando um feixo helicoidal ascendente,
que leva o alimento para as partes superiores da rvore. Este sistema encontra-se
logo abaixo da casca da rvore, e os vasos apresentam uma inclinao para o ladodireito, no sentido vertical ascendente [2]. A Figura 3 mostra uma imagem da
sangria em meio espiral para a coleta do ltex.
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Mtodos Experimentais_____________________________________________19
Figura 3 - Coleta do Ltex.
O ltex foi extrado de diferentes rvores de seringueira, clone
RRIM 600, na Fazenda Indiana localizada na regio de Presidente Prudente-SP. A
sangria da rvore foi realizada com uma faca em forma de U, com a qual provoca-se
um corte, em dias alternados, com o comprimento igual metade da circunferncia
do tronco, iniciam-se cortes sucessivos a partir de uma altura de 1,20 m do solo, de
maneira a atingir convenientemente os vasos lactferos; o ngulo de 30 para
baixo, em relao a horizontal e, a cada corte remove-se cerca de 1,5 mm de crtex.
O ltex, de aspecto leitoso, foi armazenado em vidros escuros previamente limpos.
2.3 - Ltex Centrifugado
A centrifugao de longe o mtodo mais utilizado para
concentrar ltex natural, chegando a representar 90% de todo o ltex concentrado
utilizado industrialmente, pois um processo contnuo e econmico [65,54].
O ltex foi centrifugado em uma centrfuga da marca Fanem, tipo
Microhemato, modelo 2410. A centrfuga possui 24 tubos de 1,5 mL cada, uma
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Mtodos Experimentais_____________________________________________20
inclinao fixa de 45 e rotao mxima de 1400 rpm. A frao menos densa que a
gua contm partculas de borracha, migrando para a superfcie do tubo [66]. A
frao aquosa, logo abaixo da frao superior, um soro que contm ons,
protenas, carboidratos, acares e outras substncias solveis [66,67]. A frao de
fundo contm os lutides, organelas ricas em soro catinico, que promovem a
coagulao do ltex, alm de funes bioqumicas como o controle do pH e de
patgenos [4,68]. Portanto existem trs fases, conforme Figura 4, distintas
resultantes da centrifugao do ltex, estas fases esto representadas, neste trabalho
como:
Figura 4 Trs fases constituintes do ltex centrifugado.
F1 Fase superior, contendo partculas de borracha;
F2 Fase intermediria, sendo o soro do ltex;
F3 Frao de fundo, contendo os lutides.
2.4 - Preparao das Membranas de Borracha Natural
Os filmes de borracha natural foram preparados pelo mtodo de
casting de soluo lquida de ltex estabilizada com hidrxido de amnio
F1
F2
F3
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Mtodos Experimentais_____________________________________________21
(NH4OH). Na preparao dos filmes foram utilizadas placas de petri de 9,5 cm de
dimetro interno e de fundo reto, para obter filmes de espessura uniforme e
controlada. Ento a soluo de ltex foi depositada sobre a placa de petri, em
seguida a placa foi colocada em uma estufa, com temperatura mantida em 60, 85 e
120C, em um perodo de 6 horas, com sistema de exausto ligado, para evaporao
mais rpida do soro.
2.5 - Liofilizao
O ltex in natura, as fases do ltex centrifugado e as membranas
de borracha natural foram liofilizados utilizando-se um liofilizador Edwards modelo
E-C modolyo, gentilmente disponibilizado pela Profa. Dra. Maria de Lourdes
Corradi da Silva, do Departamento de Fsica, Qumica e Biologia da FCT - UNESP
de Presidente Prudente. As amostras foram expostas ao ar seco e congeladas pela
exposio a uma corrente de ar frio. A seguir, a gua do material foi removida aps
sofrer sublimao em uma cmara de vcuo, sendo retirada da mesma atravs de
uma bomba. O mtodo consiste no congelamento do produto sob vcuo, quando
ocorre sublimao.
Para confirmao da efetiva liofilizao do ltex foi realizado uma
medida de calorimetria exploratria diferencial (DSC), Figura 5, portanto o
processo de liofilizao foi bem sucedido, pois o resfriamento foi realizado a
temperatura de -35oC. H na literatura a discusses [69,70] sobre a diferena entre o
ponto de fuso e congelamento, onde sais presentes no material alteram estes
pontos, sendo que a concentrao destes sais aumentam a medida que a gua liquida
passa para de gelo, diminuindo o ponto de congelamento. No entanto foi realizada
uma medida de DSC para gua ultra pura e estes valores foram semelhantes aos
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Mtodos Experimentais_____________________________________________22
obtidos para o ltex, Figura 5, sendo que a presena de sais no ltex altera o ponto
de fuso e congelamento, mas no significantemente como consta na literatura.
