CRESCIMENTOMICROBIANO

INTRODUÇÃO

Metabolismo microbiano = energia (ATP)

síntese de novas estruturas

tamanho celular

crescimento divisões

Meios de cultura adequados ...

O CRESCIMENTO INDIVIDUAL

Ciclo que termina com a divisão da célula, gerando duas células-filhas independentes e autônomas

Cromossomo completo e cópias de todas as outras macromoléculas, monômeros, moléculas e íons inorgânicos

Divisão assexuada = FISSÃO BINÁRIA (bactérias)

Duração: f(fatores genéticos e ambientais)

Menor tempo: 20min (Escherichia coli) – cond. ideais

CRESCIMENTO POPULACIONAL

Prática: inicia com a inoculação de indivíduos no meio

Sistema semi-isolado (trocas gasosas com o ambiente)

Crescimento – divisão em 4 fases (curva de crescimento)

a = fase lag

b = fase log ou exponencial

c = fase estacionária

d = fase de declínio (morte)

no ou massa

A FASE LAG• Alteração do meio – limitado (?) para nutritivo e novo

• Mudanças metabólicas – síntese de “novas” enzimas

• Etapa de crescimento individual (síntese de RNA, proteínas, polissacarídeos, fosfolipídeos, etc)

• Não há replicação de DNA !

• Aumento da massa celular mas NÃO do número de indivíduos

• Final da fase:Células estruturadas, início da síntese de DNA

aumento do número de células

FASE EXPONENCIAL (FASE LOG)

Divisão celular (replicação do cromossomo) em ritmo acelerado

FASE EXPONENCIAL (FASE LOG)

Aumento da concentração de RNA e proteínas

Tempo de geração (TG) = tempo para duplicação

Síntese de DNA = até 2/3 do TG

Multiplicação em forma exponencial:

Número de indivíduos e massa da cultura dobram a cada geração:

x = xo.2n

logx = logxo + (0,301/g).t

x = no ou massa final

xo = no ou massa inicial

n = no de gerações

g = tempo de geração

t = tempo decorrido

Fase exponencial de crescimento, representada em escala semilog. O tempo de geração é o “g”.

Exemplo de cálculo:

Partindo de uma cultura em fase exponencial com 108

bactérias por mL, deseja-se preparar outra cultura que tenha o mesmo número de células após 16 horas. O tempo de geração é de 2 horas.

n = t/g = 16/2 = 8 (número de gerações)

Densidade inicial a ser usada na segunda cultura:

x = xo.2n

108 = xo.28 = xo = 3,9 x 105 células por mL

FASE ESTACIONÁRIA• Início: condições inadequadas do meio para o

crescimento populacional.

acúmulo de produtos tóxicos (ácidos orgânicos)

• Degradação de reservas celulares e estruturas (!)

• Redução do número de ribossomos ...

• CARÊNCIA NUTRICIONAL = alterações metabólicas:

• Tamanho: células < (sobrevivência), massa =

• Composição química e estrutura: membrana menos permeável, > resistência à autólise, à T, pressão osmótica (resistência - formação de esporos) ...

FASE DE DECLÍNIO

• Se o meio se mantiver inalterado = MORTE de células

• Impossibilidade de produção de energia (vida)

• Elevada produção de enzimas autolíticas

ruptura da parede celular

CRESCIMENTO CONTÍNUO E DESCONTÍNUO

• Culturas descontínuas: inoculação em um meio de cultura, desenvolvimento das 4 fases até a exaustão dos nutrientes.

• Culturas contínuas: (quimiostatos)

acréscimo de meio de cultura constantemente na fase exponencial, para evitar a exaustão de nutrientes.

retirada de células (meio de cultura “usado”)

Necessidade de manter pH, T, agitação, aeração, etc.

Usos:

indústrias: para obtenção de certos produtoslaboratórios de pesquisa: estabilidade genética

Quimiostato

MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam o número de células:

Métodos diretos:

1) Contagem ao microscópio: lâminas marcadas e com volume conhecido. Método simples e rápido, mas impreciso, sem distinção de células mortas e vivas.

2) Câmaras eletrônicas: contagem em canal estreito. Método rápido e impreciso (agrupamentos...)

Métodos indiretos:

Unidades formadoras de colônias (UFC): Inóculo(suspensão diluída) em meio sólido, para formar colônias isoladas. Método demorado, somente organismos aeróbios e viáveis!

MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam a massa de células, que é

proporcional à população:

Métodos diretos:

1) Massa seca: suspensão é centrifugada ou filtrada, secagem posterior e pesagem. Método simples e rápido, mas não distingue vivo do morto.

2) Proteína celular: suspensão centrifugada, precipitada com álcool ou ácido e determinação do conteúdo protéico. Método rápido, mas não separa célula morta daquela viva.

3) Dosagem de ATP: distingue células vivas. Método caro e sensível. Extração de ATP e quantificado por reação luminosa, cuja intensidade é proporcional à quantidade de ATP (células viáveis).

MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam a massa de células, que é

proporcional à população:

Métodos indiretos:

Turbidez, absorbância ou densidade óptica:A cultura recebe um feixe luminoso (colorímetros e espectrofotômetros) e, dentro de certos limites, a quantidade de luz transmitida é diretamente proporcional à massa microbiana.

Método muito usado (rápido e fácil), mas não separa células vivas de mortas e sofre interferência de substâncias que possam absorver luz (pigmentos ou muco extracelular)

MEDIDAS DO CRESCIMENTOMétodos que determinam a massa de células, que é

proporcional à população:

Métodos indiretos:

Turbidez, absorbância ou densidade óptica:A cultura recebe um feixe luminoso (colorímetros e espectrofotômetros) e, dentro de certos limites, a quantidade de luz transmitida é diretamente proporcional à massa microbiana.

Método muito usado (rápido e fácil), mas não separa células vivas de mortas e sofre interferência de substâncias que possam absorver luz (pigmentos ou muco extracelular)