Atravs destas medidas de DSC verifica-se que o ponto de congelamento e de fuso
no corresponde a um nico valor e sim a valores distintos.
-40 -30 -20 -10 0 10
0
2
4
6
8
-9oC
aquecimentoresfriamento
DSC
Temperatura (oC)
-24,2oC
exo
Figura 5 Curva de DSC para resfriamento e aquecimento do ltex.
O processo de liofilizao foi utilizado neste trabalho para
remover o excesso de gua presente nas amostras, pois o objetivo deste trabalho
identificar os componentes do ltex e da borracha natural e interfere no processo de
identificao destes constituintes do ltex.
2.6 - Mtodos de Caracterizao
Neste item so apresentados os mtodos utilizados para investigar
as caractersticas do ltex in natura, das fases do ltex centrifugado e das
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Mtodos Experimentais_____________________________________________23
membranas de borracha natural, tratadas termicamente a 60, 85 e 120C,
liofilizados.
2.6.1 - Espectroscopia por FT-IR modo ATR
Na Espectroscopia no infravermelho com Transformada de
Fourier a amostra colocada entre a sada do interfermetro e o detector. Como a
amostra absorve certos comprimentos de onda de luz, o interferograma contm o
espectro da fonte menos o espectro da amostra, ou, com menor intensidade nos
comprimentos absorvidos pela amostra [71].A tcnica conhecida como reflexo total atenuada (ATR) ou
espectroscopia de reflexo interna permite a obteno de espectros qualitativos de
slidos, como no caso na borracha natural. Esta tcnica se baseia no fato que um
feixe de luz refletido internamente pela superfcie de um meio transmissor penetra
uma pequena distncia alm da superfcie refletora e retorna ao meio transmissor
durante o processo de reflexo [72]. O ltex e a borracha natural posto em contato
com a superfcie refletora, a luz atravessa alguns micrmetros, produzindo, assim,
um espectro de absoro.
O ltex e as membranas de borracha natural foram caracterizados
por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), marca
Bruker modelo Vector 22, na regio entre 4000-570 cm-1, com resoluo de 2 cm-1e
32 varreduras.
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2.6.2 - Espectroscopia Raman
O fenmeno de Espalhamento Raman foi previsto teoricamente
por Smekal (1923) e descoberto experimentalmente pelo fsico indianoChandrasekhara Venkata Raman, que recebeu o prmio Nobel em 1930, por este
trabalho [73]. O efeito logo despertou o interesse entre os fsicos, que procuravam
explicar o seu mecanismo [74].
Os deslocamentos Raman esto associados a determinados tipos
de ligao da mesma maneira que so as absores no infravermelho. A
espectroscopia Raman mostrou-se particularmente importante no campo das
anlises de hidrocarbonetos [75].
O Efeito Raman um efeito de espalhamento da luz, porm, com
alteraes na freqncia de uma pequena poro da luz espalhada. Esta mudana de
freqncia derivada da combinao entre a radiao incidente e os nveis de
energia vibracional das molculas [76].
A luz, interagindo com uma molcula, pode ser espalhada com
uma freqncia diferente (deslocamento Raman), que corresponde freqncia do
estado vibracional da molcula [73].
O ltex e as membranas de borracha natural foram caracterizados,
no Laboratrio de Filmes Finos e Espectroscopia do Departamento de Fsica,
Qumica e Biologia da FCT UNESP de Presidente Prudente, atravs do
espectrgrafo micro-Raman, marca Renishaw modelo In-Via, sendo o Prof. Dr.
Carlos Jose Leopoldo Constantino responsvel pelo laboratrio.
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Mtodos Experimentais_____________________________________________25
2.6.3 - Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)
Em conseqncia da complexidade de suas estruturas
moleculares ou por causa da pequena diferena entre unidades isomricas, ainvestigao de molculas e macromolculas no estado slido requer boa resoluo
espectral. Os deslocamentos qumicos no espectro de RMN so muito sensveis
estrutura e conformao da molcula, s interaes intermoleculares, troca
qumica, mudanas de conformao e os tempos de relaxao so sensveis
dinmica molecular. Por estes motivos, Ressonncia Magntica Nuclear do estado
slido uma espectroscopia muito til ao estudo de polmeros [77].
Os experimentos de RMN foram realizados em um espectrmetro
VARIAN INOVA de 9.4 T, operando nas freqncias de 100.5 MHz para 13C e 400
MHz para 1H. Em todos os experimentos utilizou-se uma sonda da empresa
equipada com rotao em torno do ngulo mgico de 5 mm modelo Jackobsen. Os
espectros de 1H foram obtidos utilizando excitao por um nico pulso de rdio
freqncia com durao de 4.0 s enquanto que os espectros de 13C foram obtidos
utilizando dois modos de excitao: 1) a tcnica de polarizao cruzada (CPMAS)
com tempo de contato de 1 ms; 2) Excitao por um nico pulso de 3.5 s (ou
polarizao direta DPMAS). O uso destes dois modos de excitao permite separar
as componentes moleculares do sistema baseado em sua mobilidade. Nos espectros
CPMAS o sinal da parte rgida do sistema evidenciado (tipo slido), enquanto que
o sinal de molculas com mobilidade molecular mais alta (tipo lquido) suprimida.
Nos espectros DPMAS e 1H, em princpio, o sinal de todos os segmentos da amostra
deve aparecer. No entanto, como as linhas referentes parte da amostra que se
comporta como lquido (borracha) so muito mais estreitas, elas geralmente se
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Mtodos Experimentais_____________________________________________26
sobrepem. Em outras palavras, nos espectros de DPMAS e 1H os sinais
correspondentes as partes mveis da amostra so privilegiados. Baseado nestas
caractersticas pode-se dizer que os espectros 1H e DPMAS so predominantemente
da borracha (parte com maior mobilidade molecular), enquanto os espectros
CPMAS os segmentos mais rgidos aparecem. O fato de os sinais no espectro
CPMAS serem tpicos de protenas (aminocidos), mostra que as protenas
presentes na amostra se encontram em regies com menor mobilidade molecular.
2.6.4 - Difrao de raios X (DRX)
A Espectroscopia Atmica de raios X est baseada nas medidas
de emisso, absoro, espalhamento, fluorescncia e difrao da radiao
eletromagntica. O espalhamento dos raios X pelo ambiente ordenado de um cristal
resulta na interferncia entre os raios espalhados (construtiva ou destrutiva) porque
as distncias entre os centros espalhadores so da mesma ordem de grandeza que o
comprimento da onda da radiao.
As medidas de difrao de raios X foram realizadas, no Instituto
de Fsica da USP campus de So Carlos, em um difratmetro da marca RIGAkU-
ROTOFLEX modelo RV-200B com comprimento de onda caracterstico do Cu-k,
igual a 1,54 , e com ngulos de varredura (2) entre 5 e 50o, as amostras foram
acondicionadas em superfcie de vidro.
2.6.5 - Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
O microscpio eletrnico de varredura geralmente utilizado
para o estudo de estruturas superficiais ou subsuperficiais de amostras com
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Mtodos Experimentais_____________________________________________27
dimenses relativamente grandes, possui alta profundidade de foco, podendo obter
diferentes relevos da superfcie da amostra simultaneamente em foco. O MEV
tambm produz imagens de alta resoluo, o que garante obter alta ampliao de
detalhes sem perder a nitidez [72].
O princpio de funcionamento do MEV so eltrons gerados por
um dispositivo chamado canho de eltrons, neste canho os eltrons so gerados
pelo aquecimento resistivo de um filamento de tungstnio em forma de V utilizando
uma fonte de alta tenso. A tenso de operao pode variar de 1 kV at 40 kV e,
quanto maior a tenso de acelerao, mais fino se torna o feixe de eltrons, o que
resulta em uma maior resoluo [78], porm nem todo tipo de material resiste a
tenses elevadas.
A preparao da amostra feita sobre suportes metlicos,
utilizando adesivos condutivos, como fitas de carbono ou suspenses coloidais de
prata ou carbono. O revestimento da amostra por um filme condutor tem como
objetivo evitar o acmulo de carga negativa, no caso da mesma ser formada por um
filme no condutor, como no caso de polmeros. A camada de metal deve ser
contnua e fina (menor que 20 nm) para no mascarar a topografia. Geralmente
utiliza-se a tcnica de sputtering para a evaporao do metal, sendo o ouro, liga
ouro-paldio, platina, alumnio e carbono os materiais mais utilizados.
Apesar da relativa facilidade de preparao da amostra, a
investigao de polmeros por MEV requer que sejam considerados problemas
como a sensibilidade irradiao de eltrons e ao baixo contraste da estrutura, uma
vez que estes materiais so constitudos por elementos leves (C, H e O) [72].
Neste trabalho foi utilizado um microscpio eletrnico de
varredura (MEV) marca Shimadzu, modelo SSX-550 pertencente ao Laboratrio de
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Mtodos Experimentais_____________________________________________28
Microscopia da Central Analtica da Universidade Estadual de Maring UEM. As
amostras foram colocadas em suporte de alumnio e fixadas atravs de uma fita de
carbono condutora. Sobre estes filmes foi pulverizada uma fina camada de ouro por
sputteringem um aparelho da marca Shimadzu, modelo IC-50.
2.6.6 - Microscopia de Fora Atmica (AFM)
A microscopia de forca atmica (AFM) uma tcnica que mede
as interaes entre uma ponta de contato e a superfcie a ser analisada. Tais
interaes se do a partir de forcas de Van der Waals, forcas eletrostticas,magnticas e de atrito, dependendo do tipo de material e da distncia entre a ponta e
a amostra. Na escala de fraes de angstrons prevalecem as forcas eletrostticas
(coulombianas) de repulso, enquanto que em nvel de angstrons as forcas de
atrao de Van der Waals passam a predominar. J na escala de 10 a 200 nm
destacam-se as forcas atrativas da tenso de superfcie do fluido, entre 0,1 e 1,0 m
voltam a prevalecer as forcas eletrostticas, podendo ser de atrao ou repulso
nestes casos e, finalmente, para distncias da ordem de 10 m h um amortecimento
pelo filme fluido [79].
A tcnica de AFM fornece, entre outras informaes, a
topografia da superfcie do filme com seus defeitos e ordenamentos moleculares,
possibilitando a medida direta de suas alturas e profundidades, bem como a
rugosidade do filme. As medidas de AFM so feitas localmente, varrendo reas de
centenas de angstrons quadrados e no requer que a superfcie estudada seja
condutora eletricamente, ampliando ainda mais suas possveis aplicaes. As
imagens de AFM foram obtidas no modo tapping, utilizando um equipamento da
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Mtodos Experimentais_____________________________________________29
Digital Instrument modelo Nanoscope IV com ponta de nitrato de silicio e uma
constante de mola de 0,12 N/m.
2.6.7 - TG acoplado com infravermelho (TG/FT-IR)
Esta uma tcnica dinmica na qual a perda de massa de uma
amostra medida continuamente, enquanto a temperatura aumentada a uma taxa
constante. Nestas anlises utilizou-se o equipamento da marca NETZSCH modelo
209, apresentado na Figura 6, na faixa de temperatura ambiente (~25C) at 800C,
utilizando uma massa de aproximadamente 12 mg para o ltex, para suas fases epara as membranas de borracha natural, com uma razo de aquecimento de
10C/minuto, em um cadinho de alumina em atmosfera inerte de nitrognio, com
fluxo de 25 mL/min. Os gases evaporados nos estudos termogravimtricos so
canalizados, por diferena de temperatura, para uma cmara que faz as medidas no
infravermelho simultaneamente.
Figura 6Analisador Temogravimtrico NETZSCH modelo 209.
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Mtodos Experimentais_____________________________________________30
2.6.8 - Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC)
Calorimetria exploratria diferencial (DSC) uma tcnica de
anlise trmica usada para detectar mudanas fsicas ou qumicas que soacompanhadas de ganho ou perda de calor. Quando as substncias so aquecidas,
vrias transformaes fsicas ou qumicas envolvendo absoro (processo
endotrmico) ou evoluo de calor (processo exotrmico) podem ocorrer. A tcnica
de DSC pode ser usada para investigar propriedades trmicas de uma variedade de
materiais, sendo empregada para caracterizar materiais orgnicos, inorgnicos,
biolgicos e polimricos. Dentre as aplicaes pode-se citar: determinao
qualitativa e quantitativa de transies de fase, tais como transio vtrea, fuso,
cristalizao, estudo da cintica de polimerizao, de decomposio e de cura.
O ltex e as membranas de borracha natural foram caracterizados
por calorimetria exploratria diferencial (DSC), marca Netzsch, modelo DSC 204
Phoenix. Para realizao das medidas foi utilizado cadinho de alumnio com tampa
furada no centro, razo de aquecimento de 10C/min num intervalo de temperatura
de 140C a 500C em atmosfera inerte de N2com fluxo de 25 mL/mim. Para as
medidas de DSC foi utilizada uma massa de aproximadamente 8 mg, tanto para o
ltex como para as membranas de borracha natural.
2.6.9 - Anlise Dinmico Mecnico (DMA)
A anlise dinmico mecnica tem sido amplamente usada como
uma tcnica de caracterizao de polmeros atravs de deteco dos processos de
relaxao, tanto microscpico quanto molecular. Essa tcnica fornece informaes a
respeito do mdulo elstico (E), do mdulo de dissipao viscosa (E) e do
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Mtodos Experimentais_____________________________________________31
amortecimento mecnico (tan = E/E) de um material, quando sujeito a uma
solicitao dinmica. Uma das utilizaes mais comuns da tcnica de DMA a
determinao da temperatura de transio vtrea (Tg) que apresenta a grande
vantagem de ser um mtodo direto de medio.
Neste trabalho foi utilizado um DMA marca Netzsch, modelo 204,
no modo tenso, utilizando ar como atmosfera, freqncia de 10 Hz, razo de
aquecimento de 5C/min num intervalo de temperatura de 100 a 180C.
2.6.10 - Mtodo de Bradford
Para a realizao do mtodo de Bradford utilizou-se 40 mg de BG-
250 que foi dissolvido em 20 mL de etanol absoluto. Em seguida adicionou-se 40
mL de acido fosfrico 85% agitando com basto de vidro. Finalizando, adicionou-se
gua deionizada para completar 100 mL de soluo em balo volumtrico. Esta
soluo foi deixada em repouso e sob abrigo da luz por 24 h, sendo aps este tempo
filtrada utilizando papel de filtro. No momento da realizao das medidas foi feita
uma diluio (1:4, v/v) da soluo em gua. Uma curva padro para protenas foi
realizada utilizando-se uma soluo diluda de protenas de Albumina de soro
bovino (BSA) na concentrao de 1 mg/mL. Foi dissolvido 0,25 g de BSA para 50
mL da seguinte soluo: 0,5 mL de soluo tampo de fosfato de sdio 0,1 M e 49,5
mL de gua deionizada. Cada 1 mL desta soluo contm 5 mg de protenas. Esta
soluo espuma muito, por este motivo no deve ser agitada fortemente.
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Resultados e Discusso_____________________________________________32
CAPTULO 3 - RESULTADOS E DISCUSSO
Neste item sero apresentados os resultados de caracterizao do
ltex in natura, das fases do ltex centrifugado e das membranas de borracha natural
tratadas termicamente a 60, 85 e 120C liofilizadas, utilizando as tcnicas de FT-IR
modo ATR, TG acoplado ao FT-IR, DSC e o mtodo de Bradford para quantificar
as protenas presentes na fase intermediaria, resultado da centrifugao do ltex.
3.1 - Espectroscopia no infravermelho (FT-IR) no modo ATR
A Figura 7 apresenta os espectros de FT-IR obtidos das amostras
de Ltex, F1, F2, F3 e das membranas tratadas termicamente a 60, 85 e 120oC,
liofilizados, na regio de 4000 a 600 cm-1. Nota-se duas regies distintas contendo
vrios picos, a primeira entre 4000 e 2700 cm -1e a segunda regio entre 1800 e 600
cm-1, para todas as amostras.
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Resultados e Discusso_____________________________________________33
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
BN 120oC
Nmero de Onda (cm-1)
BN 85oC
Absorbncia
BN 60oC
F3
F2
F1
2911
1070
Ltex
2960
3285
3036
2855
2724
1738
1643
1588
15441450
1371
1305
1240
1128
837
Figura 7 -Espectros na regio do infravermelho das amostras de ltex, F1, F2, F3, e dasmembranas de borracha natural tratadas termicamente a 60, 85 e 120C,liofilizados.
As bandas de absoro relativas aos principais modos vibracionais
do cis-1,4-poli-isopreno esto na Tabela 2. Nota-se na F2 a ausncia de vrios picos
referentes ao isopreno, pois no processo de centrifugao as partculas de borracha
migram para o topo, deixando a frao do soro (F2) extremamente lmpida contendo
diferentes espcies qumicas como carboidratos, eletrlitos, protenas e
aminocidos. Todas as amostras apresentaram o pico em 3285 cm-1 referente ao
estiramento simtrico de ligaes N-H formando ligao de hidrognio em
protenas, sendo que na F2 este pico possui maior absorbncia em relao aos picos
em 3036, 2960 e 2911 cm-1, pois no soro a quantidade de partculas de borracha
muito reduzida.
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Resultados e Discusso_____________________________________________34
Tabela 2 - Principais modos vibracionais do cis 1,4-poli-isopreno.
Experimental Literatura [80] Atribuio [81, 82]3036 3036 s(=CH)2960 2962 sC-H no CH3 [83]2911 2912 sCH no CH3
2855 2854 sC-H no CH2 [84]2724 2726 CH2C=(CH3) [85]1450 1450 CH21371 1375 sCH31305 1309 CH2 twist1240 1244 CH2 twist
1128
1125 ou 1128
[146,158]CH bending no plano ou (CC) cis ou CH2
wag837 837 C = C H [86]
A segunda regio do espectro, de 1800 a 600 cm-1, de maior
interesse, pois contm picos caractersticos que permitem avaliar a presena de
grupos funcionais devido a grupos carbonlicos como steres, aldedos, cetonas,
cidos carboxlicos e amidas. A Figura 8 apresenta uma ampliao desta regio
espectral, para melhor visualizao e comparao dos picos.
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Resultados e Discusso_____________________________________________35
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Nmero de Onda (cm-1)
BN 120oC
BN 85oC
BN 60oC
F3
F2
F1
Ltex
Absorbncia
1070
1738
1643
1588
1544
1450
1371
1305
1240
1128
837
Figura 8Ampliao dos espectros na regio do infravermelho das amostras de ltex, F1,
F2, F3, e das membranas de borracha natural tratadas termicamente a 60, 85
e 120C, liofilizados.
Na regio de 1800-1500 cm-1, os espectros apresentam picos de
absoro em 1738 cm-1, de baixa absorbncia, relativo ao estiramento simtrico de
C=O em ster. A absoro em 1643 cm-1sendo um ombro para as amostras de ltex,
F2 e BN 85oC e um pico para F1, F3, BN 60oC e BN 120oC caracterstica, de
amida primria, em estiramento de C=O em ligao de hidrognio com gua. Em
1588 cm-1h um pico caracterstico de estiramento assimtrico de C=O de COO-
em protenas na F2, sendo um ombro para as amostras de BN 60oC e BN 85oC,
estando ausente nas F1, F3 e na BN 120oC. O pico em 1544 cm-1, caracterstico de
amida secundria, apresentou-se nas amostras de F3 e BN 120oC, apresentando para
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Resultados e Discusso_____________________________________________36
as outras amostras como apenas um ombro. Esta regio entre 1800-1500 cm-1
apresentou-se muito semelhante entre F3 e BN 120oC.
A Tabela 3 mostra um grupo de freqncias referentes aos grupos
funcionais presentes na borracha que no so atribudos ao cis1,4-poli-isopreno [6].
Tabela 3 Atribuies das bandas nos espectros de FT-IR para grupos funcionaisobservados nas amostras de ltex, F1, F2, F3, e das membranas de borracha
natural tratadas termicamente a 60, 85 e 120C, liofilizados.
Freqncia
Experimental
Literatura
[87]
Atribuio
[88, 89,90]
3500-3200 34003200-3400
sNH livre
s OH (ligao de hidrognio)
3285 3280-3300 sNH formando ligao de hidrognio
1643 1640 Amida primaria C=O em ligao H comgua
1630 NH ligado a C=O em ligao H
1588 1565-1585 assC=O de COO-de protenas
1544 1530-1560 Amida secundria (CN)+ (NH)
1259 assP=O em (PO2-) de fosfolipdio [91]
1070 1176-10801080-1040
CO de ter aliftico
CO de ter
A regio entre 1700 e 1000 cm-1apresenta as maiores diferenas
entre as amostras, portanto esta regio ser de grande interesse para nosso estudo. A
amostra F2 foi que apresentou as maiores discrepncias com a amostra BN 120oC, o
que evidencia que a parte protica que est agindo como indutor de angiognese.
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Resultados e Discusso_____________________________________________37
3.2 - Espectroscopia Raman
A Figura 9 apresenta os espectros Raman obtidos das amostras de
Ltex, F1, F2, F3 e das membranas tratadas termicamente a 60, 85 e 120
o
C,liofilizadas, na regio de 4000 a 400 cm-1. As amostras de F1, F3, BN 85oC e BN
120oC apresentaram o fenmeno de fluorescncia, encobrindo assim o sinal dos
picos.
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
BN 60oC
BN 85oC
Intensidade
Nmero de Onda (cm-1)
F3
F2
F1
998
1371
1440 1668
30302
715 2
913
BN 120oC
Ltex
Figura 9 Espectros Raman das amostras de Ltex, F1, F2, F3 e das membranas tratadastermicamente a 60, 85 e 120
oC, liofilizados.
As amostras de ltex, F1, BN 60oC apresentam alguns picos
caractersticos ao isopreno, apesar de tambm apresentar o fenmeno de
fluorescncia.
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Resultados e Discusso_____________________________________________38
Em 998 cm-1observa-se um pico caracterstico de ligaes =C-H,
j em 1371 cm-1, tem-se a deformao de grupos CH3e em 1440 cm-1nota-se um
pico referente a ligaes do tipo H-C=O. A vibrao do C=C est particularmente
desobstruda e sensvel a seu ambiente em uma maneira similar vibrao do
C=O no infravermelho. As vibraes da cadeia tipo cis, do C=C, podem ser vistas
em 1668 cm-1.As vibraes entre 2715 e 3030 cm-1corresponde ao estiramento CH,
sendo pertencente ao grupo CH2e CH3 [92].
3.3 - Ressonncia magntica nuclear (RMN)
A Figura 10 apresenta os espectros de RMN de 13C DP/MAS das
amostras F1, F3 e das membranas de borracha natural tratadas termicamente a 60,
85 e 120oC. Esses espectros so tpicos da estrutura do isopreno em estado slido,
com duas regies distintas, sendo uma entre 140 e 120 ppm e outra entre 35 e 20
ppm.
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Resultados e Discusso_____________________________________________39
140 120 100 80 60 40 20 0
BN 1200C
BN 850C
F3
BN 600C
dc
a e
F1
b
ppm
Figura 10 Espectro de RMN 13C DP/MAS das amostras F1, F3 e das membranastratadas a 60, 85 e 120
oC.
Os espectros obtidos, em todas as amostras, mostraram cinco
sinais caractersticos dos dois carbonos etilnicos, dos dois grupos metilnicos e do
grupo metil da estrutura cis-1,4-poli-isopreno, cuja estrutura qumica est
representada na Figura 10. Os sinais em 133,5 e 124,1 ppm so atribudos aos
carbonos (c) e (d) da dupla ligao, respectivamente. O sinal em 31,3 ppm
atribudo ao carbono metilnico (a), o sinal em 25,3 ppm atribudo ao carbono (e)
e o sinal em 21,20 ppm ao carbono (b) do grupo metil [93,94,95,96].
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Resultados e Discusso_____________________________________________40
Pela anlise de RMN de 13C CP/MAS, Figura 11, foi detectado
um sinal na regio de 172 ppm, certamente das carboxilas da cadeia lateral, sinais
relacionados a grupos C=C em 134,05 e 123,7 ppm dos carbonos (c) e (d),
respectivamente.
240 210 180 150 120 90 60 30 0
BN 1200C
BN 85 0C
BN 60 0C
F3
F2
ppm
Figura 11 -Espectro de RMN 13C CP/MAS das amostras F2, F3 e das membranas tratadasa 60, 85 e 120
oC.
Foram detectados sinais, com maior relevncia nas amostras F2 e
F3, referentes a grupos C-O em 83,7 ppm; CH-O em 79,7 ppm, na faixa de 7570ppm relacionados a grupos CH-O, na faixa de 6755 ppm a grupos CH2-, sinais
estes derivados de grupos tipos acares como, monossacardeos, dissacardeos e
polissacardeos. Ainda foram detectados sinais na faixa de 35-12 ppm,
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Resultados e Discusso_____________________________________________41
correspondentes a regio de CH2, CH, CH3 de cadeias alifticas dos carbonos
(a),(e),(b), que podem ser constituintes tanto de ramificaes quanto da cadeia.
Os espectros de RMN 1H, Figura 12, tambm apresentaram duas
regies bem distintas, sendo uma de 4-6 ppm e outra de 0,5-2 ppm.
6 5 4 3 2 1 0
BN 120 0C
BN 85 0C
BN 60 0C
F3
c d
F1
ppm
a e b
Figura 12 -Espectro de RMN 1H das amostras F1, F3 e das membranas tratadas a 60, 85
e 120oC.
O deslocamento qumico de 4-6 ppm est associado a prtons de
C=C, j a segunda regio de deslocamento entre 0,5-2 ppm est associada a prtons
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Resultados e Discusso_____________________________________________42
do grupo metlico (-CH3) [95]. Os sinais de prton metlico (-CH3) do 1,4- cis-
isopreno foram observados em 1,75 e 1,61 ppm, nas membranas tratadas a 60 e
120oC e em 1,55 ppm nas amostras F1, F3 e na membrana tratada a 85oC.
O espectro da membrana tratada termicamente a 85o
C
apresentou-se muito diferente das outras membranas, tal fato pode estar associado
as condies experimentais no qual foi realizada a coleta dos dados, onde pode ser
detectado somente a parte isoprnica que compe a membrana.
3.4 - Difrao de raios X (DRX)
A tcnica de difrao de raios X foi utilizada nas fraes F2 e de
Fundo, conforme a Figura 13 com o intuito de verificar a presena de compostos
cristalinos, como a presena de metais ou estruturas com certa organizao.
10 20 30 40 50
F2Intensidade(u.a.)
2(graus)
F3
Figura 13 Difrao de raios X das fraes F2 e F3, liofilizadas.
No difratograma da amostra F2 temos a ausncia de picos
difratados que caracterizariam uma fase cristalina, observou-se apenas um largo
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pico de espalhamento centrado em 2=19o atribudo a difrao de raios x nas
regies amorfas das amostras, portanto a frao F2 no apresenta estrutura cristalina
bem definida. J na frao F3 o difratograma apresenta alguns picos de difrao
caractersticos de material com certa estrutura cristalina, tais picos podem estar
associados a ctions metlicos que compe esta fase, pois Ca, Zn e Rb formam o
segundo grupo mais abundante de elementos, enquanto que as concentraes de
Mn, Fe, Ni, Cu e Br so muito baixas [6].
3.5 - Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
A Figura 14 apresenta a micrografia com ampliao de 8000
vezes da membrana de borracha natural tratada termicamente a 60C.
Figura 14 Micrografia da membrana de borracha natural tratada a 60C.
Nota-se nesta micrografia a presena partculas de borracha, que
coagularam mais rapidamente, durante a evaporao de subprodutos do ltex,
permitindo assim maior presena de fosfolipdios e protenas no ligados por
partculas de borracha.
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Na Figura 15 tem-se a micrografia da membrana de borracha
natural tratada termicamente a 85C. Nota-se maior homogeneidade nesta
membrana, no apresentando grandes partculas de borracha natural, como no caso
da membrana tratada a 60C. Vale destacar que membranas tratadas a temperatura
de 85 C esto no limiar para agir como indutores de angiognese, onde
possivelmente as partculas de borracha podem ligar-se com um maior nmero de
fosfolipdios e protenas no permitindo que estes grupos atuem na angiognese.
Figura 15 -Micrografia da membrana de borracha natural tratada a 85C.
Na Figura 16 tem-se a micrografia da membrana de borracha
natural tratada termicamente a 120C.
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Figura 16 -Micrografia da membrana de borracha natural tratada a 120C
Nesta micrografia possvel notar que houve um processo de
evaporao muito rpido de gua, mas levando juntamente subprodutos do ltex,
formando regies bem caractersticas. A evaporao destes subprodutos pode
diminuir a concentrao de substncias de grande importncia no processo de
induo de angiognese, impossibilitando o uso desta membrana como biomaterial
[97].
3.6 - Microscopia de Fora Atmica (AFM)
A morfologia das membranas, tratadas termicamente a 60, 85 e
120oC, foram estudadas por microscopia de fora atmica (AFM), como mostra a
Figura 17. As amostras dos filmes micrografados tem dimenses de 2,5 m x 2,5
m. Nota-se grande diferena entre a morfologia das membranas, onde a membrana
tratada a 60oC apresentou maior quantidade poros, tal fato pode estar associado a
evaporao lenta dos componentes no borracha. Estudos realizados